Abstrakt

Formål: At undersøge virkningerne af en Cistanche-holdig formel (erstatning af de originale blod-nærende og nyre-tonificerende urter) på transformerende vækstfaktor- 2 (TGF- 2) ekspression, skleral remodeling og vandtransport i form-deprivation nærsynethed (FDM) rotter ved at regulere cavein)-1 (CA1quaporin)-1 (AQP1) vej.

Metoder: Fyrre SPF-grade SD-hanrotter blev udvalgt, blandt hvilke 30 blev brugt til at etablere FDM-modellen. Efter vellykket modellering blev rotterne opdelt i FDM-gruppen, pirenzepin (PIR)-gruppen og Cistanche-formelgruppen med 10 rotter i hver gruppe. De resterende 10 ikke-modellerede rotter fungerede som den normale gruppe. Normalgruppen og FDM-gruppen modtog ingen intervention. PIR-gruppen blev behandlet med PIR-øjendråber to gange dagligt (morgen og aften), mens Cistanche-formelgruppen fik intragastrisk administration af den Cistanche-holdige formel. Brydningsfejl og aksial længde af rotter blev påvist ved anvendelse af et retinoskop og diagnostisk instrument. HE-farvning blev brugt til at observere de morfologiske ændringer af skleralt væv. Immunhistokemisk farvning blev anvendt til at detektere ekspressionen af ​​TGF- 2 i skleralt væv. Western blot blev brugt til at bestemme de relative ekspressionsniveauer af AQP1- og CAV1-proteiner i skleralt væv. RT-PCR blev udført for at måle de relative ekspressionsniveauer af glutamat-aspartat transporter (GLAST) og glutamat transporter 1 (GLT-1) mRNA i skleralt væv. Resultater: Sammenlignet med den normale gruppe var brydningsfejlen, TGF- 2-ekspressionsniveauet og det relative ekspressionsniveau af AQP1- og CAV1-proteiner i FDM-gruppen, Cistanche-formelgruppen og PIR-gruppen signifikant reduceret, mens den aksiale længde og relative ekspressionsniveauer af GLAST mRNA og GLT-1.} mRNA var < signifikant øget. Sammenlignet med FDM-gruppen var brydningsfejlen, TGF- 2-ekspressionsniveauet og det relative ekspressionsniveau af AQP1- og CAV1-proteiner i Cistanche-formelgruppen og PIR-gruppen signifikant forøget, mens den aksiale længde og relative ekspressionsniveauer af GLAST mRNA og GLT-1 mRNA var signifikant reduceret (alle P < 0,05). Sammenlignet med Cistanche-formelgruppen var brydningsfejlen, TGF- 2-ekspressionsniveauet og relative ekspressionsniveauer af AQP1- og CAV1-proteiner i PIR-gruppen signifikant reduceret, mens den aksiale længde og relative ekspressionsniveauer af GLAST-mRNA og GLT-1-mRNA var signifikant øget (alle P < 0,05). HE-farvningsresultater viste, at der ikke var nogen unormale ændringer i strukturen af ​​hvert retinalt lag i den normale gruppe; nethinden i FDM-gruppen blev fortyndet, og der opstod alvorlige vakuolære ændringer i gangliecellelaget; retinaltykkelsen af ​​Cistanche-formelgruppen og PIR-gruppen blev øget, cellearrangementet var grundlæggende regelmæssigt, antallet af ganglieceller blev øget, og cellerne i hvert lag var tæt arrangeret, med den mest signifikante ydeevne i Cistanche-formelgruppen. Konklusion: Den Cistanche-holdige formel har en vis positiv effekt på behandlingen af ​​FDM, og dens mekanisme kan være relateret til regulering af ekspressionen af ​​CAV1, AQP1 og TGF- 2, samt afbalancering og forbedring af skleral remodeling og vandtransportfunktioner.

 

 

CISTANCHE URTE-SUPPLEMENT TIL FORBEDRING AF NYREFUNKTIONEN

 

 

Nøgleord

Form-deprivation nærsynethed; Cistanche-holdig formel; Transformerende vækstfaktor- 2; Aquaporin 1; Caveolin-1; Skleral ombygning; Vandtransport

 

