DEL Ⅰ:SARS-CoV-2-infektion påvirker væv inklusive hjerte og nyre

for flere oplysninger:ali.ma@wecistanche.com

DEL Ⅰ:SARS-CoV-2-infektion i den syriske hamster-model forårsager betændelse såvel som type I interferon dysregulering i både respiratoriske og ikke-respiratoriske væv, herunder hjerte og nyre

Magen Ellen Francis, Una Goncin & et al.

Introduktion

SARS-CoV-2(alvorlig akutrespiratoriskecoronavirus 2), som forårsager COVID-19 (coronavirus 2019) dukkede op i slutningen af ​​2019 med efterfølgende massive folkesundhedsmæssige og økonomiske konsekvenser[1,2].SARS-CoV-2er et enkeltstrenget RNA-virus med positiv sans fra familien Coronoviridae, slægten Betacoronavirus[3], og har siden dets fremkomst ført til over 170 millioner bekræftede tilfælde og 3,5 millioner dødsfald på verdensplan pr. 1. juni 2021 [4]. Selvom man tidligere mente, at coronavirusinfektioner hos mennesker kun forårsagede milde, forkølelseslignende symptomer, er de nyere coronavirusser, der dukker op, SARS-CoV (svær akutrespiratoriskecoronavirus) og MERS-CoV (Mellemøstenrespiratoriskesyndrom coronavirus), er forbundet med en bred vifte afrespiratoriskeog ikke-respiratoriske symptomer[5,6], varierende fra milde til svære, hvilket fører til organsvigt og død [Z. Asymptomatiske tilfælde er også blevet rapporteret[8]. I betragtning af byrden på folkesundheden såvel som omfanget af sygdommens sværhedsgrad udvikler dyremodeller for at studereSARS-CoV-2patogenese og identificere modforanstaltninger er af stor betydning. In vivo vurdering af værtsrespons på viral infektion er afgørende for at identificere værtsfaktorer, der regulerer alvorlig sygdom, samt biomarkører, der kan hjælpe med at informere patientstøttende plejeforanstaltninger.

Vurdering af værtssvar vedrSARS-CoV-2har ført til værdifuld indsigt i sygdomsprogression og mulige immunmekanismer, der fører til alvorlig sygdom. Det er nu blevet bredt vist, at alvorlige tilfælde af COVID-19 hos mennesker ofte ledsages af øget ekspression af inflammatoriske gener, herunder Interleukin-6(IL-6), Interleukin-1 beta(IL-1beta) og Tumor Necrosis Factor (TNF) [9-11]. FørSARS-CoV-2, var det kendt, at coronavirus var i stand til at regulere type I interferon-responsen[12,13]. Adskillige undersøgelser har fundet ud af, at type I interferon-reaktioner er signifikant sløvede underSARS-CoV-2infektion, der tyder på, at dette også kan bidrage til dårlige COVID-19-resultater[14,15]. Disse kliniske data tyder på potentielle markører for patogenese til yderligere eksperimentelle undersøgelser.

Syriske hamstere var en af ​​en håndfuld dyrearter, der tidligt under pandemien blev identificeret for at være produktivt inficeret medSARS-CoV-2og af potentiel anvendelse til præklinisk udvikling og in vivo analyse[l6]. Hamstere blev oprindeligt bestemt til at være modtagelige for SARS-CoV [17] og har siden vist sig at være en model forSARS-CoV-2[18]. Hamstere er i stand til at støtteSARS-CoV-2replikation inden for den nedrerespiratoriskekanal[18-20] med nogle ligheder med infektionen og sygdomsdynamikken som hos mennesker, selvom infektionstidsforløbet synes at være kortere hos hamstere[21]. Ildere har ikke vist sig at understøtte infektion i lungen, da virussen kun er blevet påvist i den øvre delrespiratoriskekanal, hvilket tyder på, at denne model kan være nyttig til transmissionsundersøgelser[22]. Derudover har mus ikke vist sig at være modtagelige for den oprindelige WuhanSARS-CoV-2virus. Hamstere har også vist sig at give et effektivt antistofrespons og er blevet brugt til både COVID-19-vaccine- og behandlingsundersøgelser[19,20,23]. Som med andre ikke-traditionelle dyremodeller er der mangel på hamsterspecifikke biologiske reagenser til karakterisering af immunresponser og mekanismerne for patogenese[24].

