Virkninger af Glyeosider of Cistanche på indlæring af kognition og synaptisk plasticitet hos søvnmangelmodelrotter

ABSTRAKT

Mål: 'At undersøge, omglycosider af cistanchekan forbedrelæring og kognitiv funktion af søvnmangelmodel rotter vedregulering af synaptisk plasticitet. Metoder: Halvtreds Wistar-hanrotter blev tilfældigt opdelt i blank kontrolgruppe (kontrol), platformkontrolgruppe (PC), modelgruppe (model),glycosider af cistanche-gruppen(GC'er) og estazolamgruppe (Est). Søvnmangelmodellen for rotter blev udarbejdet ved en modificeret multi-platform vandmiljømetode. Morris vandlabyrint og åben felttest blev brugt til at påvise rotterrumlig kognitiv funktion aog følelsesmæssige ændringer. Nissl-farvning blev brugt til at observere ændringerne imorfologi og mængde af nervecelleri det hippocampale CAl-område hos rotter. Western blot og R'T - PCl blev brugt til at detektere ekspressionsniveauerne af synaptophysin(SYN), postsynaptisk membrantæt stof 95 (PSD - 95) og hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF). Resultater: Resultater fra Morris vandlabyrint viste, at sammenlignet med kontrolgruppenindlæring og kognitive evneraf rotter i modelgruppen var signifikant reduceret (P<0. 05 ), and thelærings- og hukommelsesfunktion hos rottervar forbedret GCs behandling (P<0. 05). The results of the open field test showed that compared with the Control group, the movement distance and standing times of the Model group were significantly increased ( P <0. 05 ), the resting time was significantly shortened( P <0.05), and the anxiety was increased, while after GCs treatment, the movement distance and standing times decreased ( P <0. 05), the resting time increased ( P<0. 05), and the anxiety was improved. The results of Western blot and R'T' - PCR showed that the protein and gene expression levels of BDNF, SYN, and PSD -95 in the Model group were significantly decreased ( P <0. 05), while after treatment with GCs, the expression levels of BDNF, SYN and PSD -95 were significantly up-regulated ( P <0.05).

Konklusion: Glykosider af cistanchekan påvirke synaptisk plasticitet ved at regulere ekspressionen af ​​synaptisk-relaterede markører og derved forbedre indlæringen og kognitiv funktion af søvnmangelmodelrotter.

NØGLEORDGlykosider af cistanche; Hippocampus; Søvnmangel; Læring og hukommelse; Angst; Synaptisk plasticitet

HØJT NIVEAU GLYKOSIDER AF CISTANCHE TIL SALG

Søvnforstyrrelse (SD)er enfunktionel søvnforstyrrelseforårsaget af en række komplekse faktorer såsom søvnløshed, hyppige drømme og let opvågning. Forekomsten af ​​SD er gradvist steget i de senere år. Relaterede undersøgelser har rapporteret, at SD kan forårsagehjerte-kar-sygdomme, metabolisk dysfunktion, immunsygdommeog degenerative sygdomme i centralnervesystemet såsom Alzheimers sygdom [1]. SD kan forårsage oxidativ skade på hippocampus neuroner, forårsage kognitiv dysfunktion og producere humørsvingninger såsom angst og depression [2]. Cistanche deserticola er et dyrebart kinesisk medicinsk materiale, der kan bruges som medicin og mad. Det har virkningerne af tonificering af nyrerne og genopfyldning af qi, fugter tarmene, fremmer afføring og styrker yang. Hovedekstraktet af Cistanche deserticola, glycosider of cistanche (GC'er), har antioxidant, anti-apoptotisk, leverbeskyttende og neurobeskyttende virkning [3]. Vores tidligere forskning viste, at GC'er kan forbedre indlæringen og kognitiv funktion af SAMP8 mus ved at spille en antioxidant og anti-apoptotisk rolle [4]. Relaterede undersøgelser har vist, at kognitiv dysfunktion forårsaget af SD er tæt forbundet med synaptisk plasticitet [5]. Der er dog få rapporter om den mekanisme, hvormed GC'er regulerer synaptisk plasticitet og forbedrer indlærings- og hukommelsessvækkelse og kognitiv tilbagegang hos rotter induceret af søvnmangel. Derfor sigter denne undersøgelse på at undersøge, om GC'er påvirker synaptisk plasticitet ved at regulere ekspressionen af ​​synaptisk-relaterede markører, og derved forbedre læring og kognitiv funktion af rotter i søvnmangelmodellen, og give nye behandlingsideer og planer for behandling af læring og kognitiv svækkelse forårsaget af søvnforstyrrelser med GC'er.

