Virkninger af fire kinesiske urteekstrakter på lægemiddelfølsomme og multiresistente småcellede lungekarcinomceller

David SadavaJulie Ahn Mei Zhan Mei-Lin PangJane DingSusan E. Kane

Abstrakt formål:Vi undersøgte farmakologien, cellebiologien og molekylærbiologien af ​​småcellede lungekarcinomceller behandlet med fire ekstrakter afkinesisk urtemedicin. Mange kræftpatienter tager disse lægemidler, men deres virkning på celleniveau er stort set ukendt. Vi var især interesserede i virkningerne på lægemiddelresistente celler, da resistens er et væsentligt klinisk problem ilungekræftr. Metoder: Lægemiddelfølsomme (H69), multiresistente (H69VP) og normale lungeepitelceller (BEAS-2) blev udsat for ekstrakter fra to planter, der blev brugt i kinesisk urtemedicin tillungekræft: Glycyrrhiza glabra (GLYC) og Olenandria diffusa (OLEN) og til ekstrakter af to kommercielt tilgængelige kombinationer afkinesisk urtemedicin, SPES (15 urter) og PC-SPES (8 urter). Cytotoksicitet blev målt i form af cellevækstinhibering (IC50). Kinetikken af ​​DNA-fragmentering efter eksponering for urteekstrakterne blev målt ved BudR-mærkning efterfulgt af ELISA. Apoptose blev målt ved TUNEL-assayet efterfulgt af flowcytometri. Ekspression af apoptose- og cellecyklus-relaterede gener blev målt ved omvendt transkription af mRNA efterfulgt af filterhybridisering til arrays af prober og påvisning ved kemiluminescens. Resultater: I hvert tilfælde var de fire urteekstrakter lige så cytotoksiske over for H69 og H69VP og mindre cytotoksiske over for BEAS-2. Alle fire ekstrakter inducerede DNA-fragmentering i lungekarcinomcellerne. Kinetikken viste DNA-fragmenter frigivet til mediet (en indikation på nekrose) i GLYC-eksponerede kulturer, men inde i cellerne (en indikation på apoptose) i OLEN-, SPES- og PC-SPES-eksponerede kulturer. TUNEL-analyse bekræftede, at eksponering for de tre sidstnævnte ekstrakter, men ikke for GLYC, førte til apoptose. Sammenlignet med ubehandlede og GLYC-behandlede celler viste H69- og H69VP-celler behandlet med OLEN, SPES og PC-SPES forhøjet ekspression af en række gener involveret i den apoptotiske kaskade, svarende til celler behandlet med etoposid og vincristin.

Konklusion:DetKinesisk urtemedicinekstrakter OLEN, SPES og PC-SPES er cytotoksiske for både lægemiddelresistente og lægemiddelfølsommelungekræftceller, der viser en vis tumorcellespecificitet sammenlignet med deres effekt på normale celler, og er proapoptotiske målt ved DNA-brud og genekspression. Tumorcellernes reaktion på disse ekstrakter svarede til deres reaktion på konventionelle kemoterapeutiske lægemidler.

Cistanche, en dyrebarKinesisk urtemedicin, har den virkning at øge immuniteten oglungekræft. Cistanche har en lang historie med medicinsk brug. Det blev første gang optaget i "Shen Nong's Materia Medica". Shennong smagte alle slags urter. Cistanches effektivitet og rolle er væsentlige for at forfriske nyrerne og nærende essens, lindre træthed, fugte tarmene og afføringen, nære yang og nære yin osv., så det blev optaget i bogen. Under post-Tang-dynastiet blev Cistanche opført som en af ​​de ni kinesiske fe-typer af græs. Moderne forskning i det er blevet udført i mere end 60 år. , Anti-aging, hjælper med at forbedre hukommelse og immunitet osv.

Nøgleord:Lungekræft, Lægemiddelresistens,kinesisk urtemedicin,cistanche

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com

Introduktion

Småcelletlungekræft(SCLC) tegner sig for omkring 20 procent af allelungekræftog er aggressiv med en 5-års overlevelsesrate ved diagnose på mindre end 10 procent [19]. Patienter har almindeligvis spredt sygdom, og derfor er behandlingen ved kemoterapi, med kombinationer, der almindeligvis involverer cisplatin, etoposid, doxorubicin, 5-fluoruracil og taxol [12]. Desværre bliver denne behandling til sidst ineffektiv, fordi de fleste SCLC-tumorer udvikler multilægemiddelresistens [18]. Da der er mange resistensmekanismer [15], er det en stor klinisk udfordring at overvinde resistens.