Her undersøgte vi immunresponset og patogenesen afSARS-CoV-2infektion hos hamstere for at bestemme sygdomsmekanismer og involvering af specifikke organer såsom lungerne,hjerte, ognyreda COVID-19 er en multisystemsygdom.SARS-CoV-2inokulerede syriske hamstere blev udtaget over et 15-dagkursus til virologisk og immunologisk analyse ved qRT-PCR, transkriptomanalyse, virustitreringsassays og immunhistokemi (IHC). Detrespiratoriskekanalen havde en høj byrde med at replikere virussen i både de øvre og nedre regioner med specifik afstumpning af type I-interferonrespons. Mens vi fandt lidt tegn på infektiøs virus udenforrespiratoriskevirus-RNA var til stede i flere organer, herundernyrer, hjerte, lymfeknude og lever med samtidig ekspression af inflammatoriske mediatorer såsom IL-6, TNF og IL-1beta. Lungen, såvel som ekstrapulmonale organer, viste tegn på inflammatorisk celleinfiltration, der førte til vævsskade. Tilsammen har vi defineret hamstermodellen for immunopatogenese i sammenhæng med COVID-19, som kan bruges til at identificere korrelater af beskyttelse og sygdom til evaluering af medicinske modforanstaltninger.

Klik til cistanche effekter for nyresygdom

Resultater

SARS-CoV-2-inokulerede hamstere har vægttab, der korrelerede med viral belastning, infektiøs virus irespiratorisketarmkanalen og viralt RNA i ikke-respiratorisk væv

Syriske hamstere er modtagelige for infektion medSARS-CoV-2tyder på, at de kan være værdifulde til undersøgelse af immunopatologi og sygdomsmekanismer[20]. Hamstere er i alderen 6-8 uger blev inokuleret intranasalt medSARS-CoV-2 at 10° TCIDs0. The animals were monitored for temperature and weight throughout the course of the infection. As typical during viral infection in small animals, hamsters began showing a decrease in temperature by day 1 post-inoculation(pi)(S1A Fig)which returned to baseline between day 3 and 7 (S1B Fig). Inoculated hamsters began losing weight on day 2 pi, with weights being significantly different from baseline on days 3 to 7. Weight loss was most severe on day 6 pi where the average body weight of the inoculated animals was 88.26% of the original weight (Fig 1A). After day 6, there was a steady increase in weight over the remaining time course on average recovering to baseline by day 12. Individual animals showed two different trajectories of weight loss: mild (~4%weight loss) and severe(>15 procent vægttab)(Fig1B). Ingen dyr tabte mere end 20 procent af deres oprindelige vægt og nåede også andre kriterier for det humane endepunkt som defineret i metoderne under undersøgelsen. Dyr blev fjernet fra undersøgelsen på forudbestemte slutdage til prøveopsamling, derfor er individuelle vægte for alle dyr ikke vist.