I de senere år, med ændringerne i folks livsstil og den fortsatte udvikling af elektroniske enheder, har forekomsten af ​​nærsynethed været stigende. Som en almindelig sygdom er den blevet et globalt sundhedsproblem. Form-deprivation nærsynethed (FDM) er en speciel type nærsynethed, som normalt er forårsaget af afsavn eller reduktion af visuel stimulation til øjnene. FDM interfererer ikke kun med den sklerale ombygningsproces, men fører også til unormale ændringer i øjeæblets form og forstyrrelser i vandtransportfunktionen, hvilket yderligere kan forværre skleral vævsskade og deformation. Aquaporin 1 (AQP1) er et vidt eksisterende protein, hvis hovedfunktion er at fremme den hurtige transport af vandmolekyler gennem cellemembraner. I øjet er fordelingen og funktionen af ​​AQP1 relateret til den dynamiske balance af intraokulær væske. Caveolin-1 (CAV1) er et protein involveret i dannelsen af ​​cellemembranmikrostrukturer og signaltransduktion. I øjet er CAV1 hovedsageligt til stede i retinale pigmentepitelceller og fotoreceptorceller og er relateret til transmissionen af ​​visuelle signaler og stabiliteten af ​​det intraokulære miljø. Transformerende vækstfaktor- 2 (TGF- 2) er et pleiotropt cytokin med flere biologiske effekter, såsom fremme af celleproliferation, differentiering og migration. I det intraokulære miljø spiller TGF- 2 en vigtig rolle i udviklingen og vedligeholdelsen af ​​cornea og sclera. På nuværende tidspunkt er hovedbehandlingen af ​​FDM lægemiddelbehandling.

I traditionel kinesisk medicin (TCM) menes dannelsen af ​​nærsynethed at være relateret til faktorer som utilstrækkelig qi og blod og mangel på nyreessens. Nyren betragtes som det "medfødte fundament" og er tæt forbundet med øjnenes funktion. TCM hævder, at "nyren styrer essensen, og essensen nærer øjnene; leveren åbner sig i øjnene, og tilstrækkeligt leverblod sikrer klart syn". Derfor har tonificering af nyrerne og nærende blod altid været et vigtigt terapeutisk princip for øjensygdomme forårsaget af mangelsyndromer i TCM.

Cistanche, kendt som "ørkenginsengen" og en af ​​de "ni udødelige lægemidler" i TCM, har en historie på mere end 2.000 år som medicinsk ingrediens. Optaget som et nærende medicinsk materiale af højeste kvalitet i gamle TCM-klassikere, er Cistanche højt værdsat for dets virkninger af tonificering af nyrerne, genopfyldning af essens, nærende blod og fugtende tørhed. I modsætning til mange andre TCM-urter vokser Cistanche udelukkende i ørkener, hovedsageligt parasitisk på rødderne af Tamarix ramosissima i regioner som Xinjiang, Indre Mongoliet og Gansu i Kina. Det unikke ørkenmiljø giver det rige aktive ingredienser, herunder echinacoside, verbascoside og flavonoider, som er videnskabeligt bevist at have stærke antioxidantegenskaber, reducere celleapoptose og fremme celleproliferation.

Moderne forskning har vist, at Cistanche har betydelige nyre-nærende virkninger. Det kan reducere nyrecelleapoptose, fremme nyrecelleproliferation, reparere beskadigede nyreceller og udvide nyrernes blodkar og derved forbedre nyrefunktionen. Derudover kan Cistanche øge immuniteten ved at fremme lymfocytproliferation, modstå træthed ved at øge leverglykogenproduktionen og udøve anti-aldringseffekter gennem fjernelse af frie radikaler. Disse biologiske aktiviteter er meget i overensstemmelse med TCM-teorien om "tonificering af nyrerne og nærende essens", og giver også et videnskabeligt grundlag for dets anvendelse i behandling af øjensygdomme. Baseret på det TCM-terapeutiske princip om at tonificere nyrerne og nærende blod og kombinere de moderne farmakologiske egenskaber ved Cistanche, erstattede denne undersøgelse de originale blod-nærende og nyre-tonificerende urter med Cistanche for at danne en ny Cistanche-holdig formel, og udforskede dens effektivitet og ny mekanisme til at udvikle en naturlig ide til behandling af FDM. behandlinger for nærsynethed.

1 Materialer og metoder

1.1 Forsøgsdyr

Fyrre SPF-grade SD-hanrotter, der vejede 180-200 g og i alderen 6-8 uger, blev købt fra Beijing Keyu Animal Breeding Center [Licensnr.: SCXK (Jing) 2022-0004] og rutinemæssigt opdrættet i Animal Laboratory of Chinese Eye Hospitals Academy of China Academy. Dette eksperiment overholdt de relevante bestemmelser i "Regler for administration af forsøgsdyr" og blev godkendt af den medicinske etiske komité på Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences (batchnr.: YKEC-KT-2024-017-P001).

