Cyanobakterier Sekundære metabolitter som bioteknologiske ingredienser i naturlig anti-aldringskosmetik 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

2.3.Biologiske aktiviteter

2.3.1. Radikal rensningsaktivitet

Superoxidanionradikalen er en fysiologisk fri radikal med ekstrem betydning for den menneskelige krop. Når der er en overproduktion af denne ROS under aerob respiration, eller når de endogene afgiftningsmekanismer svigter eller er utilstrækkelige, er der en øget risiko for oxidativ skade med alvorlige skadelige virkninger. I denne forstand er det af afgørende betydning at finde mekanismer til at hæmme de skadelige virkninger af Oz*, ikke kun inden for kosmetik, men også i overvejelserne om forbedring og forebyggelse af en bred vifte af sygdomme. O2"-opfangningsadfærden af ​​cyanobakterieekstrakter vises i figur 1, og IC-værdierne er opsummeret i tabel 6.

De vandige ekstrakter var signifikant mere effektive til Oz*-opfangning end acetoneekstrakterne (tabel 6) og udviste en dosisafhængig aktivitet (figur 1), hvor ferskvandsstammerne skilte sig ud fra de marine stammer. Cephalothorax lacustris LEGE 15493 var den mest effektive stamme med den laveste ICso-værdi (65,5 ug tørt ekstrakt/ml, p.<0.05), followed="" by="" leptolyngbya="" boryana="" lege="" 15486="" and="" nodosilinea="" nodulosa="" lege="" 06104.="" leptolyngbya="" cf.="" ectocarpi="" lege="" 11479="" was="" the="" only="" strain="" that="" did="" not="" reach="" the="" ic5o="" for="" the="" aqueous="" extract="" (table="" 6).="" on="" the="" other="" hand,="" the="" acetone="" extract="" of="" this="" strain="" was="" the="" most="" effective="" in="" o2*-="">

Klik venligst her for at vide mere

En sammenligning af antioxidantkapaciteterne blandt forskellige cyanobakterier er udfordrende på grund af de forskellige anvendte metoder. Morone og kolleger evaluerede den radikale fjernelsesevne af ethanol (70 procent v/v) ekstrakter af forskellige cyanobakteriestammer [26], idet den laveste ICso-værdi var 822,70 ug/mL for Phormidium sp.LEGE 02 05292, mens ingen aktivitet blev detekteret for Nodosilinea nodulosa LEGE 06102. Lopes og medarbejdere rapporterede O2-opfangende aktivitet for Nodosilinea (Leptolynbbya) Antarktis LEGE13457 og Cuspidothrix issatschenkoi LEGE 03282 acetoneekstrakter, med IC-værdier på 2615 og 2615-værdier for 2615- og 2615 ligesom sp.LEGE 13412 [27]. Forfatterne rapporterede også en højere effektivitet i acetoneekstrakterne sammenlignet med ethanolekstrakter. En anden undersøgelse udført af Amaro og kolleger afslørede IC50-værdier på 1394 og 826 ug/mL for Gloeothece sp. og Scenedesmus obliquus (M2-1), henholdsvis [37]. Resultaterne opnået heri for acetoneekstrakter virker mindre lovende end de tidligere rapporterede, selvom de er inden for samme størrelsesorden. På den anden side afslørede de vandige ekstrakter et enormt potentiale, der er værd at udnytte yderligere med hensyn til kosmetiske anvendelser inden for hudældning.

2.3.2. Enzymhæmning

MMP'er er en familie af ekstracellulære zinkafhængige enzymer, hvis hovedfunktion er at ombygge og nedbryde ECM[38], et gel-lignende materiale, der er vigtigt for at holde celler sammen og give en vej for næringsstoffer og ilt [39]. Ændringer i ECM-komponenterne, såsom kollagen og elastin, induceret af MMP'er er grundlaget for hudskader og rynkedannelse [40]. Sammen med disse enzymer, forbundet med hudstruktur og rynkedannelse, indtager en anden en afgørende rolle i ældningsprocessen på grund af dens aktivitet i melanogenese: tyrosinase. Blandt andre faktorer forårsager UVR-eksponering en ophobning af en unormal mængde melanin på grund af øget ROS-produktion. Disse reaktive arter påvirker aktiviteten af ​​melanocytter, hvilket øger omdannelsen af ​​tyrosin til melanin ved oxidation, hvilket fører til hyperpigmentering og uregelmæssige hudpletter [41].