1 Materialer og metoder

1. 1 Forsøgsdyr

Wistar-hanrotter i alderen 6 til 8 uger, der vejer 280 til 300 g, blev købt fra Beijing Sibeifu med en dyreproduktionslicens [SCXK (Beijing) 2019-0010]. Alle dyr blev holdt i dyreforsøgscentret i Baotou Medical College under følgende betingelser: temperatur (24 ± 1) grad, fugtighed 50 % til 55 %, 12 timer lyst og 12 timer mørkt og ingen begrænsninger for mad og vand. Dette eksperiment blev godkendt af skolens etiske udvalg [Baoyi Lunshen 2022 nr. (63)].

1. 2 Hovedreagenser og instrumenter

Samlede glycosider af Cistanche deserticola blev købt fra Shaanxi Baoji Cosmeceuticals Development Co., Ltd. (batchnummer: KSM20220609011); Estazolam-tabletter blev købt fra CSPC Pharmaceutical Group Ouyi Pharmaceutical (batchnummer: 044220343); proteinpåfyldningsbuffer (P1015), RIPA-lysebuffer (R0010), kemiluminescerende opløsning (PE0010), etc. blev alle købt fra Beijing Solebao; postsynaptisk densitet substans 95 (PSD-95) antistof (AB192757), synaptophysin (SYN) antistof (ab32127), købt fra Abcam, USA; hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF) (48503-2), -actin (52901), købt fra SAB, USA; gede-anti-kanin IgG sekundært antistof (SA00001-20), købt fra Proteintech, USA; rottemelatonin (MT), ELISA-kit (MM-0657R1), købt fra Jiangsu Enzyme Immunity Industry Co., Ltd. Paraffinskærer (Leica, Tyskland); optisk mikroskop (Leica, Tyskland); Morris vandlabyrint, åbent felt testboks (Shanghai Xinruan); lodret elektroforese instrument

(Beijing Liuyi Company); affarvning shaker (Beijing Liuyi Company); protein billeddannelse analyse system (Shanghai Tanon Technology); fluorescens kvantitativt PCR-instrument (Xi'an Tianlong Technology Co., Ltd.).

1. 3 Eksperimentelle metoder

1. 3. 1 Dyregruppering og lægemiddeladministration

50 Wistar-hanrotter blev tilfældigt opdelt i blank kontrolgruppe (kontrolgruppe), platformkontrolgruppe (platformskontrol, pc-gruppe), modelgruppe (modelgruppe), totale glycosider fra Cistanche deserticola-gruppe (GCs-gruppe) , 50 mg/kg) og estazola-gruppe (Est-gruppe, 0,54 mg/kg), med 10 rotter i hver gruppe. Kontrolgruppen og PC-gruppen fik 0,9% saltvand via sonde. Alle grupper blev gavaget kl. 7 hver dag efter at modelleringen begyndte, og sonden varede i 21 dage.

1. 3. 2. Udarbejdelse af søvnmangel-dyremodel

Søvnmangelmodellen blev etableret ved hjælp af den modificerede multi-platform vandmiljømetode [6]. Det eksperimentelle udstyr var en 130 cm x 50 cm x 45 cm rektangulær polyethylenharpiksvandtank. En lille platform med en diameter på 5 cm og en højde på 20 cm blev placeret i vandtanken. PC-gruppens platform havde en diameter på 10 cm og en højde på 20 cm. Vandbeholderen blev fyldt med vand til en dybde på ca. 18 cm, og vandtemperaturen blev holdt på (20 ± 1) grad. En uge før forsøgets start blev rotterne anbragt i søvndeprivationsboksen hver dag i 60 minutter for at sætte sig ind i miljøet. Efter at modellen var etableret, bortset fra kontrolgruppen, blev rotterne fra hver gruppe placeret på den lille platform til tiden fra kl. 8.00 til kl. 20.00 hver dag for søvnmangel i 21 på hinanden følgende dage. Alle rotter fik lov til at spise og drikke frit og bevæge sig frit på platformen, med 12 timers lys og mørke vekslen hver dag.

1.3.3 Morris vandlabyrinteksperiment

Morris vandlabyrint blev opdelt i 4 områder, fyldt med vand, og platformen blev placeret i 4. kvadrant. Vandoverfladen var ca. 2 cm over platformen. Fødevaregodkendt spiseligt melanin blev tilsat til vandet, og vandtemperaturen blev holdt på (25 ± 1) grad. (1) Positioneringsnavigationseksperiment: Centrum af hvert område blev valgt, og rotterne blev forsigtigt placeret i vandet. De fik lov til at udforske frit. Den tid, det tog for rotterne at finde målplatformen inden for 60 sekunder, blev registreret. Rotter, der ikke fandt platformen, blev ført til platformen og blev i 20 sekunder. Træningen blev fortsat i 5 dage. (2) Rumlig udforskningstest: På den 6. dag blev platformen fjernet, og rotterne blev placeret i vandet fra midten af ​​2. kvadrant mod væggen. Antallet af gange, rotterne passerede platformen inden for 120 s, og den tid, de opholdt sig i 4. kvadrant, blev registreret.

