Dendrimer-tesaglitazar-konjugat inducerer en fænotypeændring af mikroglia og forbedrer -amyloid fagocytose† Del 3

D-Tesa øgede ekspressionen af ​​enzymer, der er ansvarlige for fjernelse af patogene proteiner

Insulinnedbrydende enzym (Ide) og matrixmetalloprotease 9(MMP9) er enzymer udskilt af mikroglia, der nedbryder ekstracellulært -amyloid og -synuclein.71,72 D-Tesa-behandling øgede signifikant ekspression af Ide 3.1-fold (p < 0.001) med en tendens til stigende MMP9-ekspression (1.8-foldstigning, p=0.057) sammenlignet med LPS-behandlede kontroller (fig. 6A og B).

I de senere år har flere og flere undersøgelser vist, at der er en tæt sammenhæng mellem insulinnedbrydende enzymer og hukommelse. Denne opdagelse giver os værdifulde spor til yderligere at udforske hukommelsens dannelses- og vedligeholdelsesmekanisme.

Insulinnedbrydende enzym er et vigtigt enzym, hvis hovedfunktion er at nedbryde insulin for at opretholde blodsukkerbalancen. Nylige undersøgelser har dog vist, at insulinnedbrydende enzym ikke kun spiller en metabolisk rolle, men også direkte påvirker væksten og reparationen af ​​neuroner i hjernen, og spiller en vigtig rolle i at vedligeholde hukommelsen.

Mange undersøgelser har vist, at jo højere niveauet af insulinnedbrydende enzym er, jo bedre er hukommelsen. Dette skyldes, at insulinnedbrydende enzymer kan fremme vækst og reparation af neuroner og derved forbedre hjernens indlærings- og hukommelsesevne. Derudover kan insulin-nedbrydende enzymer også fremme forbindelsen mellem neuroner og derved øge associationen og fastholdelsen af ​​hukommelsen.

Den vigtige rolle, som insulinnedbrydende enzymer har i hukommelsen, er blevet brugt i vid udstrækning inden for klinisk medicin. Forskere har fundet ud af, at ved at inhalere insulin-nedbrydende enzymer kan ikke kun hukommelsen forbedres, men også kognitive evner og depressive symptomer kan forbedres.

Kort sagt er sammenhængen mellem insulinnedbrydende enzymer og hukommelse et meget vigtigt felt, som giver os værdifulde spor til at studere hukommelsens biologiske mekanisme. Fremtidig forskning vil yderligere udforske insulin-nedbrydende enzymers funktion og rolle, hjælpe os med bedre at forstå hukommelsens dannelse og lagringsmekanisme og give et bedre grundlag for at forbedre indlærings- og hukommelsesevnen i den menneskelige hjerne. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer, som er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Cistanche også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelig næring og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik på, hvordan du kan forbedre din hukommelse

Free Tesa øgede udtrykket af ID signifikant 2-fold (p=0.011) og ikke-signifikant forøgede MMP92-fold (p=0.35) (fig. 6A) og B). M2 mikroglia i neurodegenerative sygdomme kan fjerne -amyloid, -synuclein og andre patogene proteiner via enzymatisk nedbrydning eller fagocytose, og D-Tesa opregulerer proteiner involveret i disse processer (dvs. Ide og MMP9).71–73

Ideekspression er nedreguleret i AD- og PD-patologi og er kendt for at være opreguleret af PPAR-agonister, hvilket er i overensstemmelse med vores resultater.

71,72 Funktionelt har kun en 2-fold stigning i Ide-niveauer vist sig at reducere -amyloidakkumulering og neuronal død in vivo.74,75 Derfor er den 3-dobbelte stigning i Ide observeret af D-Tesa, og 2-dobling af Ide af freeTesa kunne være terapeutisk effektiv in vivo.