COVID-19 påvirker flere organsystemer hos mennesker, herunderhjerte, nyrer, lever, milt og tyktarm[25,26]. Derfor var vi interesserede i at bestemme virussens tropisme og tilhørende immunopatologi i hele kroppen af ​​inficerede hamstere for at få indsigt i sygdommen. Dyr blev fjernet fra undersøgelsen på dagene 0,2,5,8,12 og 15pi for at vurdere vævsspecifikke responser til obduktion og analyse af immunopatologien. Blod, næseskyl og væv (respiratoriskeog ikke-respiratoriske) blev indsamlet. Viral tropisme blev vurderet ved qRT-PCR forSARS-CoV-2envelope-gen(E) og virustitrering med Tissue Culture Infectious Dose 50(TCIDs0)-assays (Fig2). E-genekspressionsanalyse er repræsenteret af brune cirkler på graferne. Analyse afrespiratoriskekanalen afslørede vRNA til stede i nasale turbinater, luftrøret og alle fire testede lungelapper (højre kranie, højre midterste, højre kaudal og tilbehør) på dag 2, 5 og 8 pi. Viralt RNA blev stadig påvist i den højre midterste lungelap og den accessoriske lungelap fra et dyr på dag 12 pi. Levende viral titeranalyse, repræsenteret ved de grå cirkler, indikerede, at infektiøs virus var til stede i de nasale turbinater på dag 2 (7,5 TCID'er0/mL(Logl0)) og 5 (6 TCID'er{{ 11}}/mL(Logl0))pi. Infektiøs virus toppede i lungerne på dag 2, ved ~9 TCID'er/ml(Log10) i højre midterlunge og var til stede indtil dag 5. Luftrøret havde de laveste virusniveauer af allerespiratoriskevæv, som kun var til stede på dag 2 (~3 TCIDso/mL(Logl0)).vRNA blev også påvist i ikke-respiratorisk væv, inklusivehjerte, nyre, tyktarm og den mediastinale lymfeknude ved lave til moderate niveauer. Den mediastinale lymfeknude havde det højeste niveau af vRNA, ~5 TCID'er (Log10), og var det eneste ikke-respiratoriske væv, der var positivt for infektiøst virus.

Fig 1. Intranasal SARS-CoV-2-infektion hos hamstere fører til betydeligt vægttab.Syriske hamstere blev inokuleret intranasalt med det alvorlige akutterespiratoriskesyndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ved 105 TCID50. Vægt (A og B) blev registreret i 15 dage efter inokulering. Gennemsnitlige resultater (A) viser middelværdien. Individuelle resultater repræsenterer hvert dyr (B). angiver en p-værdi<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" standard="" error="">

For at bestemme, om virusopløsning skyldtes fremkaldelse af neutraliserende antistoffer, kvantificerede vi derefter de neutraliserende antistoftitre i inficerede hamstere gennem hele tidsforløbet (Eig 3A). Plasma blev isoleret fra blod opsamlet ved obduktion for at blive brugt til neutraliseringsassays ved 100 TCID'er pr.SARS-CoV-2. Neutraliserende antistoffer blev påvist så tidligt som dag 8 pi ved en endepunktstiter på ca. 63 (geometrisk middelværdi). Dette steg til et geometrisk gennemsnit på 160 på dag 12 og toppede på dag 15 ved et geometrisk gennemsnit på 587. Disse observationer antydede, at hamstere er i stand til at fremkalde høje titere af neutraliserende antistoffer efterSARS-CoV-2infektion. Næseskylninger blev opsamlet gennem hele undersøgelsen for at bestemme viral udskillelse fra den øvre delrespiratorisketract.vRNA blev påvist i næsevaskene op til 12 dage efter inokulering med levende virus observeret på dag 2 og 5, og toppede på dag 2 med lidt over 6 TCID5o/ml (Log10). Vi sammenlignede den levende virale titer fundet i næsevaskene af alle dyr på dag 5 med deres respektive vægttab på den dag (fig. 3B). En Pearson-korrelation for normalfordelte data blev brugt til denne analyse for at bestemme, om der eksisterer et lineært forhold mellem vægten af ​​inficerede dyr og virustiter i næsevaskene på dag 5 efter inokulering, hvor dag 5 er en dag, hvor nogle dyr begynder at klare virus. Vi fandt en Pear-son-korrelation på -0.68, således at efterhånden som den virale titer i næsevaskene steg, havde dyr en øget sandsynlighed for mere alvorligt vægttab (p-værdi =0.00242). Derudover vurderede vi forholdet mellem lungevirustiter og vægttab på dag 5 pi. Da der kun blev indsamlet 3 dyr hver dag, er datasættene til at vurdere for en korrelation begrænset af vores stikprøvestørrelse. Selvom dette antal datasæt ikke opfylder det ønskede antal målinger, udførte vi en Pearson-korrelation og fandt en negativ, selvom den ikke-signifikante, sammenhæng mellem lungevirustiter og vægttab på dag 5 efter inokulering. Baseret på virustiteren fra de respektive lungelapper vurderet sammenlignet med dyrevægt, havde højre kranielunge en R-værdi på -0.91(p-værdi=0.27), den højre midterste lunge havde en R-værdi på -0.92(p-værdi=0.25), og den højre kaudale lunge havde en R-værdi på -0.58 (p-værdi{{39) }}.61)(S2 Fig.). Yderligere vurdering på flere dyr bør foretages for at opnå tillid til forholdet mellemSARS-CoV-2lungevirustiter og vægttab af hele dyr.

