DNA-methylom og transkriptom identificerede nøglegener og veje involveret i dannelse af plettet æggeskal hos ældre æglæggende høner

Abstrakt

Baggrund

Kvaliteten af ​​fjerkrææggeskaller er tæt forbundet med rentabiliteten af ​​ægproduktionen. Æggeskalspletter afspejler en vigtig kvalitetsegenskab, der påvirker æggenes udseende og kundernes præferencer. Mekanismen for pletterdannelse er dog stadig dårligt forstået. I denne undersøgelse sammenlignede vi systematisk serumimmun- og antioxidantindekser for høns, der lægger plettede og normale æg. Transkriptom- og methylomanalyser blev brugt til at belyse mekanismen for dannelse af æggeskalspletter.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity

【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Resultater

Resultaterne viste, at syv differentielt udtrykte gener (DEG'er) blev identificeret mellem normal- og speckle-gruppen. Gensætberigelsesanalyse (GSEA) afslørede, at de udtrykte gener hovedsageligt var beriget i calciumsignalvejen, fokal adhæsion og MAPK-signalvejen. Derudover blev 282 differentielt methylerede gener (DMG'er) påvist, hvoraf 15 gener var forbundet med aldring, inklusive ARNTL, CAV1 og GCLC. Pathway-analyse viste, at DMG'erne var forbundet med T-celle-medieret immunitet, respons på oxidativt stress og cellulær respons på DNA-skadestimulus. Integrativ analyse af transkriptom- og DNA-methyleringsdata identificerede BFSP2 som det eneste overlappende gen, som blev udtrykt i lave niveauer og hypomethyleret i speckle-gruppen.

Konklusioner

Samlet set indikerer disse resultater, at aldrings- og immunrelaterede gener og veje spiller en afgørende rolle i dannelsen af ​​plettede æggeskaller, hvilket giver nyttig information til at forbedre æggeskallernes kvalitet.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Nøgleord

Æglæggende høner, plettede æg, transkriptom, DNA-methylering, immunitet

Baggrund

Fjerkrææg er en af ​​de vigtigste proteinkilder, og deres relativt lave pris gør dem populære blandt forbrugerne. I løbet af de sidste fire årtier er ægproduktionen forbedret betydeligt på grund af udviklingen af ​​specialiserede ægracer og genetisk selektion, med målet om at "fodre æglæggende høner til 100 uger for at producere 500 æg" [ 1, 2]. Opnåelsen af ​​dette mål er imidlertid blevet begrænset af det gradvise fald i æggeskallernes kvalitet og fysiologi forbundet med hønens aldring, hvilket resulterer i øget æggeskalsvægt, lysere æggeskalsfarve og plettede æggeskaller [3]. Den rødbrune plet, en vigtig æggeskallkvalitetsegenskab, vises ofte på den stumpe ende af den brune æggeskal, hvilket i høj grad påvirker æggenes udseende og kundernes præference. Graden af ​​æggeskalspletter vurderes ved hjælp af en scoringsmetode. Pletter kan scores efter pigmentintensitet, fordeling og pletterstørrelse [4]. Desuden varierer arveligheden af ​​plettede æggeskaller fra 0,15-0,2, hvilket indikerer genetisk bestemmelse [5]. Derudover indikerede en tidligere undersøgelse, at ældre høns har en højere andel af plettede æggeskaller end yngre høns, og når 20% efter 60 ugers alderen [6]. Æggeskalkirtlen er et ægdannelsesorgan, der spiller en afgørende rolle i æggeskallens struktur og farvedannelse. Under ægdannelsen rejser blommen gennem infundibulum, magnum og landtange og når æggeskalkirtlen, som udskiller en stor mængde calcium, pigment, neglebånd og andre stoffer og danner en komplet æggeskalsstruktur og en ydre neglebånd [7-9 ]. Enhver ændring eller beskadigelse af æggeskalkirtlen påvirker dannelsen af ​​æggeskalsstruktur og pigmentering [10-12]. DNA-methylering er en af ​​de tidligste kendte modifikationsveje og involverer overførsel af methylgrupper til cytosinets femte carbonsted for at danne 5-methylcytosin [13]. DNA-methylering spiller en vigtig rolle i ældningsprocessen for dyr, regulerer aldersrelateret genekspression og ætiologierne af neurologiske, immunologiske og metaboliske sygdomme [14-17]. Derudover kan DNA-methylering kombineret med miljøfaktorer forårsage forskellige fænotyper under aldring [18]. Adskillige komplekse husdyrfænotyper er blevet forbundet med DNA-methylering [19, 20]. For nylig har RNA-sekventering (RNA-seq) været nyttig til at afsløre gener og veje, der ligger til grund for egenskaber på transkriptionsniveau [21-24], såsom udvikling af embryonal muskel, fodereffektivitet og kuldstørrelse. Vores tidligere undersøgelse viste, at selvom forekomsten af ​​plettede æggeskaller ikke påvirker æglæggende høners ydeevne (upublicerede data), kan pletter påvirke udseendet af æg og reducere deres økonomiske værdi betydeligt. Desuden er de molekylære mekanismer for dannelse af plettede æg dårligt forstået. Derfor sigtede denne undersøgelse på at belyse mekanismen for dannelse af plettet æggeskal ved hjælp af transkriptomiske og DNA-methyleringsteknikker. Da plettede æggeskaller er arvelige og aldersrelaterede, brugte vi en kombination af transkriptomiske og DNA-methyleringsanalyser til at udforske nøglegener og -veje involveret i dannelse af plettet æggeskal. Det forventes, at resultaterne af denne undersøgelse vil forbedre forståelsen af ​​den molekylære mekanisme for dannelse af æggeskaltræk, hvilket ville være nyttigt til dyreavl.

Fig. 1 Normale og plettede æg fra gamle æglæggende høner. Et normalt æg, B plettet æg

Tabel 1 Serum biokemiske parametre for normal- og specklegruppen

Resultater

Serum biokemiske parametre

A typical egg and speckled egg are shown in Fig. 1. Serum antioxidant and immune indices were measured to determine the physiological status of the laying hens. Serum biochemical parameters are listed in Table 1. Serum levels of immunoglobulin G (IgG) and immunoglobulin A (IgA) are common indicators of humoral immune function. Birds in the normal group had a higher (p = 0.028) IgA content than those in the speckle group. Superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), total antioxidant capacity (T-AOC), glutathione (GSH), and glutathione peroxidase (GSH-PX) are important antioxidant enzymes in the body. MDA is one of the products formed by the reaction of lipids with oxygen radicals, and its content represents the degree of lipid peroxidation. These indices are important in evaluating the oxidative stress process. However, there were no differences (p >0.05) i antioxidantparametre mellem normal- og plettergruppen.

