Echinacoside stimulerer celleproliferation og forhindrer celleapoptose i intestinale epiteliale MODE-K-celler ved opregulering af transformerende vækstfaktor- 1-ekspression

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yamin Jia, Qiunong Guan, Yuhai Guo og Caigan Du

Abstrakt

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) er blevet brugt i vid udstrækning som et afføringsmiddel i urtemedicin til behandling af irritabel tyktarm eller forstoppelse, ogechinacoside fra cistanche(ECH) er en af ​​de vigtigste bioaktive ingredienser i denne urte. Vores mål var at undersøge effekten af ​​ECH på tarmepitelcellevækst og -død. MODE-K, en intestinal epitelcellelinje, blev brugt som en in vitro-model af tarmen. Celleproliferation blev målt ved methylthiazoltetrazolium (MTT) assay. Celleapoptose blev bestemt med Annexin-V-farvning. Her viste vi, at i dyrkede MODE-K-celler stimulerede ECH signifikant celleproliferation og forbedrede celleoverlevelse ved at reducere celleapoptose i nærvær af H2O2 eller blandingen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, mens den transformerede vækstfaktor (TGF)- 1 ekspression blev opreguleret på en dosisafhængig måde. Nedbrydning af TGF- 1-ekspression forstyrrede både de proliferative og cytobeskyttende aktiviteter af ECH, hvilket blev yderligere bekræftet ved neutralisering af TGF- 1-aktivitet ved hjælp af anti-TGF- 1-antistof. Disse data tyder på, at ECH som en af ​​de bioaktive ingredienser i urte C. deserticola og andre kan forbedre slimhindevævsreparation ved at stimulere tarmepitelcelleproliferation og forhindre celledød via opregulering af TGF-.

Nøgleord: Cistanche deserticola, tarmepitel, celleproliferation, celleapoptose, transformerende vækstfaktor (TGF)-

Introduktion

Cistanche deserticola MA(C. deserticola) er almindeligvis kendt som Rou Cong Rong i kinesisk urtemedicin, og den er blevet en ny afgrøde i Kina på grund af dens medicinske anvendelse (1). Dets kliniske fordele er blevet rapporteret til behandling af mange sundhedsproblemer, herunder kronisk forstoppelse (2, 3), og dets gavnlige virkninger er forbundet med dets afførende aktivitet i tarmen; det forbedrer fugten af ​​afføringen, fremmer afføringen hos patienter (4, 5) såvel som i dyremodeller (6, 7). Vores nylige undersøgelse viser, at oral administration af et vandekstrakt af C. deserticola signifikant reducerer antallet af inflammatorisk hyperplasi i tarmen hos mus, der er tilbøjelige til kolorektal cancer (8).

Echinacoside fra cistanche (ECH) is a major component of phenylethanoid glycosides (PhG) (>50 procent af det samlede PhG) isoleret fra C. deserticola (9) og er blevet brugt som en biomarkør til kvalitetskontrol af det C. deserticola-holdige afføringsmiddel Ronggui Tongbian Capsule (10) eller til produktionskvalitetskontrol af kultiverede C. deserticola (11). ECH er blevet påvist at være cytobeskyttende både i en dyremodel for Parkinsons sygdom (12, 13) og en model for lungeskade (14) og i dyrkede fæokromocytomceller (PC12) (15, 16); og det har vist sig at forbedre cellulær deling af humane fibroblastiske celler (MRC-5) (17). I denne undersøgelse blev virkningen af ​​ECH som en væsentlig bioaktiv ingrediens i C. deserticola på celleproliferation og overlevelse i dyrkede tarmepitelceller undersøgt for at forstå den farmakologiske virkning af C. deserticola-holdige urtemedicin i behandlingen af ​​tarmsygdomme .

Materialer og metoder

Cellekultur

MODE-K er en intestinal epitelcellelinje afledt af C3H/HeJ-mus (18), som venligst blev leveret af Dr. Theodore Steiner (Vancouver Coastal Health Research Institute, Vancouver, Canada). MODE-K-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS) ved 37 grader under en 5 procent CO2 i luftatmosfære.

echinacoside fra cistanche (ECH) forberedelse

ECH (echinacoside fra cistanche) blev yderligere oprenset fra kommerciel C. tubulosa-ekstrakt (indeholdende mere end eller lig med 70 procent ECH, Tianlife TLCT-E70; Sinphar Tian-Li Pharmaceutical Co., Ltd., Hangzhou, Kina) ved gentagen ethanolekstraktion, efterfulgt af luft- tørring i et kemisk stinkskab. Det resterende stof blev yderligere tørret ved lyofilisering. ECH i slutproduktet blev bekræftet ved højtydende væskekromatografi (fig. 1).