Fig. 2. Levende SARS-CoV-2-virus er begrænset til luftvejsvæv og mediastinale lymfeknuder, mens viralt RNA er til stede i ekstrapulmonale organer.Dyr blev fjernet fra undersøgelsen på dag 0 før infektion samt dag 2, 5 8, 12 og 15 efter inokulering.respiratoriskevæv opsamlet inkluderede næseturbinatet, luftrøret og lungen (højre kraniallap, højre mellemlap, højre kaudallap, accessorisk lap). Ekstrapulmonære organer, der blev analyseret, omfattede den mediastinale lymfeknude,hjerte, nyre, levermilt og tyktarm. Alle væv blev høstet for at kvantificere virus ved qPCR-detektion afSARS-CoV-2E-genet i TCID50/mL-ækvivalenter baseret på en standardkurve af viralt RNA ved anvendelse af RNA ekstraheret fra en bestand afSARS-CoV-2med en kendt koncentration (TCID50/mL) (Brun). Det infektiøse virus blev kvantificeret ved et vævskulturinfektiøs dosisassay og udtrykt i TCID50/ml (grå). TCID50/ml blev beregnet ved hjælp af Reed og Muench-metoden. Den stiplede linje repræsenterer detektionsgrænsen i den levende virusbelastningsanalyse baseret på den laveste fortynding af prøven. Detektionsgrænsen for qPCR-detektion af E-genet var 101 TCID50/ml. Datapunkter repræsenterer individuelle dyr, og linjen repræsenterer gennemsnittet.

Lungebetændelse og lungepatologi er ofte det afgørende træk vedrespiratoriskeviral infektion, hvilket resulterer i betydelig morbiditet og dødelighed. For at bestemme omfanget af skader på lungerne iSARS-CoV-2inficerede hamstere, og hamsters evne til at rekapitulere det alvorligerespiratoriskeinvolvering i humane COVID-19-patienter undersøgte vi sygdomspatogenesen i venstre lunge hos hamstere under hele infektionsforløbet (fig. 4). Mikroskopisk analyse af H&E-farvning indikerede en stigning i skade i lungen i løbet af infektionen, med den mest alvorlige patologi noteret på dag 8 pi, som delvist forsvandt på dag 15 (Eig 4A). Uinficerede hamstere havde klart alveolært rum uden tegn på inflammatorisk celleinfiltration eller blødning. På dag 2 pi var mononukleær celleinfiltration til stede i de alveolære og peribronchiale rum (gul pil). Celleinfiltration fortsatte på dag 5 med øget infiltration. På dag 8 blev det peribronchiale rum karakteriseret ved tilstedeværelsen af ​​inflammatoriske mononukleære celler. Epitelcelleudslip i bronkiolerne blev noteret (sort pil), og blødning kunne observeres i hele vævet (rød pil). Blødning var løst på dag 12, selvom hyperplasi var tydelig (grøn pil). På dag 15 blev der observeret hyalinmembrandannelse (blå pil) med samtidig reduktion af inflammatorisk celleinfiltration.

