Cistanche: Echinacoside undertrykker bugspytkirtel adenokarcinom cellevækst ved at inducere apoptose via den mitogen-aktiverede protein kinase pathway

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

WEI WANG, JINBIN LUO, YINGHUI LIANG og XINFENG LI

Abstrakt.

Den kliniske anvendelse af naturlige produkter afledt af traditionel kinesisk medicin har fået opmærksomhed i cancerkemoterapeutika.Echinacoside(ECH), en af ​​phenylethanoiderne, isoleret fra stænglerne afCistanche(en kinesisk urtemedicin) har vævsbeskyttende og anti-apoptotisk virkning på centralnervesystemet. Det forbliver dog stort set uhåndgribeligt, om ECH har tumor-undertrykkende aktivitet. I den foreliggende undersøgelse blev det påvist, at ECH markant kan hæmme proliferationen af ​​pancreas-adenokarcinomceller ved at inducere produktionen af ​​reaktive oxygenarter og forstyrrelsen af ​​mitokondrielt membranpotentiale og dermed udløse apoptose. Endvidere blev det belyst, at ECH(Echinacoside)undertrykker tumorcellevækst gennem modulering af MAPK-aktivitet. Som konklusion afslører denne undersøgelse en ny funktion af ECH(Echinacoside) til at forhindre kræftudvikling og antyder, at brugen af ​​ECH kunne være en potentiel kemoterapeutisk strategi for kræft.

Introduktion

P53-tumorsuppressorvejen via induktionen af ​​tumorsuppressoren, ARF dæmper den onkogene E3-ligase-muse-dobbeltminut (MDM)2--medieret p53-nedbrydning (3). Dette er en auto-reguleret, selvbeskyttende mekanisme, der forhindrer celler i ondartet transformation. Især kan p53 undertrykke Myc-aktivitet ved transkriptionelt at aktivere f.eks. miR-145, som er målrettetMit CmRNA til translationsdæmpning (4,5), hvilket danner en negativ feedback regulatorisk loop.

Den mest ligetil og effektive strategi til behandling af kræft er at dræbe kræftcellerne. De almindeligt anvendte kræftlægemidler, såsom cisplatin (6), actinomycin D (7) og adriamycin (8), har vist sig at hæmme tumorvækst ved at fremme apoptose. For nylig har voksende beviser vist, at en række naturlige produkter og derivater fra planter, især fra lægeplanter anvendt i traditionel kinesisk medicin (TCM), udviser en tumor-undertrykkende funktion ved at inducere apoptose af cancerceller og har potentiale til klinisk anvendelse i kræftbehandling (9). For eksempel er det naturlige anthraquinon-emodin isoleret fra adskillige typer kræftceller (10,11). Camptothecin, afledt af det kinesiske 'lykkelige træ',Camptotheca spidsfindig, er et værdifuldt naturprodukt, der hæmmer ligeringen af ​​DNA efter topo I-medierede strengbrud (12). I et andet retrospektivt populationsbaseret kohortestudie af i alt 729 patienter med fremskreden brystkræft blev det foreslået, at TCM-terapi kan bidrage til kræftbehandling. Af denne kohorte var 115 patienter TCM-brugere, mens 614 patienter ikke brugte TCM. Den multivariate analyse viste, at brugen af ​​TCM sammenlignet med ikke-brugere var forbundet med en signifikant reduceret risiko for dødelighed af alle årsager (13). Alle de førnævnte resultater indikerede, at TCM er en vigtig komplementær og alternativ medicin, der kan bruges i behandlingen af ​​kræft.

mus med akut lungeskade (16,17). Også ECH(Echinacoside)har vist sig at have beskyttende virkninger på nervevæv og forbedre adfærdsforstyrrelser i murine modeller af Parkinsons sygdom (18). Det er især blevet fundet, at ECH fremmer celleproliferation og hæmmer apoptose i muse-tarmepitelet MODE-K-celler (19). Indtil videre er der dog blevet mindre opmærksomhed på ECH's potentielle rolle i kræftforebyggelse.