1.3. 4 Åbent felteksperiment

Der blev brugt en 100 cm × 100 cm × 50 cm forsøgskasse, og bunden af ​​kassen blev opdelt i 9 gitre. Hver gruppe rotter blev anbragt i det åbne felt-forsøgsrum på forhånd for at tilpasse sig indendørsmiljøet i 60 min. I begyndelsen af ​​eksperimentet blev testrotterne på skift placeret i de faste hjørner af den åbne feltforsøgskasse, og antallet af ståtider, bevægelsesafstand og statisk tid for rotterne inden for 5 minutter blev registreret ved hjælp af adfærdsanalysesoftware . Det krævedes, at omgivelserne var stille under forsøget, og forsøgsanordningen blev tørret af med henholdsvis rent vand og alkohol mellem to forsøg for at undgå, at lugten af ​​den forrige rotte påvirkede den næste rottes adfærdsbedømmelse.

1. 3. 5 Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA)

Påvisning af serum-MT-niveauer hos rotter Rotter blev bedøvet ved intraperitoneal injektion, og 5 ml blod blev opsamlet fra den abdominale aorta. Efter at have ventet i 30 minutter ved stuetemperatur blev blodet centrifugeret for at opnå serum. 40 μL prøvefortynder blev tilsat til hver brønd, og derefter blev 10 μL af prøven, der skulle testes, tilsat. Efter forsegling med forseglingsfilmen inkuberes ved 37 grader i 30 min. Vask 5 gange, tilsæt 50 μL enzymmærkningsopløsning, og inkuber ved 37 grader i 30 minutter efter forsegling med forseglingsfilmen. Vask 5 gange, tilsæt derefter den farvefremkaldende opløsning og reaktionsstopopløsningen efter tur. OD-værdien af ​​hver brønd blev målt ved hjælp af enzymmærkningsinstrumentet ved en bølgelængde på 450 nm.

１. ３. ６ Nissl-farvning

Tre rotter blev taget fra hver gruppe, og hjernevævet blev fjernet ved halshugning. Hjernevævet blev fikseret med 4% polymethylmethacrylatopløsning, og vævet blev dehydreret, nedsænket i voksopløsning og indlejret, og vævet blev skåret i skiver ved konventionelle metoder. Skiverne blev holdt med en tykkelse på 5 μm, skyllet med PBS, farvet med 0. 1 % toluidinblå for 0. 5 timer, differentieret med 95 % alkohol, dehydreret med 100 % alkohol, gennemsigtigt med xylen og forseglet med neutral gummi. Ændringerne i morfologien og antallet af neuroner i CA1-regionen af ​​rottehippocampus blev observeret under et mikroskop, og billeder blev indsamlet.

１. ３. 7 Western blot eksperiment

Fire rotter blev udvalgt fra hver gruppe, og hippocampus blev isoleret ved halshugning. Hippocampusvævet blev blandet med RIP A lysisbuffer i et isbadsmiljø og centrifugeret for at opnå supernatanten. Proteinkoncentrationen blev påvist ved BCA-metoden. 20 ug protein blev tilsat proteinpåfyldningsbuffer til elektroforese. Efter at proteinelektroforesen var afsluttet, blev membranen overført ved 300 mA konstant flow, blokeret med 5% skummetmælkspulver, det primære antistof blev inkuberet ved 4 grader natten over, og det sekundære antistof blev inkuberet ved stuetemperatur i 2 timer. Efter at farveudviklingsopløsningen var brugt, blev kemiluminescensbilleddannelsesanalysesystemet brugt til statistisk analyse af proteinbånd.

1. 3. 8 RT-PCR eksperiment

Tre rotter blev udvalgt fra hver gruppe for at fremstille hippocampusvævshomogenat. Det totale RNA i vævsvæsken blev ekstraheret ved Trizol-metoden, og koncentrationen blev målt. Et fastende cDNA-syntese-kit blev brugt til revers transkription, og en fluorescens kvantitativ amplifikationsreaktion blev brugt til at detektere det relative ekspressionsniveau af synaptisk-relateret protein-mRNA under anvendelse af et fluorescens kvantitativt kit. Resultaterne blev analyseret under anvendelse af 2-ΔΔCt, og primersekvenserne er vist i tabel 1.

1.4 Statistiske metoder

Dataresultaterne, der var i overensstemmelse med normalfordelingen, blev udtrykt som middel ± standardafvigelse (x ± s), og statistisk analyse blev udført ved hjælp af GraphPad Prism 9.5-software. Enkeltfaktorvariansanalyse blev brugt til sammenligning mellem flere prøver, og P < 0.05 indikerede, at forskellen var statistisk signifikant.