D-Tesa øger fagocytose af -amyloid

CD36 er en mikroglial scavenger-receptor, der letter fagocytose og nedbrydning af -amyloid.73 Dens nedregulering iAD resulterer i nedsat fjernelse af -amyloid, men den opreguleres af PPAR-aktivering.

Både D-Tesa og fri Tesa øgede signifikant CD36-ekspressionsniveauer sammenlignet med LPS-eksponerede celler (p < 0.0001 vs. p < 0,005 for D-Tesa og fri Tesa hhv.), men D-Tesa var meget mere effektiv end gratis Tesa (6-fold stigning vs. 2.8-fold stigning for henholdsvis D-Tesa og fri Tesa, p < 0,0005) (fig. 6C) ).

Vores resultater stemmer overens med tidligere undersøgelser med pioglitazon (en anden PPAR-agonist), der viste, at øget mikroglial fagocytose af -amyloid opstår gennem en PPAR- og CD36-afhængig mekanisme.73

For at undersøge, om opreguleringen af ​​CD36 fra D-Tesatreatment korrelerede med disse cellers øgede fagocytiske evne, udførte vi et funktionelt fagocytoseassay af -amyloid. 73

Kort fortalt, efter at have behandlet cellerne, som vi gjorde i de tidligere in vitro-assays, påførte vi fluorescensmærket -amyloid1-42 på cellerne i to timer, vaskede cellerne og udførte derefter flowcytometri for at undersøge omfanget af cellulær optagelse af -amyloid. D-Tesa øgede både procentdelen af ​​celler, der fagocyterede -amyloid, og den gennemsnitlige mængde -amyloid internaliseret pr. celle (fig. 7A og B).

I modsætning til, gav fri Tesa ingen forbedringer i fagocytose af -amyloid. De overlegne effekter af D-Tesa sammenlignet med Tesa kan sandsynligvis tilskrives forbedret cellulær internalisering muliggjort af dendrimer-konjugering.

Dette er i overensstemmelse med tidligere arbejde, der viste, at over 95 % af BV2-celler behandlet med fluorescensmærket G4-PAMAM-OH havde internaliseret dendrimeren inden for 30 minutter og fortsatte med at internalisere dendrimeren i mindst 24 timer.76

Ligeledes viste konjugering af det lille molekyle minocyclin til fluorescensmærket G4-PAMAM-OH, at 99 % af BV2-celler havde internaliseret det fluorescensmærkede dendrimer-lægemiddelkonjugat inden for 3 timer.26 De viste også, at konjugatet reducerede niveauet af nitrogenoxid. til det frie lægemiddel efter behandling af BV2-celler med LPS, i overensstemmelse med vores resultater.

Cellerne behandlet med D-Tesaphagocytoserede 1.9-gang mere -amyloid end de LPS-behandlede kontrolceller (p < 0.001), hvilket er sammenligneligt med 2.5-foldstigningen på -amyloid fagocytose af primære mikroglialceller fra rotter behandlet med pioglitazon rapporteret af Yamanaka et al.73 Den lidt højere grad af -amyloid fagocytose ved den tidligere undersøgelse kunne enten skyldes, at de ikke behandlede deres celler med LPS, som vi gjorde, eller fordi primær mikroglia udtrykte PPAR ved et højere niveau end BV2-celler anvendt i denne undersøgelse.77

Som sådan kan en dosis af D-Tesa, der er lavere end den estimerede fra in vitro-eksperimenterne i vores undersøgelse, sandsynligvis være effektiv in vivo-studier og mennesker, da BV2-celler er kendt for at udtrykke PPAR ved lavere niveauer end primær mikroglia.77

Mikroglia har været impliceret i mange neurodegenerative sygdomme, og BBB har forhindret mange lægemidler, der kan modificere fænotypen af ​​mikroglia fra en pro-inflammatorisk, neurotoksisk M1-fænotype til en anti-inflammatorisk, neurobeskyttende M2-fænotype i at nå terapeutiske niveauer i hjernen.5,6, 14,15

For eksempel blev to PPAR-agonister, pioglitazon og rosiglitazon, hver undersøgt gennem fase III-kliniske forsøg for Alzheimers sygdom på grund af deres evne til at ændre fænotypen af ​​mikroglia, men mislykkedes sandsynligvis på grund af dårlig transport på tværs af BBB.13,14 Der er således klinisk interesse for forandring. fænotypen af ​​mikroglia i neurodegenerative sygdomme.

