Bestemmelse af Echinacosid i vandekstrakt af Cistanche Herba ved HPLC

XU + Shanshan1 ,WU+Kangyu2 ,TU+Xingming2 （1. The Third Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou + 510405 + Guangdong, Kina; 2. Det tredje tilknyttede hospital ved Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou + 510378 + Guangdong,Kina） 

Abstrakt: Objektiv En HPLC-metode blev etableret til bestemmelse afEchinacosidei vandekstrakt af CIstanche+Deserticola. MetoderEchinacosid blev bestemt ved HPLC. Adskillelsen blev udført på Inertsil ODSSP C18 kolonne med mobil fase bestod af acetonitril（A）og 0,4 procent phosphorsyreopløsning（B）,ved gradienteluering. Detektionsbølgelængden blev sat til 333 nm,og kolonnetemperaturen var 30 grader. Strømningshastigheden var 1,0 ml·min-1 og injektionsvolumenet var 10 μL.ResultaterDen lineære relation af echinacosid inden for koncentrationsområdet på 44.939 7-539.276 4 ug ·mL- 1 var god（r = 0.999 8）. Gendannelserne var 94,59 procent -105,31 procent（RSD= 2,93 procent,n = 9）. Indholdet af echinacosid i vandekstrakter af Cistanche herba var 15,527,7.347,12,267 mg·g-1 . 

Konklusion: Den etablerede HPLC-metode med god repeterbarhed er nøjagtig,enkelt og gennemførligt. Det er velegnet til bestemmelse af echinacosid i vandekstrakt afCistanche+deserticola+ma. 

Nøgleord:HPLC;vandekstrakt afCistanche+deserticola;Echinacoside;fastlæggelse af indhold

Cistanche+deserticolaer en almindeligt anvendt tonic i traditionel kinesisk medicin i klinisk praksis, og har ry for "ørken ginseng". Cistanche deserticola inkluderet i 2015-udgaven af ​​den kinesiske farmakopé er den tørrede, skællende, kødfulde stængel af Orobaceae-planten Cistanche deserticola YC Ma eller Cistanche tubulosa (Schenk) Wright. Den har en varm natur, en sød og salt smag og hører til nyre- og tyktarmens meridianer. Det har virkningerne af tonificerende nyre-yang, gavner essens og blod, fugter tarmene og lindrer forstoppelse [2]. 

Ørken ginseng

"Shennong Materia Medica Classic" siger, at den kan "nære midten, nære de fem indre organer og styrke yin og nære essensen."Cistanche deserticola indeholder hovedsageligt phenylethanoidglycosider, iridoider og glycosider, lignaner og glycosider, polysaccharider, estere og alkaloider [3].Phenylethanolglycosiderer de vigtigste aktive komponenter iCistanche deserticola, blandt hvilke echinacea og poolside er indikatorkomponenterne for identifikation og indholdsbestemmelse af Cistanche deserticola i den kinesiske farmakopé. 

Phenylethanolglycosid er den vigtigste aktive komponent i Cistanche deserticola

Farmakologiske undersøgelser [4] indikerer det Cistanche+deserticolahar forskellige farmakologiske virkninger såsom at fugte tarmene og lindre forstoppelse, beskytte leveren, modstå osteoporose, antioxidation, anti-aging og anti-træthed. Det vandige ekstrakt afCistanche deserticolakan fremme de knoglemorfogenetiske protein 2-gener fra osteoblaster hos rotter, samt den tartrat-resistente syrefosfatase og osteocalcin i serum fra ovariektomiserede mus, samt Smad1 og Smad5 generne og transformerende vækstfaktorer i knoglemarven- Udtrykket af mv. har enanti-osteoporose effekt [5-6]. Pighuder kan fremme proliferationen af ​​osteoblaster og fremme differentieringen af ​​knoglemarvs mesenkymale stamceller til osteoblaster in vitro[7-9]. 

Echinoside, den vigtigste kemiske komponent i Cistanche deserticola

Klik her for at se Natural Cistanche Echinacoside-produkter

【Ask for more】 Email: xue122522@foxmail.com /  Whats App:  0086 18599088692 /  Wechat:  18599088692

I de senere år har der været mange rapporter om bestemmelse af indholdet af echinacosid og poolside i alkoholekstraktet af Cistanche deserticola og dets sammensatte præparater [10-12], men der er få rapporter om bestemmelsen af ​​indholdet af indikatorkomponenter i vandekstraktet af Cistanche deserticola. I denne undersøgelse blev højtydende væskekromatografi (HPLC) brugt til at bestemme indholdet af echinacosid i vandekstraktet af Cistanche deserticola.