Stillet over for palliativ behandling bruger mange kræftpatienter alternativ medicin, herunder naturlægemidler [6, 23]. Blandt disse terapier er traditionel kinesisk medicin sandsynligvis den bedst etablerede og kodificerede, som går flere tusinde år tilbage. Det teoretiske grundlag for dette medicinske system vedrører de modsatte kræfter af yin og yang, generative og destruktive cyklusser og en livskraft eller qi [2]. Specifikke urteekstrakter og kombinationer er blevet udtænkt til at behandle specifikke sygdomme, herunder cancer [11, 27]. Selvom der er nogle empiriske beviser for, at urterne er effektive til behandling af kræft, er deres virkningsmekanismer på celleniveau stort set ukendte. Dette får ekstra betydning, hvis patienterne kombinerer deres brug med konventionel kemoterapi. Desuden er virkningerne af urteekstrakter på lægemiddelresistens ikke blevet rapporteret.

Vi undersøgte virkningerne af firekinesisk urtemedicinpå tre cellelinjer: SCLC, multidrug-resistent SCLC og normalt lungeepitel. To af de fire ekstrakter var fra enkeltplanter, der ofte er ordineret til lungekræft, Glycyrrhiza glabra (GLYC) og Olenandria diffusa (OLEN). De to andre var fra kommercielt tilgængelige kombinationer af urter kaldet SPES og PC-SPES. OLEN (kinesisk navn Bai Hua she cao) har antitumor, antimutagene og immunstimulerende aktiviteter [1, 25, 29]. GLYC (kinesisk navn gan car) er antiinflammatorisk, antitumorigen og antimutagen [7, 11]. SPES, udviklet af BotanicLabs (Brea, Californien), er i form af kapsler indeholdende frysetørrede ekstrakter af 15 kinesiske urter og har vist sig at mindske smerter hos patienter med fremskreden cancer [14]. Blandt urterne i SPES er det immunstimulerende middelCistanchedeserticola, antitumormidlet Rabdosia rubescens og det antiinflammatoriske middel Zanthoxylum iridium [1, 11]. PC-SPES, også fremstillet af BotanicLabs, indeholder otte urter, herunder den antiandrogene Serenoa repens, der hæmmer prostatahyperplasi [21], proteinkinase C-hæmmeren Scutellaria baicalensis [13], antitumormidlet Panax ginseng [30] og Glycyrrhiza glabra ( se ovenfor). Mens der mangler streng evidens for klinisk antitumoreffektivitet af GLYC, OLEN og SPES, er der noget bevis for effektiviteten af ​​PC-SPES. I både prostatacancerceller og dyremodeller er PC-SPES proapoptotisk og cytotoksisk [8, 9, 10, 28]. Kliniske forsøg har indikeret, at det er effektivt til at sænke niveauer af prostataspecifikt antigen og til at stoppe tumorvækst i både androgenafhængig og androgen-uafhængig prostatacancer [4, 5, 17, 20, 26].

Selvom cancerpatienter uden tvivl bruger urteekstrakter, er der sparsomme prækliniske eller kliniske data om virkningerne af disse ekstrakter på SCLC. Vores mål var at begynde denne analyse med en undersøgelse af farmakologi (cytotoksicitet), cellebiologi (metode til celledød) og molekylærbiologi (genekspression) i lægemiddelfølsomme og lægemiddelresistente SCLC-celler.

Materialer og metoder

Ekstrakter og kemikalier

GLYC og OLEN blev opnået som tørrede planter fra Jen-On Medical Group (Monterey Park, Californien). Til fremstilling af et ekstrakt blev 0,5 g formalet til et fint pulver med en morter og støder og suspenderet i 30 ml destilleret vand. I kinesisk medicin indtages planteekstrakterne som te efter opvarmning. Derfor blev suspensionen inkuberet under omrystning ved 70 grader i 18 timer. Efter centrifugering ved 1500 g i 10 minutter blev supernatanten steriliseret ved at filtrere gennem et 0,45- lm-filter under anvendelse af en sprøjte. Den resulterende ekstrakt blev justeret med destilleret vand til 17 mg/ml baseret på det oprindelige plantemateriale. Ekstrakterne blev opbevaret ved 4 grader i op til 1 uge indtil brug.