En sådan tilgang kræver levering af lægemidlet til mikroglia i tilstrækkelige niveauer til at fremkalde en reaktion. Med henblik herpå har G4-OH-PAMAM dendrimerer vist sig at levere lægemidler til mikroglia i mange dyremodeller efter systemisk injektion, og som følge heraf bliver de i øjeblikket evalueret i kliniske forsøg til behandling af ccTLD (NCT03500627) og svær COVID -19 associeret inflammation (NCT04458298).18–28

For at kombinere de gavnlige virkninger af at ændre mikroglial fænotype med evnen til at levere lægemidler til mikroglia, konjugerede vi tesaglitazar (en PPAR / dobbelt agonist) til en G4-OH-PAMAMdendrimer (fig. 1-3). Vi demonstrerede, at D-Tesa er i stand til at ændre fænotypen af ​​M1 mikroglia mod en M2-fænotype (fig. 4 og 5), hvilket resulterer i et fald i sekretionen af ​​skadelige reaktive oxygenarter.

Desuden påviste vi, at mikroglia behandlet med D-Tesa øger deres ekspression af enzymer, der nedbryder patologiske proteiner såsom -synuclein og -amyloid, samt opregulerer fagocytosen af ​​-amyloid i et funktionelt assay (fig. 6 og 7).

Selvom vi ikke præsenterer data, der viser D-Tesas evne til at omgå BBB og akkumulere i mikroglia, har vi tidligere vist, at G4-OH-PAMAM lægemiddelkonjugater med lignende lægemiddelbelastning, størrelse og zeta-potentiale er i stand til at passere gennem svækket BBB og akkumulerende inmicroglia efter intravenøs administration.26,36,52

Disse resultater understøtter den videre udvikling af D-Tesa til behandling af flere neurologiske sygdomme. Mens vi fokuserer på Alzheimers og Parkinsons sygdomme i denne artikel, har D-Tesa potentialet til klinisk oversættelse af flere neurologiske lidelser. På grund af mikroglias lignende rolle i patologien af ​​multiple neurodegenerative sygdomme, blev PPAR-agonisten pioglitazon også undersøgt eller er i øjeblikket ved at blive undersøgt i fase II kliniske forsøg for Parkinsons sygdom,78 ALS,79 adrenomyeloneuropati(NCT03864523), multipel sklerose og hæm092T0831 opløsning ved intracerebral blødning (NCT00827892).

Hvis disse kliniske forsøg også mislykkes på grund af dårlig levering af pioglitazon på tværs af BBB, kunne D-Tesa overvinde denne leveringshindring og behandle patienter med disse sygdomme.

Andre grupper har brugt nanopartikler til at forbedre leveringen af ​​PPAR-agonister til makrofager, men de har ikke forsøgt at levere disse agonister til mikroglia. Osinski et al. demonstrerede, at Tesa-ladede liposomer for det meste blev optaget af makrofager i visceralt hvidt fedt i en mandlig leptin-mangel fedmemodel.80

De viste desuden, at Tesa-ladede liposomer ikke ændrede ekspressionen af ​​M1-markøren Mcp-1, men øgede ekspressionen af ​​M2-markøren Arg1, mens behandling med fri Tesa reducerede det samlede antal M1-makrofager og ekspressionen af ​​Mcp{{6 }}, og øgede ikke udtryk for Arg1.