I denne undersøgelse blev det undersøgt, om ECH-behandling påvirker tumorcellevækst og -proliferation, og om ECH(Echinacoside)inducerer apoptose, hæver produktionen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) og reducerer mitokondrielt membranpotentiale (MMP) og undertrykker følgelig tumorcellevækst. Ydermere havde nærværende undersøgelse til formål at identificere de molekylære mekanismer, der er ansvarlige for ECH-medieret cellevækstinhibering.

Materialer og metoder

Celle linje, reagens, og antistoffer.SW1990 pancreas-adenokarcinomceller (ATCC, Manassas, VA, USA) blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagle-medium suppleret med 10 procent føtalt bovint serum, 50 U/ml penicillin og 0,1 mg/ml streptomycin ved 37˚C i en 5 procent CO2 befugtet atmosfære. ECH(Echinacoside)blev købt fra Jrdun Biotechnology Corp. (Shanghai, Kina). Antistoffer mod AKT, P-AKT, ERK, P-ERK, JNK, p-JNK, P38, p-P38 og GAPDH blev købt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA); anti-Bax og anti-Bcl-2 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA); og anti-Caspase-3 blev købt fra Abcam (Shanghai, Kina).

Celle levedygtighedassay. For at vurdere hastigheden af ​​tumorcellevækst blev Cell Counting kit {{0}} (CCK-8; Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD, USA) brugt i henhold til producentens instruktioner. Cellesuspensioner blev podet med 5,000 celler pr. brønd med ECH-behandling i 0, 12, 24, 48 eller 72 timer i 96 -brøndskulturplader. Cellevæksthæmning blev bestemt ved at tilføje WST-8-reagens fra CCK-8-kittet i en slutkoncentration på 10 procent til hver brønd, og absorbansen af ​​prøverne blev målt ved 450 nm ved hjælp af en mikropladelæser (Multiskan MK3; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA).

Hoechst 33342 farvning.Celler (60 procent konfluens) blev behandlet med Hoechst 33342 (Beyotime Institute of Biotechnology, Haimen, Kina) i en slutkoncentration på 1µg/ml, inkuberet i 37˚C inkubator i 15 minutter, vasket med fosfatbufret saltvand to gange, fikseret i 4 procent paraformaldehyd i 30 minutter ved stuetemperatur og monteret på objektglas. De morfologiske ændringer af cellekernerne blev observeret under et fluorescensmikroskop (Olympus BX51, Melville, NY, USA). De normale kerner var runde og farvede lyseblå, mens de apoptotiske kerner var krympede og farvede lyseblå.

Fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) analyser.Til vurdering af apoptose blev fluorescein isothiocyanat (FITC)-Annexin V Apoptosis Detection Kit (BD Biosciences, Shanghai, Kina) brugt i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev 5x104 celler vasket med iskold PBS, resuspenderet i 0,1 ml bindingsbuffer (Beyotime Institute of Biotechnology) og farvet med 10 ml FITC-konjugeret Annexin V (10 mg/ml) og 10 ml propidiumiodid (PI) (50 mg/ml). Efter inkubation i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke og tilsætning af 400 ml bindingsbuffer blev cellerne analyseret med et flowcytometer (C6; BD Biosciences, Shanghai, Kina).

Måling af reaktiv ilt arter (ROS).For at evaluere produktionen af ​​ROS blev Reactive Oxygen Species Assay-sættet (Vigorous Biotechnology, Beijing, Kina) brugt i henhold til producentens instruktioner. Kort fortalt blev celler (80 procent konfluens) høstet og vasket med PBS før farvning med dihydroethidium (DHE) opløsningen (Beyotime Institute of Biotechnology). Celler blev derefter analyseret ved flowcytometriske analyser.

Måling af mitokondrie membran potentiel (MMP).

Et tetramethylrhodamin methylester (TMRM) assay kit (ImmunoChemistry Technologies, Bloomington, MN, USA) blev brugt til at detektere ændringerne i MMP. Kort fortalt blev celler (80 procent konfluens) høstet, vasket med PBS og farvet med TMRM i 15-20 minutter i en 37˚C inkubator. Celler blev derefter vasket én gang med PBS og underkastet flowcytometriske analyser.