1.2 Hovedreagenser og -instrumenter

Cistanche tubulosa (købt fra Chengdu WeCistanche Bio-Tech. Co., Ltd., med aktive ingredienser, inklusive echinacosid større end eller lig med 30,0 %, verbascoside større end eller lig med 12,0 %, og total phenethylalkoholglycosider større end eller lig med 75,0 %) blev anvendt som lægemiddelmateriale. Pirenzepin (PIR, Suzhou Hongsen Pharmaceutical Co., Ltd.); Sammensatte Tropicamid øjendråber (Hebei Jinyao Yongguang Pharmaceutical Co., Ltd., specifikation 5 ml); 4 g·L⁻¹ Oxybuprocaine Hydrochloride øjendråber (Shandong Bausch & Lomb Freda Pharmaceutical Co., Ltd.); AQP1-antistof (Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.); CAV1-antistof (Wuhan Botu Biotechnology Co., Ltd.); -actin-antistof (Shanghai Jingke Chemical Technology Co., Ltd.); Gede-anti-kanin IgG (Wenzhou Kemiao Biotechnology Co., Ltd.); HE-farvesæt (Shanghai Zeye Biotechnology Co., Ltd.).

1.3 Modelleringsmetode og gruppering

Tredive rotter blev brugt til at etablere FDM-modellen. Rotter blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af pentobarbitalnatrium (30 mg·kg-1). Efter rensning og desinficering af højre øje med povidon-jod blev en uigennemsigtig øjenmaske limet på højre øje. Øjenmasken blev tjekket dagligt for løsrivelse eller let lækage, og genlimet, hvis den var løs. Det venstre øje blev efterladt ubehandlet. Efter 4 ugers mangel på monokulær form blev der udført binokulær retinoskopi og aksial længdemåling på rotterne. Succeskriterierne for modellering: Efter cykloplegi blev refraktiv fejl målt med et retinoskop eller automatisk refraktometer, og det depriverede øje viste et signifikant nærsynet skift i brydningsstatus [dvs. forskellen i binokulær brydningsfejl Større end eller lig med 2 D blev betragtet som vellykket modellering, og det gennemsnitlige nærsynede skift af det depriverede øje blev sammenlignet med ca. Alle 30 rotter blev med succes modelleret og opdelt i FDM-gruppen, PIR-gruppen og Cistanche-formelgruppen med 10 rotter i hver gruppe. De resterende 10 ikke-modellerede rotter fungerede som den normale gruppe.

1.4 Interventionsmetoder

Normalgruppen og FDM-gruppen modtog ingen intervention. PIR-gruppen fik 5 dråber PIR øjendråber i højre øje 2 gange dagligt (morgen og aften) med et interval på 2 minutter i 15 dage. Cistanche-formelgruppen blev interveneret med den Cistanche-holdige formel. Cistanche tubulosa (50 g, kernebestanddelen) blev afkogt med vand og koncentreret til en medicinsk opløsning med en koncentration på 1000 g·L⁻1. Rotterne fik intragastrisk administration i en dosis på 12,70 g-kg-1 én gang dagligt i 15 dage. Doseringen af ​​Cistanche blev bestemt ud fra dets kliniske anvendelseserfaring og moderne farmakologisk forskning, hvilket sikrer effektive koncentrationer af aktive ingredienser såsom echinacoside og verbascoside.