Transkriptomprofil af æggeskalkirtlen

Seks cDNA-biblioteker blev konstrueret ud fra speckle- og normale grupper. Efter kvalitetskontrol blev der opnået i alt 615.170.158 råaflæsninger og 604.275.600 rene aflæsninger (98,22% af råaflæsningerne). Efter justering ved hjælp af HISAT2-software var kortlægningshastigheden 90,75-93,18%, og den unikke kortlægningshastighed i alle prøver var større end 73,47% (Supplerende tabel S3). Genekspressionsniveauer er illustreret ved hjælp af et klyngevarmekort og principal komponentanalyse (PCA). Der var ingen signifikante forskelle i genekspressionsprofilerne for prøver fra speckle- og normale grupper, da prøverne ikke dannede forskellige klynger (fig. 2A, B). I alt syv differentielt udtrykte gener (DEG'er) blev identificeret mellem normal- og specklegruppen (p<0.05, |log2 Fold Change|>1), herunder to opregulerede og fem nedregulerede gener (tabel 2). Gensætberigelsesanalyse (GSEA) viste, at fire veje blev signifikant beriget af de udtrykte gener (Supplerende tabel S4). Negative normaliserede berigelsesscores (NES) indikerede lavere ekspressionsniveauer for nogle veje i den normale gruppe sammenlignet med dem i speckle-gruppen, hvor calciumsignalvejen, neuroaktiv ligand-receptor-interaktion, fokal adhæsion og MAPK-signalvejen er veje med laveste udtryk (fig. 2C). Træ DEG'er (BFSP2, IQSEC, TMOD4) identificeret ved RNA-seq blev verificeret ved hjælp af kvantitativ real-time PCR (qRT-PCR). En lignende ekspression af de tre gener var tydelig ved anvendelse af RNA-Seq og qRT-PCR, og bestemmelseskoefficienten (R2) nåede 0.93 (fig. 2D), hvilket indikerer, at RNA-seq-dataene var pålidelige.

Tabel 2 Differentielt udtrykte gener (DEG'er) mellem hønsene, der lagde pletter og normale æg

Fig. 2 Transkriptomprofilen af ​​æggeskalkirtlen. A Heatmap over genekspressionsniveauer, B Hovedkomponentanalyse af alle gener ved brug af DEseq2 normaliserede ekspressionsværdier, C Tre repræsentative gensæt fra gensættets berigelsesanalyseresultater, D qPCR-verifikationsresultaterne af differentielt udtrykte gener

DNA-methyleringsprofil af æggeskalkirtlen

A total of 564,415,302 and 581,414,308 clean reads were obtained from the speckle and normal groups, respectively, after quality control (Supplementary Table S5), of which 73–78% were uniquely mapped to the converted chicken reference genome (GRCg6a). The cytosine (C) methylation rate of the six eggshell gland samples was approximately 3.4%, and the cytosine site methylation of CpG ranged from 55.5–to 63.9% in the two groups. The cytosine site methylation of CHH and CHG (H represents A, C, or T) was detected at a low proportion (0.3–0.4%) (Supplementary Table S5). Pearson correlation analysis of the CpG bases suggested that all samples were highly correlated (r>{{0}}.89) (Fig. 3A). PCA viste, at prøver fra de to grupper ikke var signifikant forskellige, da de ikke dannede separate klynger (fig. 3B). Der var ingen signifikante forskelle i methyleringsniveauerne af CG, CHG og CHH mellem de to grupper (fig. 3C). Imidlertid viste plettergruppen et højere CG-methyleringsniveau end den normale gruppe. Te-gentagelses- og exon-regionerne udviste de højeste CG-methyleringsniveauer, hvorimod 5' UTR-regionen havde de laveste CG-methyleringsniveauer (fig. 3D). I alt 2788 differentielt methylerede regioner (DMR'er) blev identificeret mellem de normale og plettede grupper. DMR'erne var hovedsageligt placeret i intronerne (47,45%), efterfulgt af den intergene region (36,05%), exon (8,29%), promotor (5,95%), 3'-UTR (1,18%) og 5'-UTR ( 0,97 %) regioner (fig. 4). Derudover blev 282 differentielt methylerede gener (DMG'er) identificeret, inklusive 172 hypermethylerede og 74 hypomethylerede gener i promotorregionen. Desuden blev der fundet 36 DMG'er i genkroppen, herunder 30 hypermethylerede gener og seks hypomethylerede gener. Vi konverterede DMG'er til deres humane ortologer og opnåede 158 gensymboler, der blev uploadet i Metascape til funktionel annotering, genontologi (GO) og pathway-analyser. Generne blev beriget i 176 GO biologiske processer, herunder regulering af cellulær respons på vækstfaktorstimulus og T-cellemedieret immunitet, respons på oxidativ stress og cellulær respons på DNA-skadestimulus.

Fig. 3 De overordnede methyleringsniveauer hos høns, der lægger pletter og normale æg. En korrelationsanalyse af methyleringsniveauer mellem prøver fra de to grupper. B Hovedkomponentanalyse af methyleringsniveauet for alle prøver. C Histogram af cytosinsted-methyleringsniveau i de to grupper. D Linjediagram over methyleringsniveauerne af forskellige genomiske regioner. De genomiske regioner af hvert gen blev opdelt i 20 bins; methyleringsniveauet for cytosinstedet for de tilsvarende funktionelle regioner af alle gener blev derefter gennemsnittet.