SPES og PC-SPES blev opnået fra BotanicLabs (Brea, Californien) som kapsler. Den anvendte ekstraktionsmetode er blevet anvendt i tidligere undersøgelser af disse præparater [8, 9, 10]. Indholdet af en kapsel (320 mg) blev opløst i 1 ml 95 procent ethanol, og suspensionen blev inkuberet under omrystning ved 37 grader i 1 time. Efter centrifugering ved 3000 g i 10 minutter blev supernatanten filtersteriliseret som ovenfor. Den endelige koncentration var 300 mg/ml baseret på det originale plantemateriale. Ekstrakterne blev opbevaret ved -20 grader i op til 1 uge indtil brug.

Cellekulturer og cytotoksicitetsmåling

NCI-H69 SCLC-celler blev dyrket ved 37 grader i en atmosfære indeholdende 5 procent CO2 som en suspension i AIM-V serumfrit medium (Life Technologies, Grand Island, NY). En multiresistent cellelinje (H69VP) udvalgt i etoposid [16] blev også dyrket i AIM-V og viste krydsresistens over for etoposid (9-fold), doxorubicin (20- gange) og vincristin (10-fold) (data ikke vist). Disse celler har flere mekanismer for lægemiddelresistens, herunder ændringer i topoisomerase II og ekspression af membranpumperne, MDR1 og MRP. BEAS-2 normale lungeepitelceller [22] blev dyrket i DMEM-F12 suppleret med 10 procent føtalt bovint serum.

Til cytotoksicitetstestning blev ekstrakter tilsat som angivet til logaritmisk voksende celler i 1-ml kulturer indeholdende 6000 celler/ml. Efter 4 dages kontinuerlig eksponering blev celler talt i en Coulter Z-1-tæller. Tællinger blev valideret mikroskopisk med hæmocytometer efter farvning med trypanblåt. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer og gentaget mindst tre gange. IC50-værdierne, defineret som koncentrationen af ​​ekstrakt, der havde reduceret celletal på dag 4 med 50 procent, blev beregnet sammenlignet med opløsningsmiddelkontroller. Middelværdier blev beregnet og sammenlignet med ANOVA for de tre cellelinjer for det ekstrakt.

Celledødsassays

Mekanismen for cytotoksicitet blev undersøgt ved kinetikken af ​​cellulær DNA-fragmentering (Boehringer-Mannheim kit, Indianapolis, Ind.). Kort fortalt blev 5·105 celler/ml inkuberet i 16 timer ved 37 grader i en atmosfære indeholdende 5% CO2 i AIM-V-medium indeholdende 10 lM BudR. Cellerne blev vasket og resuspenderet ved 105/ml i BudR-frit medium, og 200 µl af denne kultur blev inkuberet med urteekstrakt ved 2·IC50 i det angivne tidsrum, hvorefter 100 µl af dyrkningsmediet blev fjernet til kvantificering af DNA fragmenter ved ELISA. Dette er et mål for cellenekrose. DNA-fragmenter i cellerne, genereret ved apoptose, blev målt efter cellelyse i bovint serumalbumin (BSA)/Tween 20 ved 21 grader i 30 minutter. Efter centrifugering blev lysatet anvendt til ELISA.

ELISA blev udført i en rundbundet mikrotiterplade belagt med anti-DNA-antistof (muse anti-humant DNA monoklonalt, klon MCA-33) natten over ved 4 grader. Efter blokering med BSA blev 100 µl mærket DNA-fragmentopløsning tilsat til de overtrukne brønde efterfulgt af inkubation i 90 minutter ved 21 grader. DNA'et blev fikseret og denatureret ved mikrobølgebestråling ved 500 W i 5 min. Muse-anti-BudR (muse-monoklonal BMG 6HB) konjugeret med peroxidase blev tilsat, og efter inkubation i mørke i 120 minutter ved 21 grader blev reaktionen standset ved tilsætning af 500 µl koncentreret H2S04. Den resulterende farve blev kvantificeret ved absorbans ved 450 nm. Ekstraktbehandlede prøver blev sammenlignet med ubehandlede kontroller som baggrund.