Fig. 3. Viral udskillelse af SARS-CoV-2 øges med sværhedsgraden af ​​de kliniske resultater, men aftager, da neutraliserende antistoffer kan påvises i dyreplasma.Næseskylninger blev opsamlet for at kvantificere virussen ved qPCR-detektion afSARS-CoV-2E-gen (brunt) og udtrykt i TCID50/ml-ækvivalenter. Levende viral load assays (grå) blev udført for at kvantificere infektiøse vira. Infektiøse titere af næsevaskene blev bestemt ved vævskultur infektiøse dosistitreringsassays, og den resulterende TCID50/ml blev beregnet ved hjælp af Reed og Muench-metoden. LOD=detektionsgrænse for levende viral load assays. Virusneutraliseringstitre blev bestemt ved standardneutraliseringsassays under anvendelse af plasma opsamlet gennem hele tidsforløbet (sort) (A). Levende viral titer i næsevaskene var negativt korreleret med vægttab på dag 5 efter infektion. R-værdi=-0.68 (p-værdi=0.00242) (B).

For at validere virusbelastningsresultater i lungen samt visualisere virussens placering udførte vi IHC-farvning af venstre lungelap for at påviseSARS-CoV-2spidsprotein. Intet viralt protein blev påvist i uinficerede hamstere, hvilket tyder på specificiteten af ​​det anvendte antistof. På dag 2 pi havde venstre lunge betydelig farvning (sort pil), hvilket tyder på ophobning afSARS-CoV-2spidsantigen (Eig 4B). Farvning var mest fremtrædende i epitelcellerne i bronkiolen med diffus farvning gennem hele epitelcellerne i alveolvæggen. På dag 5 var let farvning (blå pile) til stede gennem luftvejene og alveolære celler. Ingen farvning blev påvist på dag 8 pi, hvor billederne lignede billeder af den uinficerede bronkiole.

Fig. 4. Inokulerede hamstere har betydelig inflammation i lungen, der falder sammen med SARS-CoV-2 Spike-antigenfarvning.Den venstre lunge blev opsamlet fra hvert dyr ved obduktion og perfunderet med 10 procent formalin før paraffinblokindlejring og H&E-farvning. Røde pile indikerer blødning; grønne pile indikerer hyperplasi; gule pile indikerer mononukleær celleinfiltration; sorte pile repræsenterer celle-sloughing; blå pil repræsenterer hyalinmembrandannelse (A). Lungen blev farvet for tilstedeværelsen afSARS-CoV-2spike protein af IHC ved hjælp af et anti-spike kanin monoklonalt antistof. Sorte pile indikerer høje mængder viral antigenfarvning og blå pile indikerer tilstedeværelsen af ​​lave mængder viral antigenfarvning (B). Hele lungen blev vejet ved obduktion, og lungens bruttopatologi blev repræsenteret som en procentdel af dyrets samlede kropsvægt (C). Mindst 3 dyr pr. tidspunkt blev analyseret. angiver en p-værdi mindre<0.05 determined="" by="" anova="" comparing="" hamsters="" on="" the="" day's="" post-inoculation="" to="" baseline="" (day="" 0).="" error="" bars="" indicate="" +/-="" se.="" slides="" were="" visualized="" and="" imaged="" using="" the="" leica="" dmi100="" brightfield="" microscope="" and="" dmc5400="" 20="" mp="" color="" cmos="" camera.="" images="" were="" captured="" and="" 10x="" and="" 40x.="" the="" images="" shown="" are="" representative="" of="" 3="" animals="" per="" group,="" per="" time="">

For at kvantificere inflammation og inflammatorisk celleinfiltration samt ødem i lungen blev vægten af ​​lungerne ved obduktion analyseret. Hele lungen blev vejet ved obduktion, og et forhold til dyrets kropsvægt blev beregnet og derefter udtrykt som en procentdel (fig. 4C). På dagene 0 og 2 pi var lungen mindre end én procent af hamsterens kropsvægt . Dette steg til et betydeligt højdepunkt på dag 5 med lige under 4 procent af kropsvægten i gennemsnit. Lungevægten faldt til 1 procent og forblev statistisk signifikant fra baseline gennem hele det resterende tidsforløb.