Fig. 4 Histogram af annotering af differentielt methylerede regioner (DMR'er) i genomiske funktionelle regioner

Fig. 5 A GO-vilkår for DMG'er. B Forholdet mellem genekspression og DNA-methyleringsniveauer i specklegruppen. C Forholdet mellem genekspression og DNA-methyleringsniveauer i normal gruppe. D Venn-diagram over overlappende gener mellem DEG'er og DMG'er

Pathway-analyse viste, at generne blev beriget i 19 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)-veje, inklusive RNA-nedbrydning, inflammatorisk mediatorregulering af TRP-kanaler og TNF-signalvejen. Desuden blev 25 gensæt påvist, inklusive signalering af Rho GTPases, RHO GTPase-cyklussen og CDC42 GTPase-cyklussen. De øverste 20 berigede ontologiklynger er vist i fig. 5A. Blandt de 158 homologe humane gener var 15 relateret til aldring eller levetid (Supplerende tabel S6). En integrativ analyse af hel-genom-bisulfit-sekventering (WGBS) og RNA-seq-data blev udført for at bestemme forholdet mellem DNA-methylering og genekspressionsniveauer (fig. 5B og C). Der var en negativ korrelation mellem DNA-methylering og genekspressionsniveauer opstrøms for transkriptionsstartstedet (TSS) og nedstrøms for transkriptionstermineringsstedet (TTS); der var dog ingen sammenhæng mellem DNA-methylering og genekspressionsniveauer i genkroppen. Venn-diagrammet viste, at BFSP2 var det eneste overlappende gen mellem DMG'er og DEG'er (fig. 5D).

Diskussion

Undersøgelser over flere år har vist, at dannelsen af ​​pletter på æggeskaller er arvelig, og ældede æglæggende høner producerer en højere andel af plettede æggeskaller end yngre høner [6]. Aldring af æglæggende høner er ofte ledsaget af kronisk inflammation og oxidativ stress [25, 26]. Dyrenes blodparametre afspejler deres fysiologiske og ernæringsmæssige status. SOD, GSH-PX, GSH, CAT og T-AOC er komponenter i antioxidantforsvarssystemet. Resultaterne af nærværende undersøgelse indikerer, at der ikke var nogen signifikant forskel i antioxidantkapaciteten hos ældre høns mellem plettet og normalgruppen, hvilket er i modstrid med resultaterne af Moreno og Osorno [27]. Moreno rapporterede, at fugle, der lægger æg med plettede skaller, kan lide fysiologisk stress på grund af den pro-oxidant funktion af hovedpletter komponenten og har en højere tolerance over for oxidativ stress [28]. Forskellene i resultaterne kunne tilskrives de forskellige arter, der blev brugt i undersøgelserne.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Immunglobuliner er proteiner involveret i anti-inflammatoriske processer og spiller regulerende roller i inflammatoriske reaktioner [29]. En tidligere undersøgelse viste, at blåmejsefugle, der lægger plettede æg, udviser lave totale immunoglobulinniveauer [30]. Tilsvarende viste resultaterne af denne undersøgelse, at fugle i plettergruppen havde væsentligt lavere serum-IgA-niveauer sammenlignet med dem i den normale gruppe, hvilket indikerer, at høns i plettergruppen kan have en lavere anti-inflammatorisk evne, hvilket er i overensstemmelse med fund af Martínez og Merino [30]. IgA, som en af ​​de vigtige indikatorer i evalueringen af ​​den humorale immunfunktion af fjerkræ, har antivirale, antibakterielle og antitoksinfunktioner [31]. Undersøgelser har vist, at kosttilskud af gær-glucan kan øge serum-IgA-indholdet. Det øgede IgA-indhold kan øge et individs evne til at opretholde immunhomeostase, hvilket fører til mulige sundhedsmæssige fordele [32]. Undersøgelser har også vist, at når æglæggende høns bliver ældre, falder deres modstandsdygtighed over for eksterne patogener [33]. Når patogener kommer ind i kroppen af ​​ældre æglæggende høner, kan slimhindeforsvarssystemet i æggeledervæv blive beskadiget på grund af det samtidige fald i immunitet [34]. Et højere niveau af IgA kan dog øge kroppens evne til at opretholde immunhomeostase, hvilket forhindrer invasionen af ​​patogener i æggelederens submucosale væv og dermed opretholder en god æggeskalskvalitet. Desuden identificerede RNA-seq-analyse syv DEG'er mellem speckle- og normale grupper, herunder IQSEC3, BFSP2, TMOD4, LOC112530987, GABRA2, TRIQK og et pseudogen. IQSEC3, et medlem af den brefeldin A-resistente ARF guanin nucleotid exchange factors (GEFs) familie [35, 36], fremmer udviklingen af ​​hæmmende synapser ved at binde til gephyrin [37]. IQSEC3 er funktionelt vigtig for at opretholde netværksaktivitet in vivo. IQSEC3 knockdown i hippocampus dentate gyrus hos gnavere reducerer tætheden af ​​GABAerge synapser og øger modtageligheden for alvorlige anfald [38]. Der er dog ingen undersøgelser af funktionen af ​​IQSEC3 hos fjerkræ.

Gamma-aminosmørsyre (GABA) er den vigtigste hæmmende neurotransmitter i centralnervesystemet hos hvirveldyr [39] og kan ændre strukturen af ​​receptoren og ionpermeabiliteten af ​​den tilsvarende receptor [40]. GABA kan virke direkte på tubulære glatte muskelceller gennem GABAA-R eller GABAB-R, som er placeret på æggelederens væg og deltager ved at regulere tubulær kontraktilitet hos kaniner [39], mennesker [41] og rotter [42]. Undersøgelser har vist, at GABRA1 spiller en vigtig rolle i ægproduktionen. Høje ekspressionsniveauer af GABRA1 kan hæmme proliferationen af ​​granulosaceller, øge celleapoptose og hæmme syntesen og sekretionen af ​​progesteron, hvilket resulterer i reduceret ægproduktion [43-45]. Æglægningsrytmen for æglæggende høner er en neuromodulatorisk proces [46, 47]. Baseret på disse resultater spekulerer vi i, at der er et subtilt forhold mellem dannelse af æggeskalspletter og nervesystemet, selvom den præcise forbindelse kræver yderligere undersøgelse.