1. Materiale

1.1 Apparatur

LC-20AT højtydende væskekromatografi, SPD-20A-detektor, SIL-20En automatisk prøveudtager, CTO-10ASvp-søjletemperaturboks, LCsolution væskekromatografiarbejdsstation, Shimadzu Corporation af Japan; MES125P-OCE-DU Elektronisk Analytisk Balance, Sartorius, Tyskland; SHZ-D (III) cirkulerende vand multifunktions vakuumpumpe, Henan Yuhua Instrument Co., Ltd;

1.2RC2BSO25 rotationsfordamper kølecirkulationssystem, RV10DS96 rotationsfordamper, IKA, Tyskland; DK-S26 elektrisk termostatisk vandbad, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd; UPR-seriens ultra-rent vandmaskine, Sichuan Youpu Ultra Pure Technology Co., Ltd.

1.2 Medicinske materialer og reagenser

Kød Rong medicinsk materiale, købt fra Guangzhou Lingnan Traditional Chinese Medicine Slices Co., Ltd., batchnummer: 18010011806001, 181001. De tørrede, skællende, kødfulde stængler af Leobaceae-planten Cistanche deserticola identificeret af Thi Afing Chief Chinese Herbalist Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine er opbevaret i Drug Inspection Room på det tredje tilknyttede hospital i Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine; Echinoside referencestof, indhold 89,7 procent, China Institute for the Control of Food and Drug Control, batchnummer: 111670-201706; Acetonitril er kromatografisk rent (Merck, Tyskland); Methanol og phosphorsyre er analytisk rene (Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd.); Vand er ultrarent vand.

2. Metoder og resultater

2.1 Fremstilling af vandekstrakt fra Cistanche deserticola

Tag dencistanche pulver, tilsæt 10 gange mængden af ​​destilleret vand, opvarm og tilbagesval for at ekstrahere to gange, hver gang i 1 time. Filtrer, kombiner filtratet, og brug en rotationsfordamper til at koncentrere filtratet til et råt lægemiddelindhold på 0.100 g · mL-1. Opbevares ved 4 grader til standby. 2.2 Kromatografiske forhold og systemegnethed Kromatografisk kolonne: InertsilODS SPC18 kolonne (150 mm × 4,6 mm, 5 μ m); Mobil fase: acetonitril (A) - 0,4 procent fosforsyreopløsning (B), gradienteluering: 0~ 5min, 17 procent A; 5~25min,20 procent A; 25~30min,17 procent A; Detektionsbølgelængde: 333nm; Kolonnetemperatur: 30 grader; Flowhastighed: 1,0mL · min-1; Injektionsvolumen: 10 μ L. Under denne kromatografiske tilstand er opløsningen mellem toppene af echinacea og tilstødende komponenter større end 1,5, og det teoretiske antal kolonner bør ikke være mindre end 4000 for echinacea-toppe. Kromatogrammet er vist i figur 1.

Figur 1 HPLC-kromatogrammer af echinacosid (A) og vandekstrakt af Cistanche herba (B)

2.3 Fremstilling af opløsning

2.3.1 Referenceløsning

Vej en passende mængde afEchinacetinreferencestof, vej det nøjagtigt, anbring det i en 10mL målekolbe, tilsæt methanol for at opløse det, og lad det indeholde 898.794 Echinacetin pr. milliliter μG af referenceopløsningen, opbevaret ved 4 grader til standby.

Echinoside af Cistanche deserticola

2.3.2 Testopløsning

Mål nøjagtigt 2.0 mL vandig Cistanche deserticola-ekstrakt, inddamp i et vandbad, opløs i methanol, bring til et konstant volumen i en 10 mL målekolbe, ryst godt, 0,22 μM mikroporøst membranfiltrering, nemlig.

2.4 Undersøgelse af en lineær sammenhæng

Mål nøjagtigt {{0}}.25, 0.50, 1.00, 2.00, 2.50, og 3.00 mL af referenceopløsningen under 2.3.1 og anbring dem i en 5 mL målekolbe, tilsæt methanol til konstant volumen og ryst godt for at opnå gradientkoncentrationer på 44,9397, 89,8794, 179,7588, 359,51976,3940,3940,390 og 539,2764 μG · mL-1 af referenceopløsningen, 0,22 μM mikroporøs membranfiltrering. Udfør bestemmelsen i henhold til de kromatografiske betingelser i 2.2 og noter toparealet. Ved at bruge massekoncentrationen af ​​referencestoffet som abscisse (X, μ G · mL-1), er toparealet ordinaten (Y), og den lineære regressionsligning opnås: Y=13185. 0X-32273.0, r=0.9998. Resultaterne viste, at echinacea varierede fra 44,9397 til 539,2764 μ. Det lineære forhold inden for koncentrationsområdet g · mL-1 er godt.