Værtsgenekspression og immunopatologisk profilering indikerer et udtalt inflammatorisk respons med stump type I interferon-signalering irespiratorisketraktat

Da de humane data undersøgte systemiske cytokinniveauer i blodet, var vi interesserede i at bestemme immunreaktionerne på infektionsstedet såvel som andre berørte organer. Vi undersøgte niveauerne af type I interferon-respons-relateret (IFN(Interferon)-beta, STAT(signaltransducer og transkriptionsaktivator)2,IRF (interferonregulatorisk faktor)1, IRF3 og TLR(Toll-like receptor)3) ,type II interferonrespons-relateret (IFN-gamma,IRF2, STAT1, CXCL10), og medfødte/adaptive markører og mediatorer (CD3, CD4,CD8A, CD19,IL-2, TGF (transformerende vækstfaktor)-beta ,IL-21,IL-10,IL-4,IL-5,IL-5R,IL-13,IL-12 ,CD14,PKR, CCR3, CCL20, CCL22,IL-1beta, IL-6, TNF).

Humane kliniske rapporter har vist detSARS-CoV-2infektion fører til en dysregulering af interferonresponset[14]. Vi undersøgte type I og I IFN-responserne ved at evaluere ekspressionen af ​​IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3 og TLR3 for type I-responsen og IFN-gamma, IRF2, STAT1 og CXCL10 for type II-responsen (Fig5) . IFN-beta var signifikant nedreguleret i både næseturbinater og højre kranielunge med den største hæmning på dag 2. Downstream-regulatorer af type I IFN-respons blev også reduceret, herunder STAT2 og IRF1, som nåede maksimal hæmning senere i tidsforløbet, da samt IRF3 og TLR3, som ikke viste nogen stigning i genekspression. Vi undersøgte også type II IFN-responset såvel som gener, hvis tilsvarende proteiner virker i begge IFN-veje. IFN-gamma, type II IFN, viste opregulering i de nasale turbinater og mest fremtrædende i lungen (fig. 5). I begge væv var der en stigning til en top efterfulgt af opløsning på dag 15 pi. Nasale turbinatniveauer af IFN-gamma toppede på dag 8 ved en fold-ændring på 12, mens niveauerne i lungen toppede på dag 5 ved en fold-ændring på 17. Irespiratoriskevæv, viste type I IFN-antagonist IRF2 signifikante stigninger, toppede på dag 8 i næseturbinatet og dag 2 i højre kraniale lunge ved foldændringer på henholdsvis 24 og 25. Generelle IFN-responsmolekyler viste også signifikante stigninger.STAT1 viste stærk opregulering i begge væv på dag 2 og 5, mens CXCL10 toppede på dag 2 i de nasale turbinater ved en fold-ændring på tæt på 70. I lungen toppede CXCL10 d. dag 8 ved en fold-ændring på 30, men forsvandt ikke tilbage til baseline og forblev signifikant forøget i forhold til naive dyr på dag 12 og 15 pi. Ud fra disse data ser det ud til, at mens type II IFN-responset forbliver intakt, hamstere inokuleret medSARS-CoV-2vise et dysreguleret type IIFN-respons irespiratoriskevæv.

Fig. 5. Genekspressionsanalyse i respiratoriske væv hos SARS-Cov-2-inficerede hamstere afslører signifikant interferon-dysregulering med samtidig stigning i inflammatoriske og immune mediatorer.qRT-PCR blev udført på RNA ekstraheret fra nasal turbinat og højre kranie lungevæv afSARS-CoV-2inokulerede hamstere. Prøver blev vurderet for type I interferon respons-relateret (IFN-beta, STAT2, IRF1, IRF3, TLR3), type II interferon respons-relateret (IFN-gamma, IRF2, STAT1, CXCL10) og medfødt/ adaptive mediatorer (CD3, CD4, CD8, CD19, IL-2, TGF-beta, IL-21, IL- 10, IL-4, IL-5, IL-5R, IL-13, IL-12, CD14, CCR3, PKR, CCL20, CCL22, IL-1beta, IL-6, TNF) vha. primere, der er specifikke for hamstergener (tabel 1). Foldændring blev beregnet via ΔΔCt mod baseline (dag 0) med BACT som husholdningsgenet. Mindst tre dyr blev analyseret for hvert tidspunkt.