Apoptose blev bekræftet ved TUNEL-analyse. Logaritmisk voksende celler blev udsat for urteekstrakt ved 1·IC50 i 3 timer. De blev derefter vasket to gange i phosphatbufret saltvand (PBS) indeholdende 1 procent BSA og resuspenderet i PBS/BSA ved 5·105 celler/ml. Til 500 1 celler blev der tilsat 100 114% paraformaldehyd, og cellerne blev fikseret ved 21 grader i 1 time. Efter vask i PBS blev cellerne resuspenderet i 100 1 kold permeabiliseringsbuffer (0,1 procent Triton X-100, 0,1 procent natriumcitrat) i 2 minutter ved 4 grader. Cellerne blev vasket to gange i PBS og derefter resuspenderet i en 50 1 TUNEL-blanding indeholdende terminal deoxyribonukleotid-idyl-transferase (TdT) og fluorescein-dUTP (Boehringer-Mannheim-kit). Efter inkubation i mørke ved 37 grader i 1 time blev cellerne modfarvet med propidiumiodid og analyseret ved flowcytometri.

Genekspressionsanalyse

Kulturer (6 ml) af logaritmisk voksende celler (5·105 celler/ml) blev inkuberet i et medium indeholdende urteekstrakt ved 1·IC50 ved 37 grader i en atmosfære indeholdende 5 procent CO2 i 3 timer. Efter vask to gange i PBS blev cellepelleterne frosset ved -70 grader natten over. RNA blev isoleret ved hjælp af RNeasy Mini-protokollen (Qiagen, Valencia, Californien). Generelt gav denne metode 0,5 LG RNA. Denne mængde RNA blev revers-transskriberet til cDNA og mærket med biotin-dUTP og hybridiseret til denaturerede prober til apoptose- og cellecyklusrelaterede gener på filtre. Hybridisering blev detekteret ved at binde alkalisk phosphatase-streptavidin til cDNA'et under anvendelse af et kemiluminescerende substrat, CDP-Star (SuperArray, Bethesda, Md.), efterfulgt af eksponering for røntgenfilm, generelt i 1-2 min.

Kontrolgenmål på hvert filter inkluderede b-actin og GAP-DH som positive kontroller og pUC18 som en negativ kontrol. Følgende cellecyklus- og apoptose-relaterede gener var hybridiseringsmål: bad, bcl-2, BCL-w, BCL-x, caspases 1-10, c-myc, E2F, fas, fas ligand, gadd45, iNOS , mdm2, NFkB, p21Waf1, p53, pig7, pig8, Rb, DR5, trail, Casper, CRADD, DAXX, IAP-1, IAP-2, NIK, TNFR2, TRAF2, TRAF3, TRAF5 og DR5. Intensitetenhybridisering blev scoret visuelt i tandem duplikatpletter på filtret i forhold til de positive kontroller.

Resultater

Vores indledende eksperimenter testede cytotoksiciteten af ​​ekstrakter af kinesiske urter på lægemiddelfølsomme og lægemiddelresistente SCLC-celler såvel som normale lungeepitelceller. Som vist i tabel 1 var de fire urteekstrakter cytotoksiske ved lave koncentrationer. Disse resultater ligner dem, der er fundet for SPES og PC-SPES i andre tumorcellelinjer [8]. I hvert tilfælde var IC50-værdierne for multilægemiddelresistente celler (H69VP) ikke forskellige fra værdierne for lægemiddelfølsomme celler (H69). IC50-værdierne for normale lungeepitelceller var også signifikant højere end for tumorcellelinjerne.

Vi undersøgte derefter mekanismen for cytotoksicitet ved at bruge kinetikken af ​​DNA-fragmentering som en indikation af apoptose (fragmenter dannet langsomt i celler) eller nekrose (fragmenter, der hurtigt dannes og frigives fra de beskadigede celler). Celler blev inkuberet i urteekstrakt i mellem 30 minutter og 8 timer, og derefter blev DNA-fragmenterne estimeret ved ELISA i både dyrkningsmediet og cellelysater. Figur 1 viser repræsentative data for H69-celler udsat for de fire ekstrakter i 90 min. Med tre af ekstrakterne (SPES, PC-SPES, OLEN) kom de fleste af DNA-fragmenterne inde fra cellerne (lysater), hvilket indikerer apoptose. Men med GLYC blev fragmenterne frigivet til mediet fra beskadigede celler, hvilket indikerer nekrose. Lignende resultater blev opnået med H69VPceller (data ikke vist).

Disse cytotoksicitetsforsøg blev fulgt af TUNEL-assays af DNA-brud in situ. Sammenlignet med ubehandlede kontroller (1-3 procent apoptotiske celler i fire eksperimenter), viste SCLC-celler behandlet med SPES (58-85 procent), PC-SPES (63-77 procent) og OLEN (49-81 procent) TUNEL-positivitet, mens celler behandlet med GLYC gjorde det ikke (1-2 procent) (fig. 2). Lignende resultater blev opnået med H69VP-celler (data ikke vist).