Cistanche kan anti-aging

I søgningen efter naturlige alternativer til kommercielle anti-aldringsingredienser, med fokus på enzymerne nævnt ovenfor, blev aktiviteten af ​​cyanobakterieekstrakter undersøgt (figur 2). Med hensyn til HAase var kun tre stammer i stand til at inhibere dette enzym, idet de virkede på en dosisafhængig måde: det vandige ekstrakt af Leptolyngbya jf. ectocarpiLEGE 11479 (IC50=863 ug/mL), og acetoneekstrakterne af Cephalotrix lacustris LEGE 15493 og Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, hvor de to sidstnævnte kun når IC25 (henholdsvis 832 og 995 ug/m). Selvom disse værdier synes høje, svarede deres aktivitetsområde til det for referencelægemidlet dinatriumcromoglikat (DSCG) (IC50=105 ug/mL). Desuden er det værd at nævne, at for den højeste testede koncentration (1 mg/mL), Leptolyngbya jf. ectocarpi LEGE 11479 hæmmede dette enzym i 80 procent (figur 2), hvilket gør dette ekstrakt lovende som en kosmetisk ingrediens.

Få undersøgelser har rapporteret om den potentielle effekt af cyanobakterieforbindelser og ekstrakter på hyaluronidase-aktivitet, og enhver sammenligning af ekstrakters biologiske potentiale bør tage højde for, at cyanobakteriel metabolisme lider af betydelig variation afhængigt af dyrkningsbetingelserne, hvilket påvirker ekstrakternes kemiske sammensætning. Morone og kolleger [26] evaluerede effekten af ​​ethanolekstrakter af Tychonema sp. LEGE 07196 og Cyanobium sp. LEGE 07175 på hyaluronidase, og fandt en stærkere hæmmende aktivitet med ICso-værdier på henholdsvis 182,74 og 208,36 ug/mL. Aktiviteten af ​​ethanolekstrakter er også blevet rapporteret for en uopløselig fraktion af Spirulina platensis med en IC5o på 150 ug/mL[42]. En anden undersøgelse, udført af Yamaguchi og Koketsu [19], viste, at Nostochopsis lobatus MAC0804NAN producerede en stor mængde polysaccharider med en høj hæmmende effekt (IC50=7.18 ug/mL). Det blev også rapporteret, at en Arthrospira- afledt peptid kan være involveret i hyaluronidasehæmning [4]. Tilsammen understøtter disse resultater potentialet af cyanobakterieforbindelser og ekstrakter som anti-aging ingredienser til kosmetiske applikationer.

I betragtning af elastase viste kun acetoneekstrakter interessant bioaktivitet. Leptolyng-bya jfr. ectocarpi LEGE 11479 var igen den mest aktive (figur 2), idet den var den eneste stamme, der nåede ICso, med en værdi på 391 ug/ml. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, Cephalotrix lacustris LEGE 15493 og Leptolyngbya boryana LEGE 15486 nåede kun IC25 med værdier på henholdsvis 126,86 og 99 ug/mL. Hvad angår hyaluronidase, har marine stammer vist sig at være de mest lovende.

Så vidt vi ved, er der ingen tidligere rapporter om elastaseinhiberende aktivitet for de heri udforskede stammer. Med hensyn til andre stammer blev det opdaget, at Nostoc minutum producerede mikroviridin-type peptider og nostopeptiner med ICso =1.3 og 11.0 ug/mL [44,45]. Mikroviridiner B og indeholdt fra Microcystis aeruginosa hæmmede også elastase effektivt med ICso-værdier på 0.044 og 0,084 ug/mL [46]. De fleste af de tilgængelige data vedrørende elastasehæmning fokuserer på isolerede forbindelser, så sammenligninger med ekstrakterne fra vores stammer er svære at lave.

Ujævn hudpigmentering, der er forbundet med både aldring og UV-eksponering, er fortsat en stor bekymring for aldrende befolkninger og kosmetiske industrier. Størstedelen af ​​de tilgængelige undersøgelser er ubetydelige og bruger svampetyrosinase som en enzymatisk model, hvilket gør det vanskeligt at oversætte resultaterne til det menneskelige miljø, ikke desto mindre har dette enzym en høj lighed og homologi med human tyrosinase[47]. Den samme enzymatiske model blev således brugt heri til at udforske potentialet af cyanobakterieekstrakter i tyrosinaseinhibering. Hvad angår elastase, var kun acetoneekstrakter i stand til at inhibere tyrosinase. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 var den mest effektive (figur 2), idet den var den eneste stamme, der nåede IC#N (989,26±4,3 ug/mL). Herunder var Leptolyngbya boryana LEGE 15486 med IC25=784 78ug/4,33 ug ml, og til sidst Leptolyngbya cf.ectocarpi LEGE 11479, hvor de mest lovende resultater blev fundet for de marine stammer.