Derudover vurderede vi også medfødt og adaptiv genregulering. Samlet set blev disse gener opreguleret i både de nasale turbinater og højre kranielunge, med nasale turbinater, der typisk viser højere ekspression (fig. 5). De nasale turbinater havde peak genekspression af IL-2, TGF-beta, IL-21, IL-4, IL-5R, IL-13 og CCR3 på dag 5 pi, hvor det højeste udtryk kom fra TGF-betal ved en fold-ændring på 97, og IL-13 ved 45.IL-10 udtryk toppede på dag 2 ved en fold-ændring på 38, men forblev opreguleret gennem hele tidsforløbet, signifikant på dag 5 og 10. IL-5-ekspression toppede på dag 12 ved en fold-ændring på 21. I lungen varierede den højeste ekspression pr. gen: TGF-betal, IL{ {25}} og IL-13 viste den højeste opregulering på dag 5; IL-10, IL-4 og IL-5 på dag 8; og IL-2 på dag 12.IL-4 og IL-13 viste den største opregulering med 25 og 18 på deres respektive spidsbelastningsdage. T-cellespecifikke markører var højest i de nasale turbinater, med genekspression på dag 12 og forblev høj på dag 15. Dette tyder på en involveret T-celle-respons, som yderligere blev understøttet af opreguleringen af ​​Th2-cytokiner (IL-4 , IL-5 og IL-13), cytokinerne (vist tidligere IL-12 og IFN-gamma), samt T-regulatoriske og Th17-cytokiner (IL-10 og TGF-betal), der peger på en samlet T-cellerespons påSARS-CoV-2infektion. Derfor udførte vi IHC for at bestemme tilstedeværelsen af ​​CD3 plus og CD20 plus celler irespiratoriskeCD3 plus-farvning blev koncentreret til blodkar (røde pile) i det uinficerede lungevæv uden farvning i de alveolære rum. Tilstedeværelsen af ​​CD3 plus-celler (S3A Fig, sorte pile) steg i det alveolære rum gennem hele tidsforløbet og nåede maksimal farvning på dag 8 efter inokulering og faldt derefter i intensitet ud i dag 15. CD20-farvning blev ikke påvist i uinficeret væv. Små antal CD20 plus-celler blev detekteret på dag 2, 5 og 8 efter podning (S3B Fig, angivet med sorte pile), som aftog på dag 12 og 15 som angivet med grå pile.

Analyse af de inflammatoriske markører i de nasale turbinater indikerede signifikante forbigående stigninger af alle inflammatoriske mål, der forsvandt på dag 12 og 15.IL-1beta nåede maksimale niveauer på dag 2 pi ved en foldændring på 4{{7 }} slægtninge i dag 0uinficerede dyr (fig. 5). IL-6, IL-12 og TNF nåede topdag 5 pi (fold-ændringer på henholdsvis 66, 20 og 26). Tilsvarende betydning kan findes i S1-tabellen. I modsætning hertil nåede disse transkripter apex mellem dag 2 og 5, men med en lavere fold-ændring sammenlignet med lungen. I både de nasale turbinater og i lungerne forblev adskillige inflammatoriske cytokiner forhøjede sammenlignet med baseline indtil dag 12 pi. Tilsammen viste infektionsstederne en klar stigning i inflammatoriske markører, især IL-6 i nasale turbinater og TNF i lungen.

KLIK HER FOR AT DEL Ⅱ