Nedbrydning af transformerende vækstfaktor (TGF)- 1 udtryk

TGF- 1-ekspression i MODE-K-celler blev slået ned ved stabil ekspression af shRNA specifikt mod TGF- 1-transkript (19). Kort fortalt, oligonukleotidsekvenser til generering af shRNA-målrettet muse-TGF- 1-mRNA (5'-AAC CAA GGA GAC GGA ATA CAG-3') og ikke-specifik kontrol (forvrænget) (5'-AAT CGC ATA GCG TAT GCC GTT-3′) er tidligere beskrevet (19, 20), og de blev syntetiseret af Integrated DNA Technologies Inc. (Coralville, IA, USA). Hver sekvens blev ligeret ind i en pHEX-siRNA vektor (21). Vektorerne blev transficeret ind i MODE-K-celler under anvendelse af Lipofectamine2000 (Invitrogen-Gibco, Carlsbad, CA, USA) ved at følge producentens protokol. Både anti-TGF- 1 shRNA-transficerede (MODE-Ktgfb) og krypterede shRNA-transficerede (MODE-Kscr) celler blev dyrket i nærværelse af Zeocin (op til 500 ug/ml) (Invitrogen-Gibco) og udvalgt ved cellesortering ved hjælp af flowcytometri for grønt fluorescensprotein (GFP). Mere end 95 procent af de transficerede celler viste stærk grøn fluorescens i flowcytometri eller mikroskopi.

Methylthiazol tetrazolium (MTT) assay

MTT-assayet blev brugt til at måle celleproliferation eller levedygtighed i kulturer. Celler blev podet ved 25 00 pr. brønd i 96-brønds mikroplader, og hver tilstand blev testet i det mindste firedobbelt. Kort sagt, 10 μL 0,5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT; Sigma- Aldrich Canada, Oakville, ON, Canada) blev tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 grader i 4 timer. Formazan-krystallerne i levedygtige celler blev derefter opløst i 100 μL/brønd dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich Canada). Absorbansen af ​​farven i hver brønd blev kvantificeret som absorbansenheder (AU) ved 560 nm bølgelængde under anvendelse af en ELx808 Ultra Microplate Reader (BioTek, Winooski, VT, USA). Procentdelen af ​​celleproliferationsændring i lægemiddelbehandlede kulturer mod ikke-lægemiddelbehandlet kontrol blev beregnet som følger: procent=(lægemiddelbehandlet - kontrol) / kontrol × 100 procent. Væksthastigheden blev beregnet som følger: Væksthastighed (AU/dag)=(AUend − AUbegin) / tid (dag), hvor tiden repræsenterede undersøgelsesperioden, AUend repræsenterede absorbansenhederne ved afslutningen af ​​undersøgelsen , og AU begynder repræsenteret absorbansenhederne ved begyndelsen af ​​undersøgelsen.

Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) analyse af apoptose

FACS-analyse med Annexin-V-phycoerythrin (Annexin-V-PE) og 7-amino-actinomycin D (7-AAD) farvning blev brugt til bestemmelse af celleapoptose (Annexin-V positiv: tidlig apoptose ; 7-AAD: sen apoptose/nekrotisk) efter producentens protokol (BD Biosciences, San Jose, CA, USA). I FACS-grafen var levedygtige celler således i den nederste venstre kvadrant, sene apoptotiske celler i den øvre venstre kvadrant (kun 7-AAD-positive), apoptotiske celler i den øverste højre kvadrant (Både Annexin-V og {{ 10}}AAD positive) og tidlige apoptotiske celler i nederste højre kvadrant (kun annexin-V positiv). Kort sagt, efter behandling blev celler frigivet ved kort inkubation med trypsin-EDTA-opløsning (Sigma Aldrich Canada) og derefter inkuberet med Annexin-V-PE i 1 x bindingsbuffer i 15 min. Efter at de var blevet vasket med PBS, blev cellerne farvet med 7-AAD. Intensiteten af ​​fluorescens af apoptotiske celler blev målt ved hjælp af flowcytometri og analyseret sammenlignet med baggrundskontroller ved hjælp af CELLQUEST (BD Biosciences) eller FlowJo (Tree Star, Inc., Ashland, OR, USA) software.

Semikvantitativ revers transkription-polymerase kædereaktion (RT-PCR)

mRNA-niveauerne af TGF{{0}} blev semikvantitativt bestemt sammenlignet med niveauerne for glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) som en intern kontrol ved hjælp af RT-PCR-kits (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA ) som beskrevet tidligere (19). Både TGF- 1- og GAPDH-transkripter i det samme cDNA-præparat blev amplificeret ved PCR med 35 cyklusser på 94 grader i 1 minut, 57 grader i 1 minut og 15 sekunder og 72 grader i 1 minut og 30 sekunder efter den indledende denatureringstrin ved 94 grader i 1 min. Et sidste forlængelsestrin ved 72 grader i 10 minutter blev tilføjet. De specifikke primerpar for TGF- 1 og GAPDH blev afledt af en tidligere rapport (19) (mTGF- 1: sense, 5'-TAC TAT GCT AAA GAG GTC ACC CGC og antisense, 5 ′- CTG TAT TCC GTC TCC TTG GTT CAG; mGAPDH: sense, 5′-ATC ACT GCC ACC CAG AAG ACT G og antisense, 5′-CCC TGT TGC TGT AGC CGT ATT C). Det resulterende PCR-produkt (25 μL) blev udsat for elektroforese på en 1 procent agarosegel i Tris-acetat-EDTA (TAE) buffer indeholdende 0,5 ug/ml ethidiumbromid og visualiseret under UV-lys. Ekspressionsniveauerne af TGF- 1 blev semikvantitativt sammenlignet med GAPDH.