TMOD4, et medlem af en familie af proteiner, der dækker de spidse ender af actinfilamenter [48], udtrykkes i skeletmuskulatur og hjertet [49, 50]. Undersøgelser har rapporteret, at TMOD4 er til stede i voksne kyllingelinser, erytrocytter og hurtigt rykkede skeletmuskelfibre [51]. TMOD4 har vist sig at deltage i myofibrillsamling, muskelsammentrækning og differentiering [52-54]. Sammentrækningen af ​​æggeledermusklen får ægget til at rotere i livmoderen, hvilket tillader pigment at blive jævnt aflejret på æggeskallens overflade. Vi spekulerer i, at dannelsen af ​​plettede æg kan være relateret til æggeledermuskelkontraktion, men yderligere forskning er nødvendig. GSEA blev brugt til at analysere den biologiske funktion af alle udtrykte gener for at undgå tab af nogle interessante gensæt gennem cutof-free strategien. De udtrykte gener blev hovedsageligt beriget i calcium-signalvejen, fokal adhæsion, MAPK-signalvejen og neuroaktiv ligand-receptor-interaktion. Det er blevet rapporteret, at i processen med æggeskalsmineralisering er gener relateret til calciumsignalvejen involveret i absorptionen af ​​calcium og carbonationer fra blodet og transporteres til livmodervæsken via æggelederens epitelceller for at deltage i æggeskallen. mineralisering [46, 55]. Når calcium- og karbonationerne fortsætter med at mineralisere i æggeskallen, roterer ægget kontinuerligt i livmoderen, og æggeskalspigmentet, protoporphyrin-IX, kan aflejres ensartet på æggeskallens overflade [56]. Vi spekulerer i, at forskellen i tilførslen af ​​carbonat- og calciumioner mellem de to grupper kan have ført til den ujævne fordeling af pigment i aflejringsprocessen på æggeskallens overflade, hvilket forårsager æggeskalspletter.

cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet

Fokale adhæsioner er makromolekylære strukturer, der danner mekaniske forbindelser mellem det intracellulære actincytoskelet og ekstracellulære matrixkomponenter [57]. Det er blevet vist, at fokale adhæsioner spiller en afgørende rolle i at opretholde morfologien og funktionen af ​​æggelederen i kinesiske brune frøer [58], mens fokale adhæsioner også har været involveret i mekanismen for ægproduktionsforskelle hos Jinghai Yellow-kyllinger og Nandan-Yao tamhøns [59, 60]. I den nuværende undersøgelse var fokale adhæsioner involveret i dannelsen af ​​æggeskalspletter, men den specifikke deltagende mekanisme kræver stadig yderligere undersøgelse. MAPK-vejen har tre fremtrædende medlemmer: p38 mitogen-aktiveret proteinkinase (p38 MAPK), Jun N-terminal kinase (JNK) og ekstracellulær respons kinase (ERK), som tilsammen regulerer cellevækst, differentiering, apoptose, inflammation og andre vigtige fysiologiske reaktioner [61]. ERK 1/2 MAPK-vejen har vist sig at spille en vigtig rolle i væksten, udviklingen og differentieringen af ​​æggelederen og livmoderen [62]. Wang et al. brugte vanadium til at inducere væksten af ​​æggelederepitelceller og fandt ud af, at MAPK-familiemedlemmer blev aktiveret, hvilket førte til oxidativt stress af æggelederen, reduceret celleaktivitet og celleapoptose [63]. I den aktuelle undersøgelse fandt vi, at MAPK-signalvejen i den plettede gruppe var væsentligt beriget, og derfor spekulerer vi i, at hønsene, der lægger plettede æg, kan have oplevet en vis stress, med en vis indvirkning på æggelederen. Neuroaktive ligand-receptor-interaktioner er relateret til steroidhormonsyntese i gonaderne. De spiller en væsentlig rolle i reguleringen af ​​ægproduktion og ovariefunktion hos fjerkræ [59, 64]. Det differentielt udtrykte gen, GABRA2, hører også til den neuroaktive ligand-receptor interaktionsvej. Da æggeskalspletter opstår som et resultat af ægproduktion, og ægproduktion er en rytmisk proces, får den betydelige berigelse af neuroaktive ligand-receptor-interaktioner i den plettede gruppe os til at spekulere i, at der kan være forskelle i ægproduktionsydelsen mellem høns, der lægger plettede æg og høns, der lægger normale æg, men dette kræver yderligere udforskning.

Miljøfaktorer kan påvirke genekspression via epigenetiske modifikationer. Kombinationen af ​​genetiske og epigenetiske modifikationer kunne være nyttig til at forklare dannelsesmekanismen for komplekse egenskaber [19, 65]. Forholdet mellem genom-dækkende DNA-methylering og genekspression er blevet undersøgt i årevis [66, 67]. Generelt undertrykker DNA-methylering genekspression [68]. Resultaterne af denne undersøgelse er i overensstemmelse med tidligere resultater, idet høje genekspressionsniveauer er forbundet med lav DNA-methylering i promotorregionen [67, 68]. Der blev imidlertid ikke observeret nogen åbenlys tendens i genlegemeregionen, hvilket kan skyldes, at genekspressionsmønstre også reguleres af andre faktorer [69, 70]. Funktionel berigelsesanalyse afslørede, at DMG'er hovedsageligt var beriget i T-cellemedieret immunitet, respons på oxidativt stress og cellulær respons på DNA-skadestimuli, og de fleste af veje er forbundet med aldring [71-73]. Andre aldringsrelaterede gener er også blevet identificeret, herunder GCLC [74], CAV1 [75] og LYN [76]. En kombination af transkriptom- og DNA-methyleringsdata viste, at BFSP2 var det eneste overlappende gen og blev signifikant udtrykt på både DNA-methylerings- og transkriptomiske niveauer. BFSP2 var hypomethyleret, og dets ekspressionsniveauer var lave i speckle-gruppen, hvilket tyder på, at genekspression er reguleret af andre transkriptionsfaktorer ud over methyleringsmodifikation. Desuden er BFSP2 blevet identificeret som et kandidatgen i autosomal-dominant medfødt grå stær [77] og progressiv kataraktsygdom [78]. Selvom det er blevet vist, at BFSP2 er relateret til øjenudvikling hos kyllinger [79], er undersøgelser af andre funktioner hos kyllinger begrænsede. Derfor er yderligere undersøgelser nødvendige for at belyse dens rolle i dannelsen af ​​plettet æggeskal.

cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet

Konklusioner

Som konklusion indikerer serumimmunindeksene, at IgA-indholdet i den plettede gruppe var væsentligt lavere end i den normale gruppe, og vi spekulerer i, at en nedsat immunfunktion er tæt korreleret med dannelse af æggeskalspletter. Transkriptomanalyse påviste syv DEG'er mellem de plettede og normale grupper, hvoraf IQSEC3, GABRA2 og BFSP2 blev identificeret som potentielt vigtige gener forbundet med plettet ægdannelse. DNA-methyleringsanalyse identificerede DMG'er forbundet med T-celle-medieret immunitet, respons på oxidativ stress og cellulær respons på DNA-skadestimulus. Af de 282 identificerede DMG'er var 15 forbundet med aldring. Integrativ analyse af transkriptom og DNA-methylering afslørede, at det eneste overlappende gen var BFSP2, som knapt er blevet undersøgt hos kyllinger. De data, der præsenteres her, tyder på, at æglæggende høners immun- og ældningsveje kan bidrage til dannelsen af ​​plettede æggeskal, hvilket forbedrer vores forståelse af mekanismen bag dannelsen af ​​æggeskalspletter.

Referencer

1. Bain MM, Nys Y, Dunn IC. Øget persistens i æglægningen og stabilisering af ægkvaliteten i længere æglægningscyklusser. Hvad er udfordringerne? Br Poult Sci. 2016;57(3):330–8.

2. Pottgüter R. Fodring af æglæggende høner til 100 ugers alderen. Lohmann Inf. 2016;50:18–21.

3. Molnar A, Maertens L, Ampe B, Buyse J, Kempen I, Zoons J, Delezie E. Ændringer i ægkvalitetsegenskaber under den sidste fase af produktionen: er der potentiale for en forlænget æglægningscyklus? Br Poult Sci. 2016;57(6):842–7.

4. Gosler AG, Higham JP, James Reynolds S. Hvorfor er fugleæg plettede? Ecol Lett. 2005;8(10):1105-13.

5. Arango J, Settar P, Arthur J, O'Sullivan N. Forholdet mellem skalfarve og forekomst af pletter i brune æggelinjer. I: Proc XIIth European Poultry Conference: 2006. 2006. s. 10-4.

6. Cheng X, Fan C, Ning Z. Kvaliteten af ​​fregneæg og dets indflydelsesfaktorer. Chinese Poult Sci. 2019;41(19):6–9 (på kinesisk).

7. Hincke MT, Nys Y, Gautron J, Mann K, Rodriguez-Navarro AB, McKee MD. Æggeskallen: struktur, sammensætning og mineralisering. Front Biosci (Landmark Ed). 2012;17(4):1266–80.

8. Samiullah S, Roberts JR, Chousalkar K. Æggeskalsfarve hos brunæglæggende høner - en anmeldelse. Poult Sci. 2015;94(10):2566–75.

9. Wilson PW, Suther CS, Bain MM, Icken W, Jones A, Quinlan-Pluck F, Olori V, Gautron J, Dunn IC. Forståelse af fugleægs kutikuladannelse i æggelederen: en undersøgelse af dens oprindelse og aflejring. Biol Reprod. 2017;97(1):39–49.

10 Zhu M, Li H, Miao L, Li L, Dong X, Zou X. Cadmiumchlorid i kosten hæmmer skalbiomineraliseringen ved at forstyrre metabolismen af ​​æggeskalkirtlen hos æglæggende høner. J Anima Sci. 2020;98(2):skaa025.

11. Qi X, Tan D, Wu C, Tang C, Li T, Han X, Wang J, Liu C, Li R, Wang J. Forringelse af æggeskallernes kvalitet hos æglæggende høns eksperimentelt inficeret med H9N2 fugleinfluenzavirus. Dyrlæge Res. 2016;47:35.

12. Wang J, Yuan Z, Zhang K, Ding X, Bai S, Zeng Q, Peng H, Celi P. Epigallocatechin-3-gallatbeskyttet vanadium-induceret æggeskalsdepigmentering via P38MAPK-Nrf2/HO-1 signalvej hos æglæggende høner. Poult Sci. 2018;97(9):3109–18.

13. Avery OT, Macleod CM, McCarty M. Undersøgelser af den kemiske natur af stoffet, der inducerer transformation af pneumokoktyper: induktion af transformation af en desoxyribonukleinsyrefraktion isoleret fra pneumococcus type Iii. J Exp Med. 1944;79(2):137–58.

14. Kochmanski J, Marchlewicz EH, Cavalcante RG, Sartor MA, Dolinoy DC. Aldersrelateret epigenom-dækkende DNA-methylering og hydroxymethylering i langsgående museblod. Epigenetik. 2018;13(7):779–92.

15. Zhang X, Hu M, Lyu X, Li C, Thannickal VJ, Sanders YY. DNA-methylering regulerede genekspression i organfibrose. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2017;1863(9):2389–97.

16. Ehrlich M. DNA-hypermethylering i sygdom: mekanismer og klinisk relevans. Epigenetik. 2019;14(12):1141–63.

17. Ling C, Ronn T. Epigenetik i menneskelig fedme og type 2-diabetes. Celle Metab. 2019;29(5):1028–44.

18. Kaminen-Ahola N, Ahola A, Maga M, Mallett KA, Fahey P, Cox TC, Whitelaw E, Chong S. Moderens ethanolforbrug ændrer epigenotypen og fænotypen af ​​afkom i en musemodel. PLoS Genet. 2010;6(1):e1000811.

19 Tan X, Liu R, Xing S, Zhang Y, Li Q, Zheng M, Zhao G, Wen J. Genome-wide detektion af nøglegener og epigenetiske markører for kyllingefedtlever. Int J Mol Sci. 2020;21(5):1800.

20. Hwang JH, An SM, Kwon S, Park DH, Kim TW, Kang DG, Yu GE, Kim IS, Park HC, Ha J, et al. DNA-methyleringsmønstre og genekspression forbundet med kuldstørrelse i Berkshire-griseplacenta. PLoS ONE. 2017;12(9):e0184539.

21. Yu C, Qiu M, Zhang Z, Song X, Du H, Peng H, Li Q, Yang L, Xiong X, Xia B, et al. Transkriptom-sekventering afslører gener involveret i cadmium-udløst oxidativt stress i kyllingens hjerte. Poult Sci. 2021;100(3):100932. 22. Boo SY, Tan SW, Alitheen NB, Ho CL, Omar AR, Yeap SK. Transkriptomanalyse af kylling intraepitelial lymfocyt naturlige dræberceller inficeret med meget virulent infektiøs bursal sygdom virus. Sci Rep. 2020;10(1):18348.

23. Ren L, Liu A, Wang Q, Wang H, Dong D, Liu L. Transkriptomanalyse af embryonal muskeludvikling i Chengkou Mountain Chicken. BMC Genomics. 2021;22(1):431.

24. Yang C, Han L, Li P, Ding Y, Zhu Y, Huang Z, Dan X, Shi Y, Kang X. Karakterisering og duodenal transkriptomanalyse af kinesisk kødkvæg med divergerende fodereffektivitet ved hjælp af RNA-Seq. Front Genet. 2021;12:741878.

25. Wang J, Jia R, Gong H, Celi P, Zhuo Y, Ding X, Bai S, Zeng Q, Yin H, Xu S, et al. Effekten af ​​oxidativ stress på kyllingeæggestokken: involvering af mikrobiota og melatonininterventioner. Antioxidanter (Basel). 2021;10(9):1422.

26. Attia YA, Al-Harthi MA, Abo El-Maaty HM. Calcium- og cholecalciferolniveauer i senfase-æglæggende høner: Effekter på produktive egenskaber, ægkvalitet, blodbiokemi og immunrespons. Front Vet Sci. 2020;7:389.

27. Moreno J, Osorno JL. Fugleægs farve og seksuel udvælgelse: afspejler æggeskalspigmentering kvindens tilstand og genetiske kvalitet? Ecol Lett. 2003;6(9):803-6.

28. Afonso S, Vanore G, Batlle A. Protoporphyrin IX og oxidativ stress. Free Radic Res. 1999;31(3):161-70.

29. Schwartz-Albiez R, Monteiro RC, Rodriguez M, Binder CJ, Shoenfeld Y. Naturlige antistoffer, intravenøst ​​immunglobulin og deres rolle i autoimmunitet, cancer og inflammation. Clin Exp Immunol. 2009;158(Suppl 1):43–50.

30. Martínez-de la Puente J, Merino S, Moreno J, Tomás G, Morales J, Lobato E, García-Fraile S, Martínez J. Er æggeskal pletter og farve indikatorer for sundhed og tilstand i blå bryster Cyanistes caeruleus? J Avian Biol. 2007;38(3):377-84.

31. Fagarasan S, Honjo T. Intestinal IgA syntese: regulering af frontlinje kropsforsvar. Nat Rev Immunol. 2003;3(1):63-72.

32. Zhen W, Shao Y, Wu Y, Li L, Pham VH, Abbas W, Wan Z, Guo Y, Wang Z. Kosttilskud af gær beta-glucan forbedrer æggeskallernes farve og udrugningsevnen for frugtbare æg samt forbedrer immunfunktioner hos opdrætteren æglæggende høns. Int J Biol Macromol. 2020;159:607-21.

33. Elhamouly M, Nii T, Isobe N, Yoshimura Y. Aldersrelateret modulation af det isthmiske og uterin mucosale medfødte immunforsvar hos æglæggende høner. Poult Sci. 2019;98(7):3022–8.

34. Li J, Qin Q, Li YX, Leng XF, Wu YJ. Tri-ortho-cresylphosphateksponering fører til lav ægproduktion og dårlig æggeskalskvalitet via forstyrrelse af follikulær udvikling og skalkirtelfunktion hos æglæggende høner. Ecotoxicol Environ Saf. 2021;225:112771.

35. Fukaya M, Kamata A, Hara Y, Tamaki H, Katsumata O, Ito N, Takeda S, Hata Y, Suzuki T, Watanabe M, et al. SynArfGEF er en guanin-nukleotidudvekslingsfaktor for Arf6 og lokaliseres fortrinsvis til postsynaptiske specialiseringer af hæmmende synapser. J Neurochem. 2011;116(6):1122-37.

36. Um JW. Synaptiske funktioner af IQSEC-familien af ​​ADP-ribosyleringsfaktor guanin-nukleotidbytningsfaktorer. Neurosci Res. 2017;116:54–9.

37. Um JW, Choi G, Park D, Kim D, Jeon S, Kang H, Mori T, Papadopoulos T, Yoo T, Lee Y, et al. IQ-motiv og SEC7-domæneholdigt protein 3 (IQSEC3) interagerer med gephyrin for at fremme inhiberende synapsedannelse. J Biol Chem. 2016;291(19):10119–30.

38. Kim S, Kim H, Park D, Kim J, Hong J, Kim JS, Jung H, Kim D, Cheong E, Ko J, et al. Tab af IQSEC3 forstyrrer GABAergisk synapsevedligeholdelse og mindsker somatostatinekspression i Hippocampus. Cell Rep. 2020;30(6):1995-2005 e1995.

39. Erdö SL, Riesz M, Kárpáti E, Szporny L. GABAB-receptormedieret stimulering af kontraktiliteten af ​​isoleret kaninæggeleder. Eur J Pharmacol. 1984;99(4):333-6. 40. Roth FC, Draguhn A. GABA metabolisme og transport: virkninger på synaptisk effektivitet. Neural Plast. 2012;2012:805830.

41. Erdő SL, László Á, Szporny L, Zsolnai B. Høj tæthed af specifikke GABA-bindingssteder i det menneskelige æggeleder. Neurosci Lett. 1983;42(2):155-60.

42. Erdo SL, Rosdy B, Szporny L. Højere GABA-koncentrationer i æggelederen end i rottens hjerne. J Neurochem. 1982;38(4):1174-6.

43. Sun X, Chen X, Zhao J, Ma C, Yan C, Liswaniso S, Xu R, Qin N. Transkriptom sammenlignende analyse af ovariefollikler afslører nøglegener og signalveje, der er impliceret i hønseægproduktion. BMC Genomics. 2021;22(1):899.

44. Chen X, Sun X, Chimbaka IM, Qin N, Xu X, Liswaniso S, Xu R, Gonzalez JM. Transkriptomanalyse af ovariefollikler afslører potentielle pivotale gener forbundet med øget og nedsat hastighed af kyllingeægproduktion. Front Genet. 2021;12:622751.

45. Luan X, Liu D, Cao Z, Luo L, Liu M, Gao M, Zhang X. Transkriptomprofilering identificerer differentielt udtrykte gener i Huoyan gåseæggestokke mellem æglægningsperioden og den ophørte periode. PLoS ONE. 2014;9(11):e113211.

46. ​​Cui Z, Zhang Z, Amevor FK, Du X, Li L, Tian Y, Kang X, Shu G, Zhu Q, Wang Y, et al. Circadian miR-449c-5p regulerer uterin Ca(2+) transport under æggeskalkalcifikation hos kyllinger. BMC Genomics. 2021;22(1):764.

47. Mishra SK, Chen B, Zhu Q, Xu Z, Ning C, Yin H, Wang Y, Zhao X, Fan X, Yang M, et al. Transkriptomanalyse afslører differentielt udtrykte gener forbundet med høje hastigheder af ægproduktion i kyllingens hypothalamus-hypofyse-ovarieakse. Sci Rep. 2020;10(1):5976.

48. Cox PR, Siddique T, Zoghbi HY. Genomisk organisering af Tropomodulin 2 og 4 og usædvanlig intergen og intraeksonisk splejsning af YL-1 og Tropomodulin 4. BMC Genomics. 2001;2:7.

49. Cox PR, Zoghbi HY. Sekventering, ekspressionsanalyse og kortlægning af tre unikke humane tropomodulingener og deres museortologer. Genomik. 2000;63(1):97-107.

50. Yamashiro S, Gokhin DS, Kimura S, Nowak RB, Fowler VM. Tropomoduliner: spidsende kappeproteiner, der regulerer actinfilamentarkitektur i forskellige celletyper. Cytoskelet (Hoboken). 2012;69(6):337–70.

51. Almenar-Queralt A, Lee A, Conley CA, Ribas de Pouplana L, Fowler VM. Identifikation af en ny tropomodulin-isoform, skelettropomodulin, der dækker aktinfilamenternes spidse ender i hurtig skeletmuskulatur. J Biol Chem. 1999;274(40):28466-75.

52. Ren T, Li Z, Zhou Y, Liu X, Han R, Wang Y, Yan F, Sun G, Li H, Kang X. Sekventering og karakterisering af lncRNA'er i brystmusklen hos Gushi og Arbor Acres kyllinger. Genom. 2018;61(5):337–47.

53. Xu L, Zhao F, Ren H, Li L, Lu J, Liu J, Zhang S, Liu GE, Song J, Zhang L, et al. Co-ekspressionsanalyse af føtale vægt-relaterede gener i ovine skeletmuskulatur i midten og sene føtale udviklingsstadier. Int J Biol Sci. 2014;10(9):1039-50.

54. Wu Y, Wang Y, Yin D, Mahmood T, Yuan J. Transkriptomanalyse afslører en molekylær forståelse af nikotinamid og butyratnatrium på kødkvaliteten hos slagtekyllinger under høj belægningstæthed. BMC Genomics. 2020;21(1):412.

55. Zhang F, Yin ZT, Zhang JF, Zhu F, Hincke M, Yang N, Hou ZC. Integrering af transkriptom-, proteom- og QTL-data for at opdage funktionelt vigtige gener for andeæggeskal og æggehviddannelse. Genomik. 2020;112(5):3687-95.

56. Nys Y, Gautron J, Garcia-Ruiz JM, Hincke MT. Mineralisering af fugleæggeskal: biokemisk og funktionel karakterisering af matrixproteiner. CR Palevol. 2004;3(6-7):549-62.

57. Chen CS, Alonso JL, Ostuni E, Whitesides GM, Ingber DE. Celleform giver global kontrol over fokal adhæsionssamling. Biochem Biophys Res Commun. 2003;307(2):355-61.

58 Su H, Zhang H, Wei X, Pan D, Jing L, Zhao D, Zhao Y, Qi B. Sammenlignende proteomisk analyse af Rana chensinensis Oviduct. Molekyler. 2018;23(6):1384.

59. Zhang T, Chen L, Han K, Zhang X, Zhang G, Dai G, Wang J, Xie K. Transkriptomanalyse af æggestokke i relativt større og mindre ægproducerende Jinghai Yellow Chicken. Anim Reprod Sci. 2019;208:106114.

60. Sun T, Xiao C, Deng J, Yang Z, Zou L, Du W, Li S, Huo X, Zeng L, Yang X. Transkriptomanalyse afslører nøglegener og veje forbundet med ægproduktion i Nandan-Yao tamkylling. Comp Biochem Physiol Del D Genomics Proteomics. 2021;40:100889.

61. Peter AT, Dhanasekaran N. Apoptose af granulosaceller: en gennemgang af rollen af ​​MAPK-signaleringsmoduler. Reprod Domest Anim. 2003;38(3):209-13.

62. Jeong W, Kim J, Ahn SE, Lee SI, Bazer FW, Han JY, Song G. AHCYL1 medieres af østrogen-induceret ERK1/2 MAPK-cellesignalering og mikroRNA-regulering for at påvirke funktionelle aspekter af fugleæggelederen. PLoS ONE. 2012;7(11):e49204.

63. Wang J, Huang X, Zhang K, Mao X, Ding X, Zeng Q, Bai S, Xuan Y, Peng H. Vanadat-oxidative og apoptotiske effekter medieres af MAPK-Nrf2-vejen i lag oviduct magnum-epitelceller. Metallomics. 2017;9(11):1562–75.

64. Tao Z, Song W, Zhu C, Xu W, Liu H, Zhang S, Huifang L. Sammenlignende transkriptomisk analyse af høj- og lavægproducerende andeæggestokke. Poult Sci. 2017;96(12):4378–88.

65. Shioda K, Odajima J, Kobayashi M, Kobayashi M, Cordazzo B, Isselbacher KJ, Shioda T. Transkriptomisk og epigenetisk bevarelse af genetisk kønsidentitet i østrogenfeminiserede embryonale kønskirtler hos hankyllinger. Endokrinologi. 2021;162(1):bqaa208.

66. Huang YZ, Sun JJ, Zhang LZ, Li CJ, Womack JE, Li ZJ, Lan XY, Lei CZ, Zhang CL, Zhao X, et al. Genomomfattende DNA-methyleringsprofiler og deres forhold til mRNA og mikroRNA-transkriptomet i bovint muskelvæv (Bos taurin). Sci Rep. 2014;4:6546.

67. Tan X, Liu R, Zhang Y, Wang X, Wang J, Wang H, Zhao G, Zheng M, Wen J. Integreret analyse af methylomet og transkriptomet af kyllinger med fedtlever hæmoragisk syndrom. BMC Genomics. 2021;22(1):8.

68. Fu Y, Li J, Tang Q, Zou C, Shen L, Jin L, Li C, Fang C, Liu R, Li M, et al. Integreret analyse af methylom, transkriptom og miRNAome af tre svineracer. Epigenomi. 2018;10(5):597–612.

69. Lawrence M, Daujat S, Schneider R. Lateral tænkning: hvordan histonmodifikationer regulerer genekspression. Trends Genet. 2016;32(1):42–56.

70. Zhao BS, Roundtree IA, He C. Post-transkriptionel genregulering ved mRNA-modifikationer. Nat Rev Mol Cell Biol. 2017;18(1):31–42.

71. Chakravarti B, Abraham GN. Aldring og T-celle-medieret immunitet. Mek Aging Dev. 1999;108(3):183-206.

72. Camougrand N, Rigoulet M. Aldring og oxidativ stress: undersøgelser af nogle gener involveret både i aldring og som reaktion på oxidativ stress. Respir Physiol. 2001;128(3):393-401.

73. Ribezzo F, Shiloh Y, Schumacher B. Systemiske DNA-skadereaktioner ved aldring og sygdomme. Semin Cancer Biol. 2016;37–38:26–35.

74. Orr WC, Radyuk SN, Prabhudesai L, Toroser D, Benes JJ, Luchak JM, Mockett RJ, Rebrin I, Hubbard JG, Sohal RS. Overekspression af glutamat-cystein-ligase forlænger levetiden i Drosophila melanogaster. J Biol Chem. 2005;280(45):37331-8.

75. Park DS, Cohen AW, Frank PG, Razani B, Lee H, Williams TM, Chandra M, Shirani J, De Souza AP, Tang B, et al. Caveolin-1 null (-/-) mus viser dramatiske reduktioner i levetid. Biokemi. 2003;42(51):15124-31.

76. Park JW, Ji YI, Choi YH, Kang MY, Jung E, Cho SY, Cho HY, Kang BK, Joung YS, Kim DH, et al. Kandidatgenpolymorfismer for diabetes mellitus, hjerte-kar-sygdomme og cancer er forbundet med lang levetid hos koreanere. Exp Mol Med. 2009;41(11):772-81.

77. Jakobs PM, Hess JF, FitzGerald PG, Kramer P, Weleber RG, Litt M. Autosomal-dominant medfødt katarakt forbundet med en deletionsmutation i det humane perleformede filamentproteingen BFSP2. Am J Hum Genet. 2000;66(4):1432-6.

78. Conley YP, Erturk D, Keverline A, Mah TS, Keravala A, Barnes LR, Bruchis A, Hess JF, FitzGerald PG, Weeks DE, et al. En juvenil-debut, progressiv katarakt locus på kromosom 3q21-q22 er forbundet med en missense mutation i det perleformede flament strukturelle protein-2. Am J Hum Genet. 2000;66(4):1426-31.

79. Kumar P, Kasiviswanathan D, Sundaresan L, Kathirvel P, Veeriah V, Dutta P, Sankaranarayanan K, Gupta R, Chatterjee S. Høst af spor fra genomomfattende transkriptomanalyse til udforskning af thalidomidmedierede anomalier i øjenudvikling af kyllingeembryo: Nitrisk oxid retter op på de thalidomidmedierede anomalier ved at svinge systemet tilbage til normalt transkriptommønster. Biochimie. 2016;121:253-67.

80. Chen S, Zhou Y, Chen Y, Gu J. fastp: en ultrahurtig alt-i-en FASTQ-forprocessor. Bioinformatik. 2018;34(17):i884–90.

81. Kim D, Paggi JM, Park C, Bennett C, Salzberg SL. Graf-baseret genomjustering og genotypebestemmelse med HISAT2 og HISAT-genotype. Nat Biotechnol. 2019;37(8):907–15.

82. Li H, Handsaker B, Wysoker A, Fennell T, Ruan J, Homer N, Marth G, Abecasis G, Durbin R, Genome Project Data Processing S. Sequence Alignment/Map-formatet og SAMtools. Bioinformatik. 2009;25(16):2078–9.

83. Liao Y, Smyth GK, Shi W. featureCounts: et effektivt program til generelle formål til at tildele sekvenslæsninger til genomiske funktioner. Bioinformatik. 2014;30(7):923–30.

84. Love MI, Huber W, Anders S. Modereret estimering af foldændring og dispersion for RNA-seq-data med DESeq2. Genom Biol. 2014;15(12):550.

85. Subramanian A, Tamayo P, Mootha VK, Mukherjee S, Ebert BL, Gillette MA, Paulovich A, Pomeroy SL, Golub TR, Lander ES, et al. Gensætberigelsesanalyse: en vidensbaseret tilgang til fortolkning af genom-brede ekspressionsprofiler. Proc Natl Acad Sci US A. 2005;102(43):15545–50.

86. Krueger F, Andrews SR. Bismark: en fleksibel aligner og methyleringsopkald til Bisulfte-Seq applikationer. Bioinformatik. 2011;27(11):1571–2.

87. Jones PA. Funktioner af DNA-methylering: øer, startsteder, genlegemer og videre. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484–92.

88. Akalin A, Kormaksson M, Li S, Garrett-Bakelman FE, Figueroa ME, Melnick A, Mason CE. methylKit: en omfattende R-pakke til analyse af genom-dækkende DNA-methyleringsprocesser. Genom Biol. 2012;13(10):R87.

89. Zhou Y, Zhou B, Pache L, Chang M, Khodabakhshi AH, Tanaseichuk O, Benner C, Chanda SK. Metascape leverer en biolog-orienteret ressource til analyse af datasæt på systemniveau. Nat Commun. 2019;10(1):1523.