Immunblottinganalyser. Cellerne (80 procent konfluens) blev høstet og lyseret i RIPA-buffer (Jrdun Biotechnology) bestående af 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 procent NP-40, 1 procent natriumdeoxycholsyre og 0,1 procent SDS og frisktilsatte proteasomhæmmere. Lige store mængder af klart cellelysat blev anvendt til immunoblotting-analyse som beskrevet tidligere (20).

Statistisk analyse.Kvantitative data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse. Statistiske forskelle blev evalueret ved uparret Students t-test ved hjælp af statistisk SPSS 15.0-software. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

Resultater

ECH (Echinacoside)undertrykker svulst cellevækst. Selvom det er blevet rapporteret, at ECH(Echinacoside)udviser en beskyttende rolle ved at hæmme apoptose og inflammatoriske signaler i somatiske celler, såsom neuronale og intestinale epitelceller (16-19), er det stadig uhåndgribeligt, om ECH kontrollerer kræftcellevækst og -proliferation. For at teste dette blev et celleoverlevelsesassay udført ved at behandle SW1990-celler, afledt af et grad II pancreas-adenocarcinom, med titrerede doser af ECH som vist i fig. 1. Det blev især påvist, at ECH signifikant forsinker tumorcelleproliferation i en dosis -afhængig måde i en 5-dag kulturperiode (fig. 1).ECH udløserapoptose. Da tab af apoptose er en af ​​de vigtigste årsagsmekanismer, der ligger til grund for den ukontrollerede spredning af bugspytkirtelkræftceller (21), udførte denne undersøgelse et sæt eksperimenter for at bestemme, om ECH udløser apoptose. For det første blev det ved at farve kernerne af tumorceller med Hoechst 33342 påvist, at ECH resulterer i apoptose på en dosisafhængig måde (fig. 2A). Derudover blev FACS-analyser udført under anvendelse af Annexin V/PI-farvning for yderligere at bekræfte den apoptotiske virkning af ty ECH (fig. 2B). Den gennemsnitlige procentdel af apoptotiske celler var 1,1 procent under normale dyrkningsbetingelser, mens denne procentdel steg signifikant til 10,6, 21,4 og 51,3 procent som respons på ECH-behandling på en dosisafhængig måde (fig. 2C). Disse resultater, sammen med cellelevedygtighedsassayet vist i fig. 1, viser, at ECH-behandling undertrykker proliferationen af ​​tumorceller ved at udløse apoptose.

generere ethidium, der interkalerer med DNA, blev brugt i denne undersøgelse til at evaluere ROS-produktion. Det blev fundet, at ligesom andre anticancerlægemidler stimulerer ECH også ROS-produktion på en dosisafhængig måde som vist ved den forhøjede fluorescensintensitet ved ECH-behandling (fig. 3).

ECH (Echinacoside)reducerer MMP.Mitokondriel dysfunktion har vist sig at være impliceret i induktionen af ​​apoptose. Åbning af den mitokondrielle permeabilitetsovergangspore har vist sig at inducere depolarisering af transmembranpotentialet og frigivelsen af ​​pro-apoptotiske faktorer (23). Derfor blev det testet, om ECH kunne inducere tab af MMP i tumorceller ved at udføre et TMRM-assay, som er en veletableret tilgang, da intensiteten af ​​TMRM-fluorescens er proportional med membranpotentialet. Det blev påvist, at ECH-behandling signifikant reducerer MMP på en dosisafhængig måde (fig. 4).ECH kontroller svulst celle vækst via mitogen-aktiveret proteindet molekylære grundlag for ECH-medieret tumorcelledød, aktiviteten af ​​flere vitale signalveje, såsom MAPK og AKT (24,25), som kontrollerer celleoverlevelse og -død blev undersøgt. MAPK'erne er evolutionært konserverede, prolin-rettede Ser/Thr-proteinkinaser, herunder ekstracellulære signalregulerede kinaser (ERK'er), c-Jun NH 2-terminal kinase (JNK'er) og p38-familiemedlemmerne, som aktiveres gennem tre- tier kinase signalering kaskader (26,27). I denne undersøgelse blev ekspressionen af ​​MAPK'er og AKT, såvel som deres aktiverede phosphorylerede former, vurderet, og det blev afsløret, at ECH markant undertrykker JNK og ERK1/2 aktivitet, men øger p38 aktivitet (fig. 5). Det blev især påvist, at AKT-aktivitet, som også er kritisk vigtig for celleproliferation, ikke påvirkes af ECH-behandling (fig. 5). Derudover blev det vist, at ECH-behandling hæver ekspressionen af ​​Bax og Caspase-3, mens den reducerer Bcl-2-ekspressionen (fig. 5), hvilket er i overensstemmelse med fig. 2. Resultaterne indikerer således, at ECH udløser tumorcelleapoptose via MAPK-vejen.