Vi analyserede gentranskription som svar på urteekstrakter ved hjælp af GeneArrays. Disse arrays har tandem-arrangerede gener relateret til cellecyklus og apoptose. Vi udførte disse eksperimenter to gange med lignende resultater. Figur 3 viser repræsentative arrayautora-diagrammer af H69-celler udsat for etoposid eller SPES. Vores resultater for H69-celler er opsummeret i tabel 2. Mens ubehandlede kontroller kun havde en påviselig ekspression af nogle få af de undersøgte gener, viste celler behandlet med konventionelle kemoterapeutiske lægemidler (etoposid og vincristin) stærke signaler for en række gener involveret i cellecyklussen regulering og apoptose. Celler behandlet med OLEN, SPES og PC-SPES viste et mønster svarende til det, der blev opnået med de to lægemidler. Generelt så celler behandlet med GLYC ikke ud til at vise dette transkriptionsmønster og viste i stedet stærk ekspression af antiapoptose-genet, BCL-2.

Diskussion

Vi foretog disse undersøgelser af to årsager. For det første er der en gammel tradition for kinesisk urtemedicin, der er baseret på dens egne teorier og filosofi [2], og vi ønskede at begynde at forstå i vestlige medicinske termer virkningerne af urtemidlerne. Disse urter bruges som blandinger, og selvom der er sket fremskridt med at nedbryde dem til individuelle kemiske bestanddele[11], fokuserede vores undersøgelser på dem, som de bruges i traditionel praksis. Vores anden motivation var, at mange cancerpatienter bruger disse urter sammen med konventionelle behandlinger [6, 23], og forståelse af urternes cellulære virkninger kunne give vigtig information til klinisk beslutningstagning.

Cytotoksicitetsdataene (tabel 1) viste, at de fire urteekstrakter faktisk var cytotoksiske for tumorceller, mere på dosisbasis end for normale lungeepitelceller, hvilket indikerer en vis tumorspecificitet og muligvis et gunstigt terapeutisk indeks. Lighederne i IC50 mellem lægemiddelfølsomme og multidrug-resistente celler indikerer, at disse ekstrakter ikke påvirkes af lægemiddelresistensmekanismerne, der vises i H69VP-celler, herunder overekspression af to lægemiddeltransportører, MDR1 og MRP.

Kinetikken af ​​DNA-fragmentering viste, at ekstrakterne SPES, PC-SPES og OLEN var proapoptotiske, mens GLYC var pron erotisk (fig. 1). Dette blev bekræftet ved TUNEL-farvning in situ (fig. 2). De fleste konventionelle kemoterapeutiske lægemidler er proapoptotiske [3], og en gruppe af apoptotiske og cellecyklusregulerende gener er opreguleret i cellerne som reaktion på lægemidlerne [24]. Vi fandt ud af, at mønsteret for ekspression af nogle af generne udtrykt som svar på de tre pro app til urteekstrakter svarede til det, der blev observeret i disse celler efter eksponering for konventionelle kemoterapeutiske lægemidler (fig. 3, tabel 2). Responsen på GLYC alene så ud til at være anderledes, i det mindste på det tidspunkt, der blev analyseret i disse eksperimenter. Interessant nok er GLYC en del af PC SPES, som var proapoptotisk, mens GLYC alene ikke var det. Måske er andre komponenter i PC-SPES ansvarlige for dens proapoptotiske aktivitet. Selvom disse resultater ikke viser, hvordan urteekstrakterne udtrækker beskadigede celler, tyder de på, at H69-celler reagerer på skaden på molekylært (transkription) og cellulært (apoptose) niveau på en måde svarende til deres reaktion på kemoterapi.

Vores undersøgelser viser den potentielle anvendelighed af disse kinesiske urteekstrakter i behandlingen af ​​SCLC, især lægemiddelresistent sygdom.

AnerkendelserVi takker L. Brown for uvurderlig hjælp med andre cytometri og R. Lingeman for assistance med molekylærbiologiske protokoller. BEAS-2-cellerne blev generøst leveret af Dr. I. Laird-Offringa, University of SouthernCalifornia, Norris Cancer Center. SPES og PC-SPES var en gave fra Dr. S. Chen, New York Medical College. Denne forskning blev støttet af Pritzker Family Foundation og WM KeckFoundation.