2.5 Præcisionstest

Tag 539,2764 μ G · mL-1 referenceopløsning, injicer prøven kontinuerligt 6 gange i henhold til de kromatografiske betingelser i 2.2, og noter toparealet. Resultater RSD for toparealet af echinacea var 1,81 procent, hvilket indikerer god præcision af instrumentet.

2.6 Stabilitetstest

Mål nøjagtigt 2,0 mL afCistanche+deserticolavandig ekstrakt, inddamp til tørhed i et vandbad, opløs i methanol, bring til konstant volumen i en 10 ml målekolbe, ryst godt, 0.22 μ Filtrer med en mikroporøs membran, injicer prøver til bestemmelse ved 0, 2, 4, 8, 12 og 24 timer i overensstemmelse med de kromatografiske betingelser i 2.2, og noter toparealet. Resultater RSD for toparealet af echinacea var 1,16 procent, hvilket indikerer, at testopløsningen havde god stabilitet inden for 24 timer.

2.7 Repeterbarhedstest

Mål nøjagtigt 6 portioner af 2,0 ml vandigekstrakt af Cistanche deserticola, tilbered 6 portioner af testopløsningen parallelt efter metoden beskrevet i 2.3.2, injicer prøver til bestemmelse i henhold til de kromatografiske betingelser beskrevet i 2.2, og noter toparealet. Resultater RSD for massekoncentrationen af ​​echinacea var 1,28 procent, hvilket indikerer, at metoden havde god repeterbarhed.

Cistanche deserticola eksperiment

2.8 Prøvetilsætningsgendannelsestest

Mål nøjagtigt 9 portioner af 1,0 mLCistanche deserticolavandig ekstrakt, tilsæt {{0}}.8, 1.0 og 1,2 ml referenceopløsning (101,552 mg · ml - 1), inddamp i et vandbad, opløs i methanol, og bring til volumen i en ml målekolbe; Ryst godt, 0,22 μ Filter med m mikroporøs filtermembran for at forberede høj, medium og lav koncentration testopløsning. Forbered 3 dele af hver koncentration parallelt, mål i henhold til de kromatografiske betingelser i 2.2, optag toparealet, og beregn prøvens afhængighedsgenopretning. Resultaterne er vist i tabel 1.

2.9 Bestemmelse af prøveindhold

Mål 3 portioner på 2,0mL nøjagtigtvandekstrakt fra Cistanche deserticola, inddamp til tørhed i et vandbad, opløs i methanol, bring til konstant volumen i en 10mL målekolbe, ryst godt, 0,22 μ Filter med en mikroporøs membran, mål efter de kromatografiske forhold i 2.2, optag toparealet, og beregn indholdet af echinacea. Resultaterne er vist i tabel 2.

Tabel 1 Resultater af restitutionstest af echinacosid

Tabel 2 Resultater af indholdsbestemmelse af echinacosid i vandekstrakt af Cistanche herba

3.Diskussion

3.1 Fremstillingsmetode for testartikel

Det vandige ekstrakt afCistanche+deserticolaindeholder forskellige kemiske komponenter såsom phenylethanolglycosider og polysaccharider, som forårsager en vis interferens med de komponenter, der skal testes. Denne undersøgelse undersøgte to forskellige koncentrationer af opløsningsmidler, 50 procent methanol og methanol. Resultaterne viste, at adskillelseseffekten af ​​toppene i kromatogrammet af testproduktet under anvendelse af 50% methanol som opløsningsmiddel var dårlig mellem echinacea og tilstødende komponenter; Ved at bruge methanol som opløsningsmiddel er opløsningen af ​​echinacea-glykosid-toppen god, og der er ingen interferens fra andre urenhedstoppe. Derfor blev methanol valgt som opløsningsmiddel for testopløsningen. Ved anvendelse af methanol som opløsningsmiddel blev vandekstrakten af ​​Cistanche deserticola inddampet til tørhed i et vandbad. To behandlingsmetoder blev anvendt: methanolopløsning, konstant volumen omrystning og methanol ultralyd (10 min) opløsning. Resultaterne viste, at der ikke var nogen signifikant forskel mellem de to metoder. Denne metode blev valgt til at fremstille testopløsningen på grund af den simple operation med methanolopløsning og konstant volumenrystning.