Western blot

Cellulære niveauer af TGF- 1 blev undersøgt ved western blotting som beskrevet tidligere (19). TGF- 1-proteinbånd i blottet blev identificeret med monoklonalt anti-TGF- 1 (A75-3) (BD Biosciences). Det samme blot blev re-probed ved hjælp af anti--actin IgG (Sigma-Aldrich Canada) til bekræftelse af ladet protein i hver prøve.

Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) Niveauerne af udskilt TGF- 1 i kultursupernatanter blev bestemt ved ELISA. MODE-K-celler (1,8 × 105 celler/brønd i 0,5 ml DMEM-medium) i 24-brøndsplader i tre eksemplarer blev dyrket natten over, efterfulgt af inkubation i fravær eller tilstedeværelse af ECH(echinacoside fra cistanche). Kultursupernatanterne blev opsamlet efter 24 timers behandling, og mængden af ​​TGF- 1-frigivelse blev bestemt ved anvendelse af TGF 1 Emax® ImmunoAssay System efter producentens protokol (Promega, Madison, WI, USA).

Statistiske analyser

En-vejs eller to-vejs variansanalyse (ANOVA) blev brugt som passende til sammenligninger mellem grupper. Data blev indsamlet fra 3 til 4 individuelle eksperimenter i hver undersøgelse til statistisk analyse. En P-værdi på mindre end eller lig med 0.05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Stimulering af celleproliferation i MODE-K cellekulturer

Celleproliferation er afgørende for vævsreparation. Effekten af ​​ECH(echinacoside fra cistanche)på celleproliferation blev undersøgt i dyrkede MODE-K-celler. Som vist i fig. 2A stimulerede tilsætningen af ​​ECH celleproliferation, målt ved stigningen i cellelevedygtighed ved anvendelse af MTT-assay, på en dosisafhængig måde. Sammenlignet med celleantallet i ikke-lægemiddelbehandlede kulturer blev celleantallet i ECH-behandlede dyrkede øget 25,6 procent ± 14,82 procent i kulturer med 6,26 ug/mL ECH, 33,6 procent ± 14,0 procent med 25 ug/mL ECH, 64,4 procent ± 9,0 procent med 50 ug/mL ECH og 99,4 procent ± 11,7 procent med 100 ug/ ml ECH efter 48-h inkubation (P < 0.0{{50}}01).="" for="" yderligere="" at="" bekræfte="" denne="" observation="" blev="" virkningen="" af="" ​​ech="" på="" mode-k="" cellevækstkurven="" i="" en="" {{30}}dages="" periode="" undersøgt.="" som="" vist="" i="" fig.="" 2b="" øgede="" tilsætningen="" af="" ​​optimeret="" 10="" ug/ml="" ech="" signifikant="" antallet="" af="" levedygtige="" celler="" efter="" inkubationstidspunktet="" sammenlignet="" med="" dem="" i="" ikke-lægemiddelbehandlede="" kulturer="" (en="" basal="" kontrol),="" angivet="" ved="" stigningen="" i="" au="" for="" kulturer="" med="" ech="" fra="" 0.3{{70}}="" ±="" 0.02="" ved="" begyndelsen="" af="" ​​ech-behandling="" (0-tidspunkt)="" til="" 1,49="" ±="" 0,08="" efter="" 2="" dages="" inkubation="" og="" 2,20="" ±="" 0,11="" efter="" 4="" dages="" inkubation,="" hvorimod="" for="" de="" ikke-lægemiddelbehandlede="" kulturer="" (kun="" medium)="" var="" stigningen="" fra="" 0,24="" ±="" 0,01="" i="" begyndelsen="" til="" 1,22="" ±="" 0,12="" efter="" 2="" dage="" og="" ±="" 1,6="" dage.="" efter="" 4="" dage="" (medium="" vs.="" ech,="" p="">< 0,0001).="" væksthastighederne="" i="" disse="" to="" kulturer,="" beregnet="" ud="" fra="" vækstkurven="" (fig.="" 2b),="" indikerede,="" at="" ech="" signifikant="" forbedrede="" væksthastighederne="" i="" kulturer="" på="" både="" dag="" 2="" (0,56="" i="" ech-behandlede="" kulturer="" mod="" 0,35="" i="" ikke-lægemiddelbehandlede="" kontroller)="" og="" dag="" 3="" (0,43="" i="" ech-behandlede="" kulturer="" vs.="" 0,22="" i="" ikke-lægemiddelbehandlede="" kontroller)="" (fig.="" 2c).="" tilsammen="" indikerer="" disse="" data,="" at="" ech="" stimulerer="" celleproliferation="" i="" dyrkede="">