Nakashiro et al. brugte poly(mælke-co-glykolsyre) (PLGA) nanopartikler til at levere pioglitazon (en PPAR-agonist) til makrofager i forbindelse med åreforkalkning.81

In vivo viste de, at PLGA-pioglitazon reducerede niveauet af immunceller i blodet. Inprimære knoglemarvs-afledte makrofager behandlet med LPS og interferon-, fandt de, at PLGA-pioglitazon øgede IL-4 og IL-10 (M2-markører) og ikke reducerede IL-6- eller TNF-niveauer.

Deres resultater ligner vores; M2-markører blev øget ved behandling med nanopartikel-PPAR-agonist, mens IL--6- og TNF-niveauer ikke faldt. Di Mascolo et al. brugte PLGA-polyvinylalkohol-nanopartikler til at levere rosiglitazon (en anden PPAR-agonist).82

In vitro viste de, at deres nanopartikel-lægemiddelkomplekser reducerede iNOS-, TNF- og IL-1-ekspression i knoglemarvs-afledte makrofager. De forbehandlede deres celler med nanopartikellægemidlet før stimulering med LPS, mens vi forbehandlede celler med LPS før behandling med D-Tesa, hvilket kunne være en årsag til, at vi ikke observerede fald i TNF- og IL-1, selvom vi også observerede fald i iNOS-udtryk.

Konklusion

Der er i øjeblikket ingen patologiændrende behandling for mange neurodegenerative sygdomme, og efterhånden som befolkningen fortsætter med at leve, vil forekomsten og omkostningerne ved behandling af disse sygdomme fortsætte med at stige, hvilket understreger det presserende behov for en løsning, der skal udvikles. For nylig er pro-inflammatoriske M1 mikroglia kritiske i patologien af ​​flere neurodegenerative sygdomme.

Efterfølgende, at være i stand til at afgive lægemiddel på tværs af blod-hjerne-barrieren, der kan inducere et 'M1 tilM2'-fænotypeskift i mikroglia, har terapeutisk potentielle flere sygdomme, især Alzheimers og Parkinsons sygdom.

D-Tesa blev designet til at levere et 'M1 til M2'-inducerende lægemiddel til mikroglia efter systemisk administration for at reducere mikroglial sekretion af neurotoksiske stoffer, samtidig med at det inducerer en anti-inflammatorisk tilstand, der øger nedbrydning og fagocytose af patogene proteiner i hjernen. Vi har med succes syntetiseret D-Tesa ved hjælp af en yderst effektiv klikkemimetode.

Lægemidlet er knyttet til dendrimeren via en esterbinding, der kan spaltes intracellulært ved lysosomale forhold, hvor ca. 60 % af Tesa frigives i de første 48 timer under lysosomale forhold.

D-Tesa viste sig at være bedre end Tesa in vitro ved at inducere et M1 til M2a/M2b/M2cfænotypeskift, hvilket resulterede i reduceret nitrogenoxidsekretion, øget ekspression af -synuclein og -amyloidnedbrydende enzymer og øget fagocytose af -amyloid.

D-Tesa kombinerer således dendrimerens fordelagtige leveringsegenskaber med Tesa's M1 til M2-omskiftningsegenskaber. På grund af mikroglias fælles rolle og den fælles terapeutiske fordel ved at inducere et M1 til M2 fænotypeskift, har D-Tesa potentialet til at behandle mange neurologiske lidelser, når det administreres på det rigtige stadium af sygdomsprogression.

Forfatterbidrag

LD, AS, KL, RS, SK og RMK konceptualiserede eksperimenterne. LD, AS og RS udførte syntese og karakterisering af dendrimer-lægemiddelkonjugatet. LD, KL og JJ udførte celleforsøgene. LD og K. L. udførte statistikken. LD og AS skrev manuskriptet, og alle forfattere redigerede manuskriptet.