Kinesisk urtecistanche

3.2 Valg af mobil fase

I denne undersøgelse blev der henvist til den mobile fase (methanol-0.1 procent myresyre), der blev brugt til indholdsbestemmelsen af ​​Cistanche deserticola i den kinesiske farmakopé (bind I) (2015). Resultaterne viste, at toppen af ​​echinacea-glykosid udvidede sig, og der var et forkantsfænomen, som kan være relateret til den mobile fases svage elueringsevne; Med henvisning til relevant litteratur [12-13] blev acetonitril-0.5 procent eddikesyre brugt som den mobile fase, men topformen af ​​echinacea var dårlig, og der var et halefænomen. I betragtning af pH-værdien af ​​den mobile fase blev acetonitril-0,4 procent fosforsyre til sidst brugt som den mobile fase. Som et resultat var det teoretiske pladetal af echinacea-toppe større end 4000, og opløsningen mellem echinacea og tilstødende komponenttoppe var større end 1,5. Topformen var symmetrisk uden interferens fra urenhedstoppe, og basislinjen var stabil. Derfor blev acetonitril - 0,4 procent fosforsyre i denne undersøgelse brugt som den kromatografiske mobile fase til bestemmelse af echinacea-indhold. I dette studie,HPLC-metoden blev anvendt til at bestemme Echinacea i vandigt Cistanche deserticola-ekstrakt.

Cistanche ekstrakt pulver

Metoden er enkel, præcis og reproducerbar. Det er velegnet til bestemmelse af echinacea i vandigt cistanche deserticola-ekstrakt og kan bruges som en kvalitetskontrolmetode for vandigt cistanche deserticola-ekstrakt.Denne undersøgelse bestemte kun indholdet af echinacea i vandekstraktet af Cistanche deserticola.I fremtiden,det er planlagt at bestemme indholdet af echinacea i det sammensatte afkog af Cistanche deserticola for at udforske virkningen af ​​forskellige faktorer på indholdet af echinacea, hvilket giver en reference til kvalitetskontrollen af ​​det afkog, der indeholder Cistanche deserticola.

reference:

[1] Zhong Ping Desert ginseng og cistanche [J] Forest and Human Beings, 2004, 24 (11): 25

[2] National Pharmacopoeia Commission Pharmacopoeia of the People's Republic of China (Del I) [M] Beijing: China Medical Science and Technology Press, 2015:135-136

[3] Chen Fei, Chen Zhuo, Xing Xuefei, et al. Forskningsfremskridt i Cistanche deserticola [J] Drug Evaluation Study, 2013, 36 (6): 469-475

[4] Fang Jian Fremskridt inden for farmakologisk forskning om Cistanche deserticola [J] Guangming Traditional Chinese Medicine, 2017, 32 (14): 2140 - 2142

[5] Xing Xiaoxu, Liu Zhongjie, Han Bo Effekt af cistanche deserticola vandigt ekstrakt på knoglemorfogenetisk protein 2-genekspression i rotteosteoblaster [J] China AnimalHusdyrhold+og+Veterinær+Medicin%2c+2013%2c+40+(1)%3a+%7b%7b3%7d%7d

[6] LIANG H,YU F,TONG Z, et al. Cistanches herba vandig ekstrakt, der påvirker serum BGP og TRAP og knoglemarv Smad1 mRNA, Smad5 mRNA, TGF- 1 mRNA og TIEG1 mRNA ekspressionsniveauer i osteoporose sygdom[J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40 （2）:757-763.

[7] Fang Hailin, Li Junkao, Yao Senming, et al Observation on Echinoside Promoting Rotte Osteoblast Proliferation by Activating ERK/BMP-2 Signal Pathway [J] Grassroots Medical Forum, 2015, 19 (4): {{5 }}

[8] Tian Yuan Undersøgelse om differentiering af knoglemarvs mesenkymale stamceller til osteoblaster induceret af echinaside og dets mekanisme [D] Shenyang: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, 2015

[9] Wei Dawei, Ge Ziyu, Liu Yihan osv. Undersøgelse af Echinoside-induceret differentiering af knoglemarvs mesenkymale stamceller til osteoblaster [J] Pharmacology and Clinic of Traditional Chinese Medicine, 2017, 33 (2): 48-52

[10] Tian Yubiao, Yang Guang'an, Huang Weijie, et al. Bestemmelse af Echinoside og Piloside i Cistanche deserticola Micropowder af HPLC [J] Anhui Agricultural University, 2015, 43 (3): 171-173

[11] Yang Sude, Hu Junhua, Li Jiachun, et al. Samtidig bestemmelse af echinosid, pilosid og isopilosid i Total Cistanche Glycoside Capsules ved HPLC [J] World Science and Technology - Modernization of Traditional Chinese Medicine, 2015, 17 (3) : 609-613

[12] Xu Xiaoxue Farmakodynamiske og metabonomiske undersøgelser af anti-osteoporose-effekter af Cistanche deserticola og dets effektive komponenter [D] Yinchuan: Ningxia Medical University, 2017

[13] Yan Yao, Meng Xinyuan, Xu Huanhuan, et al. Bestemmelse af Echinoside og Piloside i Qirong Runchang Oral Liquid ved High Performance Liquid Chromatography [J] Journal of Xinjiang Medical University, 2018, 41 (7): 886-888892