Fig. 2. Stimulering af cellevækst i dyrkede tarmepitelceller med ECH. MODE-K-celler (2,500 celler/brønd) blev podet i 96-brøndsplader natten over, efterfulgt af inkubation i nærvær eller fravær af ECH. Antallet af levedygtige celler i kulturer blev målt ved MTT-assay. A) Kulturer blev behandlet med forskellige koncentrationer af ECH i 48 timer. Stigningen (procent) i celleantal i ECH-behandlede kulturer blev beregnet baseret på de ikke-lægemiddelbehandlede kulturer som en basal reference. P < 0,0001="" (envejs="" anova).="" b)="" kulturer="" blev="" behandlet="" med="" 10="" ug/ml="" ech="" i="" 4="" dage.="" vækstkurver="" for="" ech-behandlede="" vs.="" ikke-lægemiddelbehandlede="" kulturer="" (kun="" medium)="" blev="" bestemt="" af="" absorbansenhederne="" (au)="" ved="" 560="" nm="" i="" mtt-assayet.="" p="">< 0,0001="" (medium="" vs.="" ech,="" to-vejs="" anova).="" data="" præsenteres="" som="" middelværdi="" ±="" standardafledning="" (sd)="" af="" uafhængige="" eksperimenter.="" c)="" væksthastighed="" (au-ændring/dag)="" blev="" beregnet="" ud="" fra="" væksten="">e, det gennemsnitlige antal på hver dag.

Beskyttelse af MODE-K-celler mod apoptose

Beskyttelse af celler mod apoptose er en mekanisme til at forhindre yderligere vævsskade. Den cytobeskyttende aktivitet af ECH(echinacoside fra cistanche)blev undersøgt i dyrkede MODE-K-celler stimuleret med hydrogenperoxid (H2O2) eller pro-inflammatorisk cytokinblanding (TNF- og IFN-). H2O2 er en reaktiv oxygenart genereret af oxidativ metabolisme og repræsenterer et scenarie med oxidativt stress, mens TNF- og IFN- er fremtrædende cytokiner produceret af aktiverede immunceller, der afspejlede situationen under den immunmedierede inflammation. Som vist i fig. 3 reducerede tilsætningen af ​​ECH (50 ug/mL) signifikant apoptose inklusive dets basale niveau i kulturer behandlet med H2O2, hvilket fremgår af et fald i apoptose fra de basale niveauer på 5,3{{47 }} procent ± 1,24 procent i ikke-lægemiddelbehandlede kulturer til 3,76 procent ± 1.01 procent i ECH-behandlede kulturer, fra 26,93 procent ± 1.86 procent i ikke-lægemiddelbehandlede kulturer til 14,08 procent ± 1,30 procent i ECH-behandlede kulturer i nærvær af 0,3 μM H2O2 og fra 38,90 procent ± 1,76 procent i ikke-lægemiddelbehandlede kulturer til 19,88 procent ± 1,02 procent i ECH-behandlede kulturer i nærværelse af 0,6 µM H2O.0 , medium/ikke-lægemiddelbehandlet vs. ECH-behandlet). En lignende cytobeskyttende virkning af ECH blev set i kulturerne stimuleret med cytokinblanding (fig. 4); apoptose (51,5 procent ± 6,30 procent) i kulturer uden tilsætning af ECH (medium/ikke-lægemiddel-behandlede kontroller) var signifikant højere end (38,50 procent ± 5,60 procent) i ECH-behandlede kulturer (P=0.0204, medium/ikke-lægemiddel-behandlet vs. ECH-behandlet), hvilket tyder på, at ECH beskyttede MODE-K-celler mod pro-inflammatorisk cytokin-induceret apoptose. Tilsammen har ECH cytobeskyttende aktivitet mod celleapoptose induceret af H2O2-oxidation såvel som cytotoksiciteten af ​​pro-inflammatoriske cytokiner.

Opregulering af TGF-ekspression i dyrkede MODE-K-celler

Beviser i litteraturen tyder på, at TGF- 1 spiller en vigtig rolle i vævsskade og reparation (22, 23) og i genopretningen af ​​mave-tarmkanalen fra colitis eller inflammatorisk tarmsygdom (24). For at undersøge, om TGF- 1 spiller en rolle i ECH-induceret celleproliferation og cytobeskyttelse i dyrkede tarmepitelceller som vist ovenfor, er effekten af ​​ECH(echinacoside fra cistanche)på TGF{0}}-ekspression i dyrkede MODE-K-celler blev undersøgt. Transkriptniveauerne af TGF- 1 blev undersøgt ved semikvantitativ RT-PCR, mens dets proteinniveauer blev bestemt ved western blotting (totale cellulære niveauer) eller ved ELISA (udskilte proteinniveauer). Som vist i fig. 5A blev den dosisafhængige opregulering af TGF- 1-mRNA-niveauer set i kulturer behandlet med ECH både 24 og 48 timer efter tilsætningen af ​​ECH. En lignende tendens til stigning i TGF{{10}}-proteinniveauer inde i cellerne blev påvist ved western blotting-analyse (fig. 5B). Efter 24- timers inkubation i 0,5 ml dyrkningsmedium indeholdende forskellige koncentrationer af ECH, blev de udskilte niveauer af TGF- 1 også øget på en dosisuafhængig måde; fra 186,4 ± 18,39 pg/ml i ikke-lægemiddelbehandlede kulturer (basale niveauer) til 186,4 ± 18,39 pg/ml i kulturer med 25 ug/ml ECH, 263,4 ± 14,14 pg/ml med 50 ug/mL af 6 ug/mL og ± 6 ug/mL 15,56 pg/ml med 100 ug/ml ECH (P < 0,0001).="" alle="" disse="" data="" indikerer="" klart,="" at="" ech="" øger="" tgf-="" 1-produktion="" i="" tarmepitelceller="" i="">