1.5 Detektionsmetoder

1.5.1 Evaluering af brydningsfejl og ændringer i aksial længde

Morfologisk og refraktiv fejldetektion: Fireogtyve timer efter afslutningen af ​​formmangel blev 3 rotter tilfældigt udvalgt fra hver gruppe til påvisning. Før eksperimentet blev rotter anbragt i et mørkt tilpasset miljø i 30 minutter, derefter bedøvet ved isofluran-inhalation og fikseret på et specielt dyrebeslag. Et højopløsnings OCT-billeddannelsessystem blev brugt til panoramascanning af øjeæblet. Under scanning blev sonden justeret til at være vinkelret på hornhinden for at opnå klare tværsnitsbilleder af nethinden og linsen. Hvert øje blev scannet 3 gange i træk, og den aksiale afstand fra den forreste hornhindeoverflade til det retinale pigmentepitellag (dvs. aksial længde) blev automatisk målt af systemets indbyggede software for at beregne den sfæriske ækvivalente brydningsfejl. For at sikre datanøjagtighed har to professionelt uddannede forskere uafhængigt analyseret billederne på en blind måde. Hvis forskellen mellem de to måleresultater var større end 0,50 D, blev dataene kasseret og genmålt. Bekræftende påvisning af aksial længde: For at verificere OCT-målingsresultaterne blev der også brugt A-scan ultralydsdiagnostisk instrument. Først blev oxybuprocain hydrochlorid øjendråber inddryppet i begge øjne på rotterne til topisk anæstesi, og derefter blev A-scanningssonden forsigtigt anbragt i kontakt med hornhinden. Instrumentet blev justeret til manuel tilstand, og den nøjagtige ultralydsforplantningshastighed blev indstillet i overensstemmelse med det intraokulære medium: 1540 m·s⁻1 for det forreste kammer og glaslegemet. Under drift blev hver grænseflade lokaliseret ved manuel mærkning, og hvert øje blev målt 3 gange gentagne gange for at tage gennemsnitsværdien. Dette eksperiment blev udført på en blind måde, og alle operatører modtog samlet træning for at sikre ensartede måleteknikker. Instrumentet blev kalibreret før måling, og nogle prøver blev tilfældigt udvalgt til repeterbarhedstestning for at evaluere intraklasse- og interklassekorrelationskoefficienterne (ICC). Strenge standardiserede driftsprocedurer blev fulgt under eksperimentet for at sikre dataenes videnskabelighed og pålidelighed.

1.5.2 HE-farvning

Efter påvisning af brydningsfejl og aksial længde blev rotter aflivet ved overdreven bedøvelse. Øjenlågene og det omgivende væv i begge øjne blev desinficeret, og den nasale og temporale limbus vinkelret på midtpunktet af hornhinden blev markeret. Bindehinden blev skåret i overensstemmelse med mærkerne, og øjeæblet blev udskåret. Limbus blev skåret ind for at fjerne det forreste segmentvæv og glaslegemet, og det sklerale væv blev tilbageholdt. Det sclerale væv blev fikseret med 40 g·L⁻1 paraformaldehyd i 24 timer, dehydreret med gradientethanol, rutinemæssigt indlejret i paraffin, renset med xylen, monteret med neutral balsam, snittet ved 5 μm, farvet med HE og observeret for morfologiske ændringer af optisk mikroskop under et optisk mikroskop.

1.5.3 Immunhistokemisk farvning for TGF- 2-ekspression i skleralt væv

To rotter blev udvalgt fra hver gruppe. Sklerale vævssnit blev udsat for antigenudvinding og -blokering, inkuberet med muse-anti-TGF- 2 (1:3000) i 24 timer, vasket, inkuberet med sekundært antistof (1:2000) i 1 time, rutinemæssigt fremkaldt og modfarvet, monteret med neutral balsam, og 2-3 vævsændringer blev taget under et optisk mikroskop. Gråværdien af ​​den positive del blev detekteret af et billedanalysesystem.

1.5.4 Western blot-detektion af AQP1- og CAV1-proteinekspressionsniveauer i skleralt væv

To rotter blev udvalgt fra hver gruppe. Skleralt væv blev skåret ud, homogeniseret, og totalt protein blev ekstraheret ved tilsætning af RIPA-lysebuffer. Proteindenaturering, kvantificering, elektroforese, membranoverførsel og blokering blev udført. Primære antistoffer AQP1 (1:1000), CAV-1 (1:3000) og -actin-antistof (1:2000) blev tilsat og inkuberet natten over ved 4 grader. Sekundært antistof (1:2000) blev tilsat og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. ECL-reagens blev tilsat, og proteingråværdien blev analyseret med Image Lab-software. Forholdet mellem målbåndets gråværdi og -actin var dets relative ekspressionsniveau.

1.5.5 RT-PCR-påvisning af GLAST- og GLT-1-mRNA-ekspression i skleralt væv

Det resterende sklerale væv fra rotter blev taget, og totalt RNA blev ekstraheret ifølge Trizol-metoden. Det totale RNA blev målt med et spektrofotometer, og cDNA blev revers-transskriberet i overensstemmelse med kitinstruktionerne. RT-PCR-reaktionssystem blev fremstillet med følgende reaktionsbetingelser: 75 grader i 30 s, 85 grader i 60 s, 80 grader for annealing i 30 s, 65 grader for forlængelse i 30 s, i alt 40 cyklusser. Med -actin som den interne reference blev de relative ekspressionsniveauer af glutamat-aspartat transporter (GLAST) og glutamat transporter 1 (GLT-1) beregnet ved 2⁻ΔΔCt metoden. Primersekvenser er vist i tabel 1. Envejsvariansanalyse blev brugt til sammenligning mellem grupper, og LSD-t-test blev brugt til parvis sammenligning mellem grupper. Testniveauet:=0.05.