Diskussion

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der viser, at ECH har en tumor-undertrykkende funktion ved at udløse apoptose (fig. 2), fremme ROS-produktion (fig. 3) og inducere mitokondriel membranpotential depolarisering (fig. 4). , som følgelig fører til hæmning af tumorcellevækst (fig. 1). Endvidere blev det molekylære grundlag for ECH-medieret tumorcelledød vist at forekomme ved at regulere MAPK-signalveje (fig. 5). Disse resultater demonstrerer en ny funktion af ECH til at forhindre tumorgenese og antyder således, at det kan være et kandidatmiddel til cancerterapi.

Størstedelen af ​​anticancerlægemidler kan inducere tumorcelleapoptose, senescens og/eller cellecyklusstandsning, hvilket fører til hæmning af tumorcellevækst og -proliferation. Cellecyklusstandsning er en cellulær reaktion på milde stresssignaler, der tillader celler at reparere beskadiget DNA før påbegyndelse af replikativ DNA-syntese eller mitose, hvorimod apoptose og senescens (permanent cellecyklusstandsning) opstår som reaktion på stresssignaler, der eliminerer irreparable eller maligne celler ( 28,29). Derfor blev kun den apoptotiske virkning af ECH på tumorceller vurderet i denne undersøgelse, da drab af cancerceller er et væsentligt kriterium for evaluering af styrken af ​​et anticancermiddel. Det blev især påvist, at ECH inducerer ekspressionen afBax(Fig. 5), et pro-apoptotisk gen, transkriptionelt aktiveret af tumorsuppressoren p53 (30). Det er således umagen værd at teste, om ECH kan aktivere p53-signalvejen. Hvis det er tilfældet, kan ECH også være i stand til at fremkalde p53-afhængig cellecyklusstop, senescens, apoptose eller autofagi. I denne undersøgelse blev den tumor-undertrykkende funktion af ECH i SW1990 pancreas adenocarcinom cellelinie belyst. Yderligere undersøgelser, der observerer flere bugspytkirtelkræftcellelinjer, er imidlertid nødvendige. Det er blevet vist, at mutationer i det onkogene protein RAS og tumorsuppressoren p53 er forbundet med udviklingen af ​​bugspytkirtelcancer (31); dog rummer SW1990-cellelinjen ikke nogen p53-mutation ifølge IARC p53-databasen (http://p53.iarc.fr/CellLines.aspx). Derfor er det vigtigt at undersøge, om ECH kan påvirke væksten og spredningen af ​​andre bugspytkirtelkræftcellelinjer med forskellige p53-mutationer. Derudover ville det være interessant at afgøre, om ECH er i stand til at fremme apoptose og hæmme væksten af ​​andre typer tumorer.