Tab af vækststimulering og cytobeskyttelse af Echinacoside ved genetisk knockdown af TGF- 1-ekspression

For at afklare, om TGF- 1 bidrog til vækststimulering og apoptosereduktion i ECH(echinacoside fra cistanche)-behandlede celler blev TGF- 1-ekspression i MODE-K-celler slået ned ved stabilt at udtrykke anti-TGF- 1-shRNA, hvorved en ny cellelinje MODE-Ktgfb blev genereret. TGF- 1-proteinekspression blev stort set reduceret i MODE-Ktgfb-celler sammenlignet med den i MODE-Kscr-celler, der stabilt udtrykte krypteret shRNA (fig. 6A). Som vist i fig. 6B var den proliferative stimulering af ECH signifikant svækket i MODE-Ktgfb-celler; svarende til den proliferative respons på ECH i parentale MODE-K-celler (fig. 2), blev antallet af levedygtige celler øget i MODE-Kscr-celler efter ECH-stimulering, 28,3 procent ± 12,4 procent stigning i kulturer med 25 ug/mL ECH, 54,2 procent ± 6,8 procent stigning med 5{{30}} ug/mL ECH og 122,7 procent ± 20,8 procent stigning i kulturer med 100 ug/mL ECH. I modsætning hertil blev celleantallet faldet i nærvær af ECH i MODE Ktgfb cellekulturer, 12,0 procent ± 5,0 procent fald i kulturer med 25 ug/mL ECH, 18,3 procent ± 4,1 procent fald med 50 ug/mL ECH, og 30,4 procent ± 3,3 procent faldt med 100 ug/mL ECH. Statistisk analyse med to-vejs ANOVA indikerede den signifikante forskel i proliferativ respons på ECH mellem disse to grupper (P < 0,0001).="" disse="" data="" tyder="" på,="" at="" tab="" af="" tgf-="" 1-ekspression="" i="" tarmepitelceller="" svækker="" vækststimulering="" af="">

For yderligere at undersøge, om det opregulerede TGF- 1 udtryk i ECH(echinacoside fra cistanche)-behandlede celler resulterede i apoptosereduktion, den anti-apoptotiske aktivitet af ECH blev undersøgt i MODE-Ktgfb-celler versus MODE-Kscr-celler. Som vist i fig. 6C, sammenlignet med MODE-Kscr cellekulturer, var niveauerne af apoptose højere i MODE-Ktgfb cellekulturer i fravær af cytokiner (11,2 procent ± 0,42 procent i MODE-Ktgfb vs. 9,6 procent ± 0,99 procent i MODE-Kscr) og i nærværelse af cytokiner (20,95 procent ± 0.07 procent i MODE- Ktgfb vs. 15,4 procent ± 1,56 procent i MODE-Kscr) (P=0.0{{60}}13), hvilket tyder på, at TGF- 1 er en anti -apoptotisk faktor i MODE K-celler. Tilsætningen af ​​ECH (50 ug/mL) til MODE-Kscr-cellekulturer reducerede de basale niveauer af apoptose signifikant (9,6 procent ± 0,99 procent hos ikke-lægemiddelbehandlede vs. 8,3 procent ± 0,43 procent i ECH-behandlede), og 30,2 procent af apoptosereduktion blev fundet i cytokin-stimulerede kulturer (15,4 procent ± 1,56 procent i ikke-lægemiddelbehandlede vs. 10,75 procent ± 1,05 procent i ECH-behandlede). I MODE-Ktgfb-cellekulturer reducerede ECH imidlertid ikke de basale niveauer af apoptose (11,2 procent ± 0,42 procent i ikke-lægemiddelbehandlede vs. 12,0 procent ± 0,43 procent i ECH-behandlede), og kun 16,71 procent af apoptose-reduktion, sammenlignet med 30,2 procent i MODE-Kscr-cellekulturer blev set i cytokin-stimulerede kulturer (20,95 procent ± 0,07 procent i ikke-lægemiddelbehandlede vs. 17,45 procent ± 0,35 procent i ECH-behandlede). Disse data indikerer, at nedbrydning af TGF- 1-ekspression i tarmepitelceller forværrer apoptose og nedsætter den cytobeskyttende aktivitet af ECH.