Cistanche som kinesisk urtemedicin kan forbedre immuniteten og bekæmpe kræft, klik her for at lære mere

Referencer

1. Boik J (1996) Kræft og naturmedicin: en lærebog i grundlæggende videnskab og klinisk forskning. Oregon Medical Press, Princeton, s. 221

2. Chan K (1995) Fremskridt i traditionel kinesisk medicin. Trends Pharmacol Sci 16:182-187

3. Chu E, DeVita V Jr (2001) Principper for kræftbehandling: kemoterapi. I: DeVita V Jr, Hellman S, Rosenberg SA (red) Kræft: principper og praksis for onkologi. Lippincott Williams og Wilkins, Philadelphia, s. 289-306

4. De la Taille A, Hayek OR, Buttyan R, Bagiella E, Burchart M, Katz AE (1999) Effekter af et fytoterapeutisk middel, PC-SPES, på prostatacancer. BJU Int 84:845–850

5. DiPaola RS, Zhang H, Lambert G, Meeker R, Licitra E, Rafi M, Spaulding H, Goodin S, Toledano M, Gallo M (1998) Klinisk og biologisk aktivitet af en østrogen urtekombination (PC-SPES) i prostata Kræft. New Engl J Med 339:785–791

6. Eisenberg DM, Davis RB, Ettner SL (1998) Tendenser i brug af alternativ medicin i USA: 1990-1997: resultater af en opfølgende national undersøgelse. JAMA 280:1569-1575

7. Fenwick GR, Lutomski J, Nieman C (1990) Glycyrrhiza glabra: sammensætning, anvendelser og analyse. Food Chem 38:119-143

8. Halicka HD, Ardelt B, Juan G, Mittleman A, Chen S, Traganos F, Darzynkiewicz Z (1997) Apoptose og cellecykluseffekter induceret af ekstrakter af det kinesiske urtepræparat PC-SPES. Int J Oncol 11:437–448

9. Hsieh T, Chen SS, Wang X, Wu J (1997) Regulering af androgenreceptor og prostataspecifik antigenekspression i androgen-responsive humane prostata LNCaPceller ved hjælp af ethanolekstrakter af det kinesiske urtepræparat PC-SPES. Biochem Mol Biol Int 42:535-544

10. Hsieh T, Ng C, Chang, C, Chen SS, Mittleman, A, Wu J (1998) Induktion af apoptose og nedregulering af BCL-6 i Mutu-celler behandlet med ethanolekstrakter af det kinesiske urtetilskud PC-SPES. Int J Oncol 13:1199-1202

11. Huang KC (1999) The pharmacology of Chinese herbs, 2^ndudg. CRC Press, Boca Raton

12. Kalemkerian GP, ​​Worden FP (2000) Terapeutiske fremskridt i SCLC. Expert Opin Invest Drugs 9:65–79

13. Kimura Y, Okuda H, Yokio K, Matsushita N (1997) Virkninger af baicalein isoleret fra Scutellaria baicalensis på interleukin 1b- og TNF-induceret vævsplasminogenaktivator og plasminogenaktivatorhæmmer-1 produktion i dyrket umbilialcelle-ende-endoth . Phytother Res 11:363-367

14. Lin C (1996) En observation om den kombinerede brug af kemoterapi og traditionel kinesisk medicin til at lindre kræftsmerter. J Tradit Chin Med 16:267–269

15. Mattern J, Volm M (1995) Resistensmekanismer i human lungecancer. Invasion Metastasis 15:81-94

16. Minato K, Kanzawa F, Nishio K, Nakagawa K, Fujiwara Y, Saijo N (1990) Karakterisering af en etoposid-resistent human småcellet lungecancerlinje. Cancer Chemother Pharmacol 26:313-327

17. Moyad MA, Pienta KJ, Montie JE (1999) Brug af PC-SPES, et kommercielt tilgængeligt supplement til prostatacancer, hos en patient med den hormonnaive sygdom. Urology 54:319-324

18. Nishio K, Nakamura T, Koh Y, Suzuki H, Fukumoto N, Saijo N (1999) Lægemiddelresistens ved lungekræft. Curr Opin Oncol 11:109-115

19. Pass H, Mitchell JB, Johnson DH, Turrisi AT, Minna J (2000) Lungekræft: principper og praksis. Lippincott, Philadelphia

20. Pfeifer BL, Pirani JF, Hamann SR, Klippel KF (2000) PC SPES: et kosttilskud til behandling af hormon-refraktær prostatacancer. BJU Int 85:481–485