Interessekonflikter

RMK og SK er medopfindere af at bruge den hydroxylterminerede dendrimer til målrettet levering til mikroglia ved neurologiske sygdomme, såvel som patenter relateret til dendrimerteknologien beskrevet i dette papir.

De er medstiftere af Ashvattha Therapeutics, Orpheris Inc. og RiniSight Inc., som er virksomheder, der leder den kliniske udvikling af platformen. SK og RMK er bestyrelsesmedlemmer i AshvatthaTherapeutics Inc. RS er i øjeblikket ansat i AshvatthaTherapeutics og ejer aktier i virksomheden; arbejdet R. S. udførte for dette papir blev udført, før han sluttede sig til Ashvattha. Interessekonflikten styres af JohnsHopkins University.

Anerkendelser

Vi vil gerne takke Elizabeth Smith Khoury for nyttige diskussioner af in vitro eksperimenterne. Dette projekt blev finansieret af Patz Distinguished Professorship Endowment fra JohnsHopkins og NICHD (bevillingsnummer HD076901) (RMK). Tak Wilmer Core Grant for Vision Research, Microscope og Core Module (bevillingsnummer EY001865) for adgang til Sony flowcytometeret.

Vi takker Servier Medical Arts for brugen af ​​deres samling af billeder (http://smart.servier.com/), der er licenseret under en Creative Common Attribution 3.0 Generic License, som blev ændret for at gøre den grafiske abstrakt.

Referencer

1 CL Gooch, E. Pracht og AR Borenstein, Byrden af ​​neurologisk sygdom i USA: En sammenfattende rapport og opfordring til handling, Ann. Neurol., 2017, 81, 479-484.

2 JL Cummings, T. Morstorf og K. Zhong, pipeline til udvikling af lægemidler til Alzheimers sygdom: få kandidater, hyppige fejl, Alzheimers Res. Ther., 2014, 6, 37.

3 P.-P. Liu, Y. Xie, X.-Y. Meng og J.-S. Kang, Historie og fremskridt for hypoteser og kliniske forsøg for Alzheimers sygdom, Signal Transduction Targeted Ther., 2019, 4, 1-22.

4 C. Soto og S. Pritzkow, Proteinfejlfoldning, aggregering og konformationelle stammer i neurodegenerative sygdomme, Nat. Neurosci., 2018, 21, 1332-1340.

5 VH Perry og C. Holmes, Microglial priming in neurodegenerative disease, Nat. Rev. Neurol., 2014, 10, 217-224.

6 Y. Tang og W. Le, Differential Rolls of M1 and M2Microglia in Neurodegenerative Diseases, Mol. Neurobiol., 2016, 53, 1181-1194.

7 MW Salter og B. Stevens, Microglia dukker op som centrale aktører i hjernesygdomme, Nat. Med., 2017, 23, 1018-1027.

8 S. Krasemann, et al., The TREM2-APOE Pathway Drives the Transcriptional Phenotype of Dysfunctional Microglia in Neurodegenerative Diseases, Immunity, 2017, 47, 566–581.e9.

9 Q. Zhao, et al., De antidepressiva-lignende virkninger af pioglitazon i en musemodel med kronisk mild stress er forbundet med PPAR-medieret ændring af mikrogliale aktiveringsfænotyper, J. Neuroinflammation, 2016, 13, 259.

10 L. Wen, et al., Polarisering af mikroglia til M2-fænotypen i en peroxisomproliferator-aktiveret receptor Gamma-afhængig måde dæmper aksonal skade induceret af traumatisk hjerneskade hos mus, J. Neurotrauma, 2018, 305-232305, 232305, 232305.

11 W. Cai, et al., Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR): En master gatekeeper i CNS-skade og reparation, Prog. Neurobiol., 2018, 163-164, 27-58.12 B. Brakedal, et al., Glitazonbrug forbundet med reduceret risiko for Parkinsons sygdom, Mov. Disord., 2017, 32, 1594-1599.

For more information:1950477648nn@gmail.com