Tab af vækststimulering og cytobeskyttelse af ECH(echinacoside fra cistanche)ved neutralisering af TGF- 1 aktivitet ved hjælp af antistof

For yderligere at bekræfte, at TGF- 1 muligvis er påkrævet til vækststimulering og cytobeskyttelse af ECH(echinacoside fra cistanche)i tarmepitelceller som beskrevet ovenfor (fig. 6), virkningen af ​​neutraliserende anti-TGF- 1-antistof (Klon 9016; R&D Systems Inc. Minneapolis, MN, USA) på ECH-medieret celleproliferation og overlevelse blev undersøgt i MODE-K cellekulturer. Som vist i fig. 7A stimulerede tilsætningen af ​​ECH (25 ug/mL) en stigning på 44,3 procent ± 8,2 procent i celleantal i ikke-antistofbehandlede kontroller, men i nærvær af anti-TGF- 1 antistof 11,3 procent ± 9,10 procent tab i celleantallet blev set i de samme ECH-behandlede kulturer, hvilket tyder på, at neutraliserende TGF- 1-aktivitet mindskede vækststimuleringen af ​​ECH i tarmepitelceller. De yderligere eksperimenter viste, at anti-TGF- 1-antistoffet også neutraliserede den cytobeskyttende aktivitet af ECH i MODE-K-cellekulturer; tilføjelsen af ​​ECH reducerede apoptosen fra 4,37 procent ± 1,19 procent i ikke-lægemiddelbehandlede kulturer til 1,72 procent ± {{50}},01 procent i ECH-behandlede kulturer efter 24 timers inkubation og fra 11,13 procent ± 1,12 procent i ikke-lægemiddelbehandlede kulturer til 9,13 procent ± 0,02 procent i ECH-behandlede kulturer efter 48 timers inkubation (ikke-lægemiddel/medium vs. ECH, to-vejs ANOVA, P=0.0001). I nærvær af anti-TGF- 1 antistof apoptosen i ECH-behandlede kulturer (2,88 procent ± 0,01 procent efter 24- timers inkubation; 12,58 procent ± 0,02 procent efter 48- timers inkubation ) adskilte sig ikke signifikant fra dem i kontrolkulturer (ikke-lægemiddelbehandlede) (to-vejs ANOVA, P=0.9427), hvilket antyder, at anti-TGF- 1 antistof interfererer med ECH-medieret overlevelse i tarmen epitelceller.

Diskussion

ECH(echinacoside fra cistanche)er ikke kun en vigtig PhG i ekstraktet af urte Cistanche spp. men findes også i mange andre lægeplanter såsom Echinacea spp. (25, 26). Denne naturlige forbindelse er blevet rapporteret at have antioxidantaktivitet in vitro og in vivo (13, 27, 28). Imidlertid forbliver mekanismen/mekanismerne for dets virkning ukendt. Vores resultater fra denne undersøgelse viser for første gang i en in vitro-model, at ECH stimulerer tarmepitelcelleproliferation og overlevelse, som er afhængig af TGF- 1.

Tilføjelsen af ​​ECH(echinacoside fra cistanche)reducerer celleapoptose i H2O2- eller pro-inflammatorisk cytokinblanding (TNF- og IFN- )-behandlede MODE-K-celler (fig. 3 og 4) og også i andre celletyper (16, 29), og nedbrydning af TGF- 1-ekspression eller blokering af dets aktivitet resulterer i ophævelse af dets anti-apoptotiske aktivitet (fig. 6 og 7), hvilket indikerer, at cytobeskyttelsen af ​​ECH afhænger af TGF- 1-produktion (fig. 5). Vores tidligere undersøgelse har vist, at TGF- 1 inducerer anti-apoptotisk Bcl-2-ekspression og forhindrer TNF-medieret apoptose i renale tubulære epitelceller (19). Lignende fund er blevet rapporteret i andre celletyper; tilsætning af TGF- 1 i dyrkede pulmonale arterie-endotelceller opregulerer basislinjeniveauet af Bcl-2 og forhindrer apoptose induceret af serumdeprivation og vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF)-receptorblokade (30); og i dyrkede neurale progenitorceller (NPC'er) øger det (med ca. 76 procent) celleoverlevelse mod H2O2-behandling, hvilket er korreleret med opregulering af Bcl-2-ekspression (31). Selvom effekten af ​​ECH på Bcl-2-ekspression i MODE-K-celler ikke er undersøgt i denne undersøgelse, er korrelationen af ​​Bcl-2-opregulering med den anti-apoptotiske aktivitet af ECH blevet rapporteret i TNF - –behandlede SHSY5Y neuronale celler (29) eller H2O2-behandlede PC12-celler (15). Tilsammen tyder disse data på, at den anti-apoptotiske aktivitet af ECH kan medieres af TGF- 1 via en Bcl-2-vej.

Det er muligt, at cytobeskyttelsen af ​​ECH(echinacoside fra cistanche)kunne bidrage til en lille stigning i antallet af levedygtige celler ved at mindske spontan celledød ved afslutningen af ​​inkubationen, men tilsætningen af ​​ECH (100 ug/mL) fordobler næsten de levedygtige celler efter 48- timers behandling (fig. 2A) , hvilket tyder på, at ECH faktisk stimulerer celleproliferation, hvilket yderligere bekræftes af dataene i fig. 2, B og C. En lignende effekt af ECH er blevet rapporteret i humane fibroblastiske celler, MRC-5 (17): i MRC{ {6}} cellekulturer, kunne ECH forsinke cellulær senescens ved at inducere cellecyklussen fra G1-fasen til S-fasen og G2-fasen. Ligesom den anti-apoptotiske aktivitet af ECH, er den proliferative aktivitet af ECH afhængig af TGF - 1 (fig. 6 og 7), der er blevet veldokumenteret for at være et multifunktionelt cytokin (32, 33). TGF- kan stimulere celleproliferation eller inducere vækststop afhængigt af celletypen eller det ekstracellulære mikromiljø; det aktiverer flere signalveje inklusive Smads og ikke-Smads (f.eks. de mitogenaktiverede proteinkinaser) (34, 35), men hvilken vej der medierer ECH/TGF-stimuleret celleproliferation i MODE-K-celler kræver yderligere undersøgelse.