Morone og kolleger [26] undersøgte tidligere aktiviteten af ​​cyanobakterier ethanoliske ekstrakter i samme model, men fandt ingen aktivitet. Et interessant aspekt af dette er, at en af ​​de undersøgte stammer var Nodosilinea nodulosa LEGE 06102, som viste de bedste resultater heri, hvilket endnu en gang understregede vigtigheden af ​​ekstraktionsopløsningsmidlerne for at opnå målrettede bioaktive ekstrakter. Hvad angår de andre undersøgte enzymer, er undersøgelser med fokus på cyanobakterier også knappe for tyrosinase. Ir-arbejde udført af Yabuta og hans team [48], blev det rapporteret, at varmtvandsekstraktet fra Nostochopsis spp. hæmmede signifikant tyrosinaseaktiviteten (IC50=250 ug/mL). Dette er et meget interessant resultat i betragtning af, at det stammer fra et vandigt ekstrakt, for hvilket der ikke blev fundet nogen aktivitet i nærværende undersøgelse. Forfatterne tilskriver resultatet de lavmolekylære forbindelser, der frigives fra PBP'er ved varmebehandling, nemlig en bilin-del, der fungerer som en potent peroxyl-radikalopfanger. En anden undersøgelse evaluerede den hæmmende aktivitet af Arthrospira platensis ethanol (IC50=14,000 ug/mL) og vand (IC50 =72,000 ug/mL) ekstrakter, hvor værdier blev tilskrevet tilstedeværelsen af ​​phenoliske forbindelser såsom ferulsyre og koffeinsyrer i ethanolekstraktet [49].

2.3.3.UV-beskyttelse

Selvom et stigende antal kosmetiske virksomheder inkorporerer solblokkere i deres produkter, er det stadig svært at overbevise forbrugerne om fordelene ved deres daglige brug for at bremse for tidlig hudældning. Hvis på den ene side den daglige anvendelse af solblokkere er en lidt indgroet vane, er der på den anden side en vis frygt ved brugen af ​​syntetiske stoffer på grund af deres uvelkomne tilknyttede risici[50]. I forlængelse heraf er forskningen i naturlig fotobeskyttelse steget betydeligt i de sidste par år i betragtning af deres potentiale for biologisk nedbrydelighed og lavere toksicitet, hvilket gør dem mere gavnlige for mennesker og miljøet. For at udforske cyanobakterieekstrakter på dette område blev deres evne til at fungere som solcremer evalueret in vitro for UVR-B, da det er den mest skadelige stråling. Resultaterne fundet for vandige cyanobakterier og acetoneekstrakter er vist i tabel 7.

Med hensyn til acetoneekstrakter blev den mest lovende værdi(19,2) fundet for Leptolyngbya boryana LEGE 15486, efterfulgt af Leptolyngbya cf.ectocarpiLEGE 1479(10,7), begge ved den laveste testede koncentration, 200 ug/mL. Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 var den mindst lovende blandt acetoneekstrakter. I vandige ekstrakter blev de mest lovende resultater opnået for den højeste testede koncentration, hvor Leptolyngbya boryana LEGE 15486 og Cephalotrix lacustris LEGE 15493 skilte sig ud med in vitro SPF-værdier på henholdsvis 17,1 og 14,9 (tabel 7).cistanche levetid forlængelseVed at diskutere tidligere undersøgelser på dette felt rapporterede Hossain og hans team [51] at SPF-værdien for Cephalotrix komarekiana-ekstrakt var 2,37. En anden gruppe fandt, at SPF for et methanolekstrakt af Aphanizomenon flos-aquae var 4 [52]. Oplysningerne om koncentrationen af ​​ekstrakten anvendt af forfatterne var imidlertid ikke tilgængelige, hvilket gjorde mulige sammenligninger vanskelige.

Antallet af cyanobakteriestammer, der er udforsket inden for kosmetik, især med hensyn til SPF, er meget sparsomt i betragtning af disse ressourcers muligheder. De heri præsenterede re-resultater viser, at arten under undersøgelse kan være gode muligheder som biologiske fotobeskyttere og muligvis fungere som boostere til andre solcremer, der i øjeblikket markedsføres, hvilket muliggør en reduktion i koncentrationen af ​​syntetiske solcremer i formlerne. Derfor er det afgørende at øge forskningen i disse organismer, især deres bioