Opdagelse og identifikation af potentielle anti-melanogene aktive bestanddele af Bletilla Striata

ali.ma@wecistanche.com

Yiyuan Luo1, Juan Wang1, Shuo Li1, Yue Wu1, Zhirui Wang1, Shaojun Chen1 og Hongjiang Chen1,2*

Abstrakt

Baggrund:Bletilla striata er den vigtigste medicin af mange klassiske formler til hudblegning i traditionel kinesisk medicin (TCM) og er meget udbredt i den kosmetiske industri for nylig. Imidlertid er dens aktive ingredienser stadig uklare, og dens fibrøse rødder bruges ikke effektivt. Formålet med denne undersøgelse er at opdage og identificere dets potentielle anti-melanogene aktive bestanddele ved hjælp af zebrafiskmodel og molekylær docking.

Metoder:Detantioxidantaktiviteter blev evalueret af 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) radikalopfangende aktivitet, 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS) ) radikal opfangende aktivitet og ferri-reducerendeantioxidantpower (FRAP) assay. Den anti-melanogene aktivitet blev vurderet aftyrosinasehæmmendeaktivitetin vitro og melaninhæmmende i zebrafisk. De kemiske profiler blev udført ved ultrahøjtydende væskekromatografi kombineret med quadrupol time-of-flight tandem massespektrometri (UPLC-Q-TOF-MS/MS). I mellemtiden blev de potentielle anti-melanogene aktive bestanddele midlertidigt identificeret ved molekylær docking.

Resultater:95 procent ethanolekstrakt af B. striata fibrøse rødder (EFB) havde de stærkeste DPPH-, ABTS-, FRAP- og tyrosinaseinhiberende aktiviteter med IC50 5.94 mg/L, 11.69 mg/L, 6.92 mmol FeSO4/g, og 58,92 mg/L, henholdsvis. Derudover reducerede EFB og 95 procent ethanolekstrakt af B. striata knold (ETB) markant melaninsyntesen af ​​zebrafiskembryoer på en dosisafhængig måde. 39 kemiske sammensætninger, herunder 24 stilbenoider, blev foreløbigt identificeret fra EFB og ETB. Molekylær docking indikerede, at der var 83 (herunder 60 stilbenoider) og 85 (herunder 70 stilbenoider) forbindelser, der udviste stærkere bindingsaffiniteter over for tyrosinase og adenylatcyclase.

Konklusion:De nuværende resultater understøttede begrundelsen for brugen af ​​EFB og ETB som naturlige hudblegemidler i farmaceutiske og kosmetiske industrier.

Nøgleord: Bletilla striata, Antioxidant, Anti-melanogen aktivitet, UPLC-Q-TOF-MS/MS, Zebrafisk, Molekylær docking

Klik for at cistanche bivirkninger og fordele for antioxidant

Baggrund

Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f. er en urteagtig flerårig plante udbredt i Asien, såsom Kina, Korea og Japan [1]. Den tørrede knold af B. striata, også kendt som Baiji, som først blev registreret i Shennongs Classic of Materia Medica, er blevet meget brugt som traditionel kinesisk medicin (TCM) i tusinder af år i Kina. Kinesiske farmakopéer angiver, at det besidder evnen til astringerende virkning ved hæmostase og analgese, og derfor blev det i vid udstrækning brugt til behandling af hæmatemese, hæmotyse, traumatisk blødning, sår, hævelse og sprukken hud [2, 3]. Farmakologiske undersøgelser viste, at B. striata besad et bredt spektrum af biologiske aktiviteter, såsom sårheling [4, 5], antiulcus [6, 7], hæmostatisk [8],anti-betændelse[9], antioxidant[10], antibakteriel [11], anti-influenza viral [12], og antiældning [13]. Samtidig indeholder B. striata forskellige klasser af kemiske sammensætninger, bl.apolysaccharider[14], bibenzyler, phenanthrener, anthraquinoner,flavonoiderog 2-isobutylmalater [3, 15] osv.

B. striata er den vigtigste medicin af mange klassiske formler til hudblegning i TCM [16], og det er meget udbredt i kosmetikindustrien for nylig [17]. Men dets aktive ingredienser er stadig uklare, og endda nogle forskningsresultater var modsatrettede. For eksempel er forskningsresultaterne givet af Chenet al. indikerede, at 95 procent ethanolekstrakt af B. striata havde højere tyrosinaseinhiberende aktivitet end dens vandekstrakt med en inhiberingsrate på 68,36 procent in vitro[18], mens resultatet af Huang et al. viste, at den inhiberende aktivitet af B. striata-vandekstrakt på tyrosinase var stærkere end den af ​​95 procent ethanolekstrakt med en inhiberingshastighed på 62 procent in vitro [19]. Forskningsresultaterne af Luetal.[20]og Linghuetal.[21]demonstrerede, at både vand og 95 procent ethanolekstrakt af B. striata, især dets chloroformfraktionering, kunne hæmme B16-cellevækst og inducere dets apoptose på en koncentrationsafhængig måde.

Da in vitro-testene af tyrosinaseinhibering og melanomcellelinjer ikke involverede de komplekse fysiologiske in vivo-betingelser og absorption, metabolisme, fordeling og udskillelse af testprøven, viste mange af prøverne signifikant hæmmende aktivitet mod tyrosinase- og melanomcellelinjer i vitro udviste ikke desto mindre svagt effektiv eller endda ineffektiv in vivo [22,23]. Glabridinet viste signifikant tyrosinaseinhiberende aktivitet med IC50 0.43μmol/L, hvilket var 176 gange stærkere end kojinsyre. Ikke desto mindre var det ikke-hæmmende effekter på pigmenteringen af ​​zebrafisk in vivo[24].

I mellemtiden var B. striata fibrøse rødder (FB) de biprodukter, der blev genereret under behandlingen af ​​B. striatatuber (TB). Moderne undersøgelser viste, at FB indeholder lignende forbindelser med TB og med højere indhold af phenol [25]. Derudover var de antibakterielle [26], antioxidant- og anti-tyrosinase-aktiviteter af FB-ekstrakt stærkere end TB-ekstraktens [25]. FB's ressourcer blev imidlertid ikke brugt effektivt og blev forladt i landbrugsjorden, hvilket førte til spild af FB-ressourcer og miljøforurening [27].

Zebrafisk (Danio rerio), en lille tropisk ferskvandsfisk, er en spirende dyremodel for farmakologi

og toksikologisk forskning in vivo, med mange fordele, herunder lave omkostninger, kort livscyklus, høj gennemsigtighed, nem at vedligeholde, høj fertilitet og krævede færre testprøver [28, 29]. Derudover har zebrafisk melaninpigmenter på overfladen, hvilket muliggør enkel observation af pigmenteringsprocessen, og blev i vid udstrækning brugt i den anti-melanogene undersøgelse [28, 30].

I denne undersøgelse sammenlignede vi de antioxidant- og tyrosinaseinhiberende aktiviteter af rå polysaccha-rid og 95 procent ethanolekstrakt af TB og FB in vitro og anti-melanogene aktiviteter i zebrafiskmodellen. I mellemtiden blev de potentielle anti-melanogene aktive bestanddele midlertidigt identificeret ved molekylær docking. Vi opdagede, at 95 procent ethanolekstrakt af TB (ETB) og FB(EFB) besidder betydelige antioxidant- og anti-tyrosinase-aktiviteter og kan reducere melaninsyntesen af ​​zebrafiskembryoner på en dosisafhængig måde. Således kan ETB og EFB bruges som naturlige hudblegemidler i farmaceutiske og kosmetiske industrier.

Metoder

Kemikalier og reagenser

Tyrosinase, 3-(3,4-dihydroxyphenyl)-L-alanin(L-DOPA) og arbutin blev købt fra Aladdin reagent company (Shanghai, Kina).2,2-diphenyl{{8 }}picrylhydrazyl (DPPH), 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenthiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS),6-hydroxy-2,5,7 ,8-tetramethylchroman-2-carboxylsyre (Trolox) og 2,4,6-tris (2-pyridyl)-s-triazin (TPTZ) blev købt hos Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Acetonitril og methanol (HPLC-kvalitet) blev købt fra Tedia (Fairfield, OH, USA). Deioniseret vand blev fremstillet af Milli-Q vandsystemet (18,2 MΩ, Millipore, USA).

Procedure for indsamling og ekstraktion af planter

B. striata blev indsamlet fra Quzhou YiNianTang Agriculture and Forestry Technology Co., Ltd. (Quzhou, Zhejiang, Kina). Kuponprøver blev deponeret på Herbarium fra Zhejiang Pharmaceutical College (Accessionsnr. 190615). Hele planten var opdelt i knolde og fibrøse rødder. Efterfølgende blev de skåret i små stykker og tørret ved henholdsvis vakuum frysetørring.

De tørrede og pulveriserede prøver (TB og FB) blev tilbagesvalet ekstraheret med 95 procent ethanol i tre gange (1,5 time for hver gang). Ekstrakten blev filtreret under anvendelse af et What man-filterpapir (nr. 1). Filtratet blev koncentreret til tørhed i en rotationsfordamper (Hei-VAP, Heidolph, Tyskland) ved 50 grader og blev efterfølgende tørret med en vakuumfrysetørrer. Ethanolekstraktion af TB (ETB) og FB (EFB) udbytter var henholdsvis 5,21 og 6,53 procent. Affaldene blev brugt til at ekstrahere det rå polysaccharid ved at dispergere i 80 graders vand i 4 timer og udfældning med ethanol [31]. Polysaccharidudbyttet af TB (PTB) og FB (PFB) var henholdsvis 14,75 og 6,45 procent.

cistanche ekstrakt

Kemisk analyse

Den kemiske analyse blev udført på en ultrahøjtydende væskekromatografi kombineret med quadrupol time-of-flight tandem massespektrometri (UPLC-Q-TOF-MS/MS). Den kromatografiske adskillelse blev udført på en Waters Acquity UPLC tem (Waters Corp., Milford, MA, USA) med en WatersBEH Shield RP C18-søjle (100×2,1 mm, 1,7μm) ved 3{ {43}} grad. Den mobile fase bestod af 0,1 procent myresyre i vand (A) og acetonitril (B), med en lineær gradient: 0-3 minutter, 5-16 procent B; 3–8 min, 16–30 procent B; 8–10 min, 30–35 procent B; 10–15 min, 35–55 procent B; 15–18 minutter, 55–80 procent B; 18–19 minutter, 80–5 procent B; 19–20 min, 5 procent B. Strømningshastigheden var 0,3 ml/min, og injektionsvolumenet var 2 μL.

TOF-MS/MS eksperimenterne blev udført ved at bruge en AB SCEIX Triple TOF 5600 massespektrometri (AB SCIEX, Foster City, CA, USA) udstyret med anelectrospray ionization (ESI). MS-detektionen blev udført i negativ ioniseringsmetode. Parametrene blev indstillet som følger: kilde- og desolvationstemperatur var henholdsvis 100 grader og 450 grader; desolvatiseringsgasstrømningshastigheden var 900 l/time; kapillarspændingen var 2kV; keglespændingen var 40 V; kollisionsenergi var 22 eV; og det fulde scanspektra var fra 100 til 2000 Da.

Antioxidant-assays DPPH-radikalopfangende aktivitet

DPPH-radikalopfangningsaktiviteten blev bestemt i overensstemmelse med Ali et al. med små modifikationer [32]. Kort fortalt blev 50 μL testprøveopløsning blandet med 150 μLDPPH ethanolopløsning (0,2 mM) i 96-brøndsplader og blev holdt i mørke i 30 min. . Absorbansen af ​​blandingen ved 517 nm (A1) blev vurderet med mikropladespektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Amerika). Blindopløsningen uden testprøve blandet med DPPHethanol-opløsning blev indstillet som den positive gruppe (A0). Blindprøveopløsningen uden DPPH blandet med testprøveopløsning blev indstillet som blindprøvegruppen (A2). Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. DPPH-radikalopfangningshastigheden blev beregnet ved hjælp af følgende formel:

DPPH radikal opfangningshastighed ( procent ) {{0}} [A0-(A1-A2)]/A0 × 100 procent.

ABTS radikal opfangende aktivitet

ABTS-radikalopfangningskapaciteten blev målt ved hjælp af metoden beskrevet af Ali et al. [32]. Kort fortalt blev 7 mMABST vandig opløsning blandet med 2,45 mM kaliumpersulfat i et forhold på 1:1 (v/v) og inkuberet ved stuetemperatur i mørke i 16 timer for at opnå ABST plus stamopløsningen. Stamopløsningen blev fortyndet med phosphatbufret saltvand (PBS) for at justere absorbansen på (0.72±0.2) ved 734 nm. 20μL testprøver i forskellige koncentrationer blev blandet grundigt med 180μL ABTS plus opløsning. De reaktive blandinger blev holdt i mørke i 5 minutter og målte efterfølgende absorbansen (B1) ved 734 nm. Absorbansen af ​​blandingerne uden testprøve og ABST plus blev indstillet til henholdsvis B og B. Alle eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. ABTS radikalopfangningshastigheden blev beregnet i henhold til følgende formel:

ABTS radikal opfangningshastighed ( procent ) {{0}} [B0-(B1-B2)]/B0 × 100 procent.

Ferri-reducerende antioxidant power assay (FRAP)

Den ferri-jern-reducerende aktivitet blev bestemt ifølge procedurerne af Kosakowska et al. [33]. 300mM acetatbuffer, 10mM TPTZ (2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazin) og 20mM FeCl3 blev blandet ved en (v/v/v) forhold på 10:1:1 til at forberede arbejdsreagenset. 100 μL af hver testprøveopløsning blev blandet med 100 μL TPTZ-arbejdsreagens, inkuberet ved 37 grader i 20 minutter, og absorbansen blev bestemt ved 593 nm. I mellemtiden blev en række FeSO4-standardopløsninger i koncentrationsområderne 0-1000 ug/ml brugt til at forberede kalibreringskurven. Den ferri-reducerende kapacitet blev beregnet i dannelsen af ​​et intenst Fe2 plus -TPTZ blåt kompleks. Resultaterne blev udtrykt som Fe2 plus antioxidantkapacitet (mmol FeSO4/g ekstrakt).

Tyrosinaseinhiberende aktivitet

Tyrosinaseinhiberende aktiviteter blev bestemt ved spektrofotometrisk metode under anvendelse af L-DOPA som substrat [34]. Kort fortalt blev 50 μL prøveopløsninger i forskellige koncentrationer blandet med 50 μL tyrosinase (200 enheder/ml, opløst i pH 6,8 fosfatbuffer}) brønd i {{7} plader og inkuberes i 15 minutter ved 25 grader. Reaktionen blev derefter initieret med tilsætning af L-DOPA (50 μL). Efter inkubation i 30 minutter ved 25 grader blev absorbansen ved 490 nm (Aa) bestemt ved anvendelse af et multiskan sky-mikropladespektrofotometer (ThermoFisher Scientific, Amerika). Tilsvarende blev absorbansen af ​​prøvebrøndene uden tyrosinase (Ab) og kontrolbrøndene med enzym, men uden prøve (Ab) påvist på samme tid. Den tyrosinaseinhiberende aktivitet blev beregnet ved hjælp af ligningen som nedenfor:

Tyrosinaseinhiberende hastighed ( procent )=[1− (Aa − Ab)/Ac] × 100 procent.

IC50 blev beregnet ved hjælp af GraphPad Prism-ligningen som nedenfor:

Y=min plus (maks. − min)/1 plus 10(x−logIC50)× Bakkehældning

X repræsenterede inhibitorkoncentrationen; Y repræsenterede inhiberingsdataene (procent) sammen med deres minimale (min) og maksimale (max) værdier; Bakkehældningen er hældningsfaktoren.

Cistanche hæmmer tyrosinaseaktivitet.

Melaninhæmmende i zebrafisk

Vildtype AB line zebrafisk (leveret af Hunter Bio-technology, Inc., Hangzhou, Zhejiang-provinsen) blev opstaldet i fiskevand (0,2 procent øjeblikkeligt havsalt i deioniseret vand, pH 6,9-7,2, ledningsevne 48{ {18}}–510 mS/cm, og hårdhed 53,7–71,6 mg/L CaCO3) i en 14/10 timers lys/mørke fotoperiode ved en konstant temperatur på 28±0,5 grader, og fodret med levende artemia to gange dagligt. Zebrafiskembryoerne blev opnået fra naturlig gydning og indsamlet inden for 30 min. Zebrafiskassayet blev akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC). Denne undersøgelse blev godkendt af IACUC (Institutional Animal Careand Use Committee) hos Hunter Biotechnology, Inc., og IACUC-godkendelsesnummeret var 001458.

Embryoer på 6 timer efter befrugtning (hpf) stadiet blev behandlet hver ekstrakt i seks koncentrationer (10, 30, 62,5, 125, 250 og 500 mg/L) i 72 timer for at evaluere den maksimale ikke-dødelige koncentration (MNLC) ). Som et resultat heraf var MNLC'erne for alle ekstrakterne mere end 62,50 mg/L.10 embryoner blev anbragt i 6-brønd og blev eksponeret til testede prøver i koncentrationer på 10 og 30 mg/L fra 6 hpf til 54 hpf (48 timers eksponering) ). DMSO (0,05 procent, v/v) andarbutin (10 og 30 mg/L) blev brugt som henholdsvis normal og positiv kontrol.

Synkroniserede embryoner blev opsamlet og observeret under et stereomikroskop (SZX7, Olympus, Japan) udstyret med et digitalkamera (VertA1, Kina). Melaninakkumulering, direkte korreleret til zebrafiskpigmenteringsområderne, blev beregnet ved hjælp af GNUImage Manipulation Program (GIMP version 2.10.2) og udtrykt i procent i forhold til den negative kontrol (melaninakkumulering 100 procent) [28, 30].

Molekylær docking undersøgelse

158 forbindelser isoleret fra B. striata i litteraturen[2], herunder 19 glycosider, 28 bibenzyler, 19 phenan-threner, 18 biphenanthrener, 23 dihydrophenanthrener, 5 anthocyaniner, 11 steroider, 8 triterpenoider, 5-12-syrer, 5 og 10 andre forbindelser blev anvendt som ligander. 3D-strukturerne blev tegnet af ChemBio3D og blev optimeret ved hjælp af MM2 og Autodock Tools. 3D-krystalstrukturen af ​​tyrosinase (PDBID:5M8N) og adenylatcyclase (PDB ID:5IV3) blev hentet fra RCSB Protein Data Bank (www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Alle vandmolekyler og heteroatomer blev fjernet fra krystalstrukturerne ved at bruge Chimera og MGL Tools. Endelig Autodock

Vina blev brugt til at docke receptorproteinet med de små molekyle ligander. Parametre for receptorens pro-tein-dockingsted blev sat til henholdsvis -36.700, 7.034, -19.104 og - 17.467, - 22.807, 2.786 ifølge den originale ligandmimosin og LRE1 [35]. For at opnå højere beregningsnøjagtighed blev 20 udtømmende parametre for hver receptor genereret, og konformationen med den højeste affinitet blev valgt som den endelige docking-konformation og visualiseret i Pymol2.3. I mellemtiden blev de originale ligander mimosine og LRE1 taget som den positive kontrol [36].

I silico ADMET forudsigelse

De 3 bedste hits fra B. striata havde bedre bindingsaffinitet med tyrosinase og adenylatcyclase, blev udsat for ADMET-analyse. QikProp i Schrodingersuite blev brugt til at beregne deres fysiske egenskaber og lægemiddelrelaterede karakteristika, herunder molekylvægt (MW), forudsagt oktanol/vand-fordelingskoefficient (QPlogPo/w), forudsagt vandopløselighed (QPlogS), forudsagt tilsyneladende Caco-2-celle permeabilitet for tarm-blodbarriere (QPPCaco), forudsagt hjerne/blodfordelingskoefficient (QPlogBB), forudsagt hudpermeabilitet (QPlogKp), forudsagt IC50 for blokering af HERGK plus kanaler (QPlog HERG) og forudsagt human oral absorption. Egenskaberne blev vurderet ud fra Lipin-skis femteregel og litteratur [37, 38].

Molekylær dynamik simulering

For at undersøge stabiliteten og dynamiske fluktuationer af ligand-proteinkomplekset under et simuleret biologisk miljø og yderligere validere dokningsresultaterne, blev forbindelserne blestrin D (75) valgt som ligand til simuleringsundersøgelsen af ​​molekylær dynamik (MD), baseret på molekylær docking resultat. Komplekset af blestrin D med tyrosinase og adenylatcyklase blev udført MD-simuleringer og kørt i 100 ns ved hjælp af TIP3P-vandtilstand. Root mean square deviation (RMSD) værdierne for proteinrygradsatomer i forhold til den oprindelige struktur blev beregnet for at undersøge proteinstabiliteten i løbet af simuleringsperioden [39].

Resultater

Kemisk sammensætning

De typiske base peak kromatogram kromatogrammer for ETB og EFB blev vist i fig. 1. PeakView softwaren blev brugt til at identificere bestanddelene. Den molekylære formel blev nøjagtigt tildelt inden for massefejl på 10 ppm. Den nøjagtige molekylvægt og fragmenteringerne blev brugt til at identificere komponenterne i henhold til litteraturen og den frie kemiske strukturdatabase, såsom ChemSpider og Massbank. Som et resultat blev 39 kemiske sammensætninger, herunder 24 stilbenoider (bibenzyler, phenanthrener og deres derivater), 6 glycosider, 4 phenolsyrer, 3 quinoner, 1 steroid og 1 anden forbindelse foreløbigt identificeret fra EFB og ETB. Samtidig blev deres relative semikvantificering udført ved at måle toparealer af hver forbindelse i MS-tilstand ved hjælp af de ekstraherede ion-kromatogrammer [40]. De detaljerede oplysninger om identifikationen og deres relative indhold (højdepunkter fra varmekort, jo mørkere farve, jo højere er koncentration) blev opsummeret i tabel 1.

Antioxidant kapacitet

Det er velkendt, at ultraviolet A (UVA)-bestråling kan inducere produktion af reaktive oxygenarter (ROS) og mediere overdreven melanogenese i hudceller. Naturlig polyphenol var inhibitorerne af ROS-generering og kunne være ansvarlig for den anti-melanogeniske aktivitet af planteekstrakter [41 , 42]. I nærværende undersøgelse blev antioxidantkapaciteten vurderet gennem DPPH, ABTS radikalopfangende aktivitet og FRAPassay. Resultaterne (tabel 2 og fig. 2) viste, at EFB (IC50=5.94mg/L) har den stærkeste DPPH-radikalopfangende aktivitet in vitro sammenlignet med PTB(IC50=548.24 mg/L) , PFB (IC50=285.81 mg/L) og ETB(IC50=65.25mg/L). En lignende tendens blev observeret i ABTS og FRAP assay. De 95 procent ethanoliske ekstrakter af TB og PB havde stærkere antioxidationsaktivitet in vitro end deres rå polysaccharider. Derudover udviser EFB stærkere antioxidationsaktivitet end ETB, hvilket var i overensstemmelse med de tidligere forskningsresultater [25].

Tyrosinaseinhiberende aktivitet

Tyrosinase var det nøglehastighedsbegrænsende enzym i melaninbiosyntesevejen og blev i vid udstrækning brugt til at identificere potentialet for naturlige produkter med anti-melanogenese-effekt [43]. Resultaterne (fig. 3) viste, at ETB og EPB havde stærkere tyrosinaseinhiberende aktivitet end PTB og PPB in vitro, hvilket var i overensstemmelse med tidligere forskningsresultater [25]. EFB udviste stærkere tyrosinaseinhiberingsaktivitet på en dosisafhængig måde (mellem 20 og 200 mg/L) med IC50=58.92mg/L end ETB(IC50=75.44mg/L) og den positive forbindelse arbutin(IC{ {11}},02 mg/L).

Melaninhæmmende i zebrafisk

Zebrafish are recognized as a highly advantageous vertebrate model system to evaluate anti-melanogenesis activity, as it possesses similar organ systems and gene sequences to human beings [28]. Therefore, zebrafish was used to evaluate the anti-melanogenesis activity. As shown in Fig. 4, a large number of melanin (black spots) deposited in the zebrafish embryo in the control and 0.05% DMSO group. The microscopy images showed there was no significant difference in total melanin content between two groups (p>{{0}}.05), hvilket indikerer, at køretøjets 0,05 procent DMSO ikke påvirkede melaninproduktionen i zebrafiskembryoner. Efter eksponering for de testede prøver og arbutin i 48 timer udviste zebrafiskembryoner imidlertid varierende grader af melaninaflejring (fig. 3B, 4), undtagen PFB 10 mg/L gruppe. Det er bemærkelsesværdigt, at det relative melaninindhold i ETB 10mg/L (78,38 procent) og 30 mg/L (64,72 procent) grupper var signifikant lavere end det i PTB 10mg/L (93,06 procent) og 30mg/L (82,02 procent) grupper (p<0.01). it="" demonstrated="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activity="" of="" etb="" was="" superior="" to="" that="" of="" ptb,="" which="" was="" consistent="" with="" the="" tyrosinase="" inhibitory="" activity.="" whereafter,="" it="" is="" noteworthy="" that="" the="" anti-melanogenesis="" activities="" of="" etb="" (81.65,="" 75.61%)="" and="" efb="" (78.38,="" 64.72%)="" were="" stronger="" than="" that="" of="" arbutin="" (93.57,="" 81.48%)="" at="" the="" same="" dose="" of="" 10="" mg/l="" and="" 30="" mg/l="" (p="" <="" 0.01="" or="">

Molekylær docking

Tyrosinase er det hastighedsbegrænsende enzym i melaninbiosyntesen: hydroxylering af tyrosin til 3,4-dihydroxy-phenylalanin (DOPA) og oxidation af DOPA todopaquinon. Derfor er tyrosinase blevet betragtet som et kritisk mål for udviklingen af ​​melanogenese-hæmmere [44]. Derudover er adenylatcyclase nøgleenzym i cAMP-induceret melanogenese. Bindingen af ​​melanotropin alfa-polypeptid(-MSH) til MC1R-receptorer inducerede aktiveringen af ​​adenylatcyclase, stigning i cAMP-niveauet, opregulerede ekspression af tyrosinasegenet og øgede efterfølgende melaninsyntesen [45]. Derfor udførte vi en molekylær docking-undersøgelse af de 158 forbindelser, der tidligere var isoleret fra B. striata [2], med tyrosinase og adenylatcyclase. Bindingsenergierne for de undersøgte ligander med tyrosinase og adenylatcyclase blev opsummeret i tabel S1. Der var 83 (herunder 60 stilbenoider) og 85 (herunder 70 stilbenoider) forbindelser, der udviste stærkere bindingsaffiniteter over for tyrosinase og adenylatcyclase, sammenlignet med dem af de oprindelige ligander mimosine (− 6,4 kcal/mol) og LRE,51 /mol). 1,8-bis(p-hydroxybenzyl)-4-methoxyphenanthren-2,7-diol (56), blestrin D (75) og 2,7-dihydroxy -1,6-bis(p-hydroxybenzyl)-4-meth-oxy-9,10-dihydrophenanthren (93) var de tre øverste ligander mod tyrosinase med bindingsenergi -10,2, 10,0 og 9,7 kcal/mol, henholdsvis. Mens blestrin D(75), blestrin B (73) og 3,3'-dihydroxy-5-methoxy-2,5',6-tris(p-hydroxybenzyl)bibenzyl (42) var de tre øverste ligander mod adenylatcyclase med bindingsenergi - 12,1, - 11,9 og -11,6 kcal/mol, henholdsvis. Deres teoretiske bindingsaffiniteter og ligand-aminosyre-interaktioner blev opsummeret i tabel 3.

Det var værd at bemærke, at blestrin D (75), en biphenanthrenforbindelse, kom ind i bindingslommen af ​​tyrosinase og adenylatcyclase (fig. 5) og udviste signifikante bindingsaffiniteter mod både tyrosinase og adenylatcyclase. Van der Walls-vekselvirkningerne bidrager til den samlede energiinteraktionsværdi, mens hydroxylgruppen producerer hydrogenbindinger med henholdsvis aminosyreresterne Glu 451, Arg114 af tyrosinase og Val 167 af adenylatcyclase (tabel 3 og fig. S1). Forbindelse 93 udviste også betydelige bindingsaffiniteter mod tyrosinase gennem dannelse af 6 hydrogenbindinger med aminosyrerester Glu232, Glu451, Ser106, Cys113, Lys223 og Gln236.

I silico ADMET forudsigelse

De forudsagte værdier af adskillige vigtige parametre sammen med deres acceptable område blev opsummeret i tabel 4. Bortset fra QPlogS af 3,3', 5-trimethoxybibenzyl, blestrin B og blestrin D, og ​​QPlogBBof 3,3',{{6} }trimethoxybibenzyl, var alle de andre beregnede ADMET-egenskaber af de tre øverste hits inden for de forventede områder, i mellemtiden var QPlog HERG for alle de tre bedste hits mindre end -5, hvilket indikerer, at de var et lægemiddelpotentiale til human brug. QPlog Kp for alle de tre bedste hits for både tyrosinase og adenylatcyclase, bortset fra 3,3',5-trimethoxybibenzyl, var i det gunstige område, hvilket indikerer, at disse forbindelser let kan trænge ind i huden.

Molekylær dynamisk simulering

RMSD-plottet viste, at RMSD-værdierne af protein-ligandkomplekset ikke svingede væsentligt gennem hele simuleringsperioden. RMSD-værdierne (fig. 6A) for blestrin D med tyrosinase og ade-nylatcyclasekompleks blev bestemt i området fra henholdsvis 1,5 til 2,8 Å og fra 2.0 til 3.6Å. TheRMSF-værdien, der afspejler fleksibiliteten af ​​hver restholdende simulering. Resterne med højere RMSF-værdier viste, at de var mere fleksible (fig. 6B). RMSF-værdierne for aminosyreresterne i loop-regioner viste sig at svinge meget. Mens de aktive siterester holdt en lille RMSF-værdi (mindre end 1.0Å), såsom Arg114, Val167, Tyr226, Leu229 og Arg230in tyrosinase, og Val167, Leu102, Phe45, Lys95 og Leu166 i, cyclase hvilket indikerer, at indbindingslommerne blev holdt stabile. De molekylære interaktioner af blestrin D med tyrosinase og adenylatcyclase blev vist i fig. 7.

De bindingsfrie energier blev beregnet ved molekylær mekanik-generaliseret født overfladeareal (MM-GBSA) metode [39]. Den forudsagte frie bindingsenergi af blestrin D med tyrosinase og adenylatcyclase var henholdsvis -96,94 kcal/mol og -139,69 kcal/mol, hvilket antyder, at bindingsinteraktionerne var spontane (tabel 5). Ydermere var bidragene til fordel for ligandbinding ikke-polær solvatiseringsinteraktion, van der Waals og elektrostatisk interaktion.

Det var værd at bemærke, at typerne og indholdet af de kemiske komponenter i EFB var mere end i ETB. Toparealerne af alle de identificerede forbindelser i EFB var ca. to gange det i ETB. Militarin var de mest udbredte forbindelser i både EFB og ETB, som havde betydelige antioxidant-, anti-inflammatoriske og neuroprotection-aktiviteter, og blev valgt som de kemiske markører for kvalitetskontrol af B. striata i Chinese Pharmacopoeia2020-udgave [46]. Det relative topareal af militarine i EFB (38,39 × 106) var lidt højere end i ETB (30,48 × 106). Gastrodin er en velkendt forbindelse i mange kinesiske naturlægemidler, såsom Gastrodia elata, som udviser betydelige tyrosinaseinhiberende og radikal-fjernende virkninger [30]. Det relative topareal af gastrodin i EFB (1,43 × 106) var lidt lavere end det i ETB (2,17 × 106).

De 95 procent ethanoliske ekstrakter af TB og PB havde stærkere antioxidationsaktivitet in vitro end deres rå polysaccharider. Derudover udviser EFB stærkere antioxidationsaktivitet end ETB, hvilket var i overensstemmelse med de tidligere forskningsresultater [25]. Dette fænomen kan tilskrives, at EFB indeholder højere niveauer af antioxidantforbindelser, såsom militarine og stilbenoider (naturlige plantepolyfenoler). For eksempel, det relative topareal af 4,8,4',8'-tetramethoxy-[1,1'-biphenanthren]-2,7,2',7'-tetrol, en biphenanthren med fire phenoliske hydroxylgrupper, var 9,15×106 i FB, mens det var 0,01×106 inTB.

I nærværende undersøgelse viste PPB og PTB let tyrosinaseinhiberingsaktivitet på en dosisafhængig måde. Det viste dog, at der ikke blev påvist nogen aktivitet i det vandige ekstrakt af PB (indeholder PPB) [25]. Dette fænomen kan skyldes forskellig prøveforberedelse. Det vandige ekstrakt af PB blev brugt til at evaluere tyrosinaseinhiberende aktivitet i Jiangs eksperiment [25], mens det vandige ekstrakt i nærværende undersøgelse blev udfældet med ethanol for at opnå det rå polysaccharid.

For nylig er zebrafiskmodellen meget brugt til evaluering af anti-melanogenese-effekt in vivo [47, 48]. Arbu-tin, en hydroquinonglucosidforbindelse, der eksisterer forskellige planter, som er blevet kommercielt brugt i den kosmetiske industri, blev sat som positiv kontrol. Anti-melanogenese-aktiviteterne af ETB og EFB var stærkere end arbutins, hvilket indikerer, at ETB og EFB kan anvendes som hudlysende midler i kosmetikindustrien.

Det relative topareal af blestrin D i EFB(1,91 × 106) er ca. fire gange af det i ETB(0.46 × 10 ). Det relative topareal af forbindelse 56 (8,73 × 106) og 93 (0,64 × 106) i EFB er også signifikant højere end det i ETB (mindre end 0,01 × 106 og 0,10 × 106). Dette kan være en af ​​grundene til, at EFB udviser stærkere anti-melanogene virkninger end ETB. Det er interessant at bemærke, at top tre ligander mod tyrosinase og adenylatcyclase alle tilhører stilbenoider (bibenzyler, phenanthrener og dets derivater). Stilbenoider er de naturlige plantepolyphenoler, som har tiltrukket sig stor interesse i de sidste år på grund af deres bemærkelsesværdige bioaktiviteter såsom anti-inflammatorisk, antimikrobiel og antioxidant aktivitet [49]. Resveratrol er den mest almindelige stilbenoid. Den tidligere forskning indikerede, at resveratrol og dets derivater signifikant kan hæmme den katalytiske aktivitet, genekspression og posttranslationelle modifikationer af tyrosinase. Således viste de sig potentielt nyttige som hudlysende og antialdringsmidler i kosmetik [41, 50].

Cistanche viste sig potentielt nyttig som hudlysende og antialdringsmidler i kosmetik.

For mere information, klik venligst på billedet.

Konklusioner

I denne undersøgelse blev antioxidanten og den anti-melanogene aktivitet af det rå polysaccharid fra B. striatatuber (PTB) og fibrøse rødder (FPB) og 95 procent ethanolekstrakt af B. striata tuber (ETB) og fibrøse rødder (EFB) systematisk undersøgt . Resultaterne viste, at EFB havde den stærkeste DPPH, ABTS radikalopfangende aktivitet og ferrijern-reducerende aktivitet. Derudover kan ETB og EFB signifikant reducere tyrosinaseaktivitet in vitro og melaninsyntese af zebrafiskembryoner på en dosisafhængig måde. Molekylær docking indikerede, at der var et stort antal forbindelser, for det meste tilhørte stilbenoider, som udviste stærkere bindingsaffiniteter over for tyrosinase og adenylatcyclase sammenlignet med bindingsaffiniteten af ​​den oprindelige ligand. De nuværende resultater understøttede begrundelsen for brugen af ​​ETB og EFB som naturlige hudblegemidler i farmaceutiske og kosmetiske industrier.