Til dato er lidt kendt om ECH's målprotein(er).(echinacoside fra cistanche)eller den eller de signalveje, den regulerer. En undersøgelse viser, at ECH-behandling øger de cellulære niveauer af cyklisk guanosinmonofosfat (cGMP) i endotelceller (36), og tilføjelsen af ​​8-Brom-cGMP øger TGF- 1-ekspressionen i hjertefibroblaster beskedent (37 ). Hvorvidt ECH-behandling hæver cGMP, og hvorved ECH stimulerer TGF- 1-ekspression i dyrkede tarmepitelceller, skal imidlertid undersøges nærmere.

Som konklusion viser vores undersøgelse, at ECH(echinacoside fra cistanche)inducerer TGF- 1-produktion, der medierer celleproliferation og celleoverlevelse i dyrkede tarmepitelceller. TGF-signalering i tarmepitel er påkrævet til reparation eller heling af slimhindeskader hos mus med dextransulfat-natrium-induceret colitis (38), hvilket tyder på, at ECH, måske ECH-holdig urte C. deserticola eller andre, kan have terapeutisk potentiale til at fremme slimhindeskade reparation hos patienter.

Anerkendelse

YJ blev støttet af et kandidatstipendium fra China Scholarship Council, Kina.

Referencer

1 Xu R, Chen J, Chen SL, Liu TN, Zhu WC, Xu J. Cistanche deserticola Ma dyrket som en ny afgrøde i Kina. Genet Resour Crop Evol. 2009;56:137-142.

2 Jiang Y, Tu PF. Analyse af kemiske bestanddele i Cistanche-arter. J Chromatogr A. 2009;1216:1970-1979.

3 Tu PF, Wang B, Deyama T, Zhang ZG, Lou ZC. [Analyse af phenylethanoidglycosider af Herba Cistanchis ved RP-HPLC]. Yao Xue Xue Bao (Acta Pharm Sin). 1997;32:294-300. (tekst på kinesisk med engelsk abstrakt)

4 Huang X, Li Z. [Klinisk effekt af Cistanche-holdig opløsning til behandling af obstipation efter slagtilfælde]. Zhongguo Zhang Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integrated Trad West Med). 2002;22:622-623. (på kinesisk)

5 Zhang B, Lu X, Zhang R, Li L, Li C. [Undersøgelse om den afførende virkning af Cistanche deserticola]. Zhong Yao Cai (J Chin Med Mater). 1992;15:33-35. (på kinesisk)

6 Tu P, Li S, Li Z, Wang C, Lou Z. [Sammenligning om fugtning af tarmene og afføring af herba Cistanches]. Nat Prod Res Dev. 1997;11:48-51. (tekst på kinesisk med engelsk abstrakt)

7 Zhang B, Zhao X, Chen S, Liu L, Cheng H. [Lakserende virkning af adskilte dele fra herba Cistanche]. Zhongguo Zhongyiyao Xinxi Zazhi (Chin J Inform Trad Chin Med). 2003;10:31-32. (tekst på kinesisk med engelsk abstrakt)

8 Jia Y, Guan Q, Guo Y, Du C. Reduktion af inflammatorisk hyperplasi i tarmen hos tyktarmskræfttilbøjelige mus ved hjælp af vandekstrakt af Cistanche deserticola. Phytother Res. I tryk.

9 Cai RL, Yang MH, Shi Y, Chen J, Li YC, Qi Y. Antifatigue aktivitet af phenylethanoid-rigt ekstrakt fra Cistanche deserticola. Phytother Res. 2010;24:313-315.

10 Jing M, Song S, Li J. [Undersøgelse af Ronggui Tongbian kapselekstraktion og rensningsproces]. Moderne Chin Med. 2009;11: 18-20. (tekst på kinesisk med engelsk abstrakt)

11 Wu Y, Shi HM, Bao Z, Wang MY, Tu PF, Li XB. Anvendelse af molekylære markører til at forudsige produktionskvalitet af dyrkede Cistanche deserticola. Biol Pharm Bull. 2010;33:334-339.

12 Geng X, Tian X, Tu P, Pu X. Neuroprotektive virkninger af echinacosid i muse-MPTP-modellen af ​​Parkinsons sygdom. Eur J Pharmacol. 2007;564:66-74.

13 Zhao Q, Gao J, Li W, Cai D. Neurotrofiske og neurorescue virkninger af Echinacoside i den subakutte MPTP-musemodel af Parkinsons sygdom. Brain Res. 2010;1346:224-236.

14 Zhang Y, Xing J, Ai T, Wen T, Guan L, Zhao J. Beskyttelse af echinacosid mod akut lungeskade forårsaget af oliesyre hos rotter. Free Radic Res. 2007;41:798-805.