ROS-forhøjelse og MMP-reduktion, som var forårsaget af ECH-behandling, har vist sig at være afgørende for apoptoseinduktion (22). Derudover har det vist sig, at ROS kan inducere oxidation af mitokondrieporerne, hvilket bidrager til frigivelsen af ​​cytokromc, et mellemprodukt i apoptose på grund af afbrydelse af MMP (22). Det er således tilbage at afgøre, om ECH forstyrrer MMP indirekte gennem induktion af ROS. Desuden har ROS-fremkaldt oxidativ stress også vist sig at være involveret i at modulere et utal af cellevækststyrende signaler, herunder p53, NF-KB, HIF'er og PI3K (32). Det mangler at blive afgjort, om og i givet fald hvordan ECH regulerer disse vigtige signalveje. Især forårsager oxidativ stress forskellige neurodegenerative sygdomme på grund af det høje iltforbrug, svage antioxidative systemer og terminale differentieringsegenskaber i centralnervesystemet (33). Flere undersøgelser har dog vist, at ECH har beskyttende og anti-apoptotisk virkning på nervevæv. I denne henseende er det rimeligt at antage, at ECH kan reducere ROS-produktion i de terminaldifferentierede neurale celler. Derfor skal det også afgøres, om reguleringen af ​​ROS-produktion ved ECH er afhængig af celledifferentieringsstatus. Derfor afslører de nuværende resultater sammen med andre undersøgelser, at ECH, den meget anvendte TCM, kan være en vigtig kemoterapeutisk strategi, ikke kun til behandling af neurodegenerative sygdomme, men også maligne karcinomer.

På det seneste har brugen af ​​TCM i kræftbehandling fået stadig mere opmærksomhed. Potentialet af naturlige produkter fra lægeplanter, der anvendes i TCM, er blevet anerkendt af det videnskabelige samfund selv i den vestlige verden (9). Der kræves en indsats for at belyse de underliggende virkningsmekanismer for disse naturlige produkter, hvilket i sidste ende kan føre til udvikling af effektive og sikre lægemidler til kræftbehandling.

Som konklusion viste den foreliggende undersøgelse den tumorhæmmende funktion af ECH og uddyber også det molekylære grundlag for ECH-medieret tumorundertrykkelse, hvilket antyder den potentielle kliniske anvendelse af ECH i cancerterapi.

Anerkendelser

Denne undersøgelse blev finansieret og støttet af FMU's nøgleprogram for videnskabelig forskning (bevilling nr. 09ZD014). Forfatterne vil gerne takke Biomedworld (Shanghai, Kina) for hjælpen med at redigere manuskriptet.

Referencer

1. Hanahan D og Weinberg RA: Kræftens kendetegn: Den næste generation. Celle 144: 646-674, 2011.

2. Alderton GK: Transkription: De transkriptionelle virkninger af MYC. Nat Rev Cancer 14: 513, 2014.

3. Zindy F, Eischen CM, Randle DH, Kamijo T, Cleveland JL, Sherr CJ og Roussel MF: Myc-signalering via ARF-tumorsuppressoren regulerer p53-afhængig apoptose og immortalisering. Genes Dev 12: 2424-2433, 1998.

4. Sachdeva M, Zhu S, Wu F, Wu H, Walia V, Kumar S, Elble R, Watabe K og Mo YY: p53 undertrykker c-Myc gennem induktion af tumorsuppressoren miR-145. Proc Natl Acad Sci USA 106: 3207-3212, 2009.

5. Liao JM, Cao B, Zhou X og Lu H: Ny indsigt i p53-funktioner gennem dets målmikroRNA'er. J Mol Cell Biol 6: 206-213, 2014.

6. Zamble DB og Lippard SJ: Cisplatin og DNA-reparation i cancerkemoterapi. Trends Biochem Sci 20: 435-439, 1995.

7. Kleeff J, Kornmann M, Sawhney H og Korc M: Actinomycin D inducerer apoptose og hæmmer væksten af ​​bugspytkirtelkræftceller. Int J Cancer 86: 399-407, 2000.

8. Tacar O, Sriamornsak P og Dass CR: Doxorubicin: En opdatering om anticancer molekylær virkning, toksicitet og nye lægemiddelleveringssystemer. J Pharm Pharmacol 65: 157-170, 2013.

9. Efferth T, Li PC, Konkimalla VS og Kaina B: Fra traditionel kinesisk medicin til rationel kræftbehandling. Trends Mol Med 13: 353-361, 2007.