15 Kuang R, Sun Y, Yuan W, Lei L, Zheng X. Beskyttende virkninger af echinacoside, et af phenylethanoid-glycosiderne, på H2O2--induceret cytotoksicitet i PC12-celler. Planta Med. 2009;75: 1499-1504.

16 Kuang R, Sun Y, Zheng X. Undertrykkelse af nitrogenoxid impliceret i den beskyttende effekt af echinacosid på H2O2-induceret PC12-celleskade. Nat Prod Commun. 2010;5:571-574.

17 Xie H, Zhu H, Cheng C, Liang Y, Wang Z. Echinacoside hæmmer cellulær senescens af humane fibroblastiske celler MRC-5. Pharmazie. 2009;64:752-754.

18 Vidal K, Grosjean I, Evillard JP, Gespach C, Kaiserlian D. Immortalisering af museintestinale epitelceller af SV40- store T-genet. Fænotypisk og immun karakterisering af MODE-K cellelinjen. J Immunol Methods. 1993;166:63-73.

19 Guan Q, Nguan CY, Du C. Ekspression af transformerende vækstfaktor-beta1 begrænser nyreiskæmi-reperfusionsskade. Transplantation. 2010;89:1320-1327.

20 Hwang M, Kim HJ, Noh HJ, Chang YC, Chae YM, Kim KH, et al. TGF-beta1 siRNA undertrykker tubulointerstitiel fibrose i nyren af ​​ureteral obstruktion. Exp Mol Pathol. 2006;81: 48-54.

21 Du C, Wang S, Diao H, Guan Q, Zhong R, Jevnikar AM. Øget modstand af tubulære epitelceller mod apoptose ved shRNA-terapi forbedrer nyreiskæmi-reperfusionsskade. Am J Transplantation. 2006;6:2256-2267.

22 Douglas HE. TGF-ss i sårheling: en gennemgang. J Sårpleje. 2010;19:403-406.

23 Grande JP. Rolle af transformerende vækstfaktor-beta i vævsskade og reparation. Proc Soc Exp Biol Med. 1997;214:27-40.

24 Monteleone G, Boirivant M, Pallone F, MacDonald TT. TGF beta1 og Smad7 i reguleringen af ​​IBD. Mucosal Immunol. 2008;1 Suppl 1:S50–S53.

25 Bauer R, Foster S. Analyse af alkamider og koffeinsyrederivater fra Echinacea simulate og E. paradoxa root. Planta Med. 1991;57:447-449.

26 Perry NB, Burgess EJ, Glennie VL. Echinacea standardisering: analytiske metoder for phenolforbindelser og typiske niveauer i medicinske arter. J Agric Food Chem. 2001;53:849-857.

27 Pellati F, Benvenuti S, Magro L, Melegari M, Soragni F. Analyse af phenolforbindelser og radikalopfangende aktivitet af Echinacea spp. J Pharm Biomed Anal. 2004;35:289-301.

28 Wu Y, Li L, Wen T, Li YQ. Beskyttende virkninger af echinacosid på kultetrachlorid-induceret hepatotoksicitet hos rotter. Toksikologi. 2007;232:50–56.

29 Deng M, Zhao JY, Tu PF, Jiang Y, Li ZB, Wang YH. Echinacoside redder SHSY5Y neuronale celler fra TNFalpha-induceret apoptose. Eur J Pharmacol. 2004;505:11-18.

30 Lu Q. Transformerende vækstfaktor-beta1 beskytter mod pulmonal arterie endotelcelleapoptose via ALK5. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008;295:L123-L133.

31 Park SM, Jung JS, Jang MS, Kang KS, Kang SK. Transformering af vækstfaktor-beta1 regulerer skæbnen for dyrkede rygmarvs-afledte neurale stamceller. Cell Prolif. 2008;41:248-264.

32 Massague J. Hvordan celler læser TGF-beta-signaler. Nat Rev Mol Cell Biol. 2000;1:169-178.

33 Rahimi RA, Leof EB. TGF-beta-signalering: en fortælling om to svar. J Cell Biochem. 2007;102:593-608.

34 Moustakas A, Heldin CH. Ikke-Smad TGF-beta-signaler. J Cell Sci. 2005;118:3573-3584.

35 Schmierer B, Hill CS. TGF beta-SMAD signaltransduktion: molekylær specificitet og funktionel fleksibilitet. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8:970-982.

36 He WJ, Fang TH, Ma X, Zhang K, Ma ZZ, Tu PF. Echinacoside fremkalder endotelafhængig afslapning i rotteaortaringe via en NO-cGMP-vej. Planta Med. 2009;75:1400-1404.

37 Abdelaziz N, Colombo F, Mercier I, Calderone A. Nitrogenoxid dæmper ekspressionen af ​​transformerende vækstfaktor-beta3-mRNA i rottehjertefibroblaster via destabilisering. Forhøjet blodtryk. 2001;38:261-266.

38 Beck PL, Rosenberg IM, Xavier RJ, Koh T, Wong JF, Podolsky DK. Transformering af vækstfaktor-beta medierer intestinal heling og modtagelighed for skade in vitro og in vivo gennem epitelceller. Am J Pathol. 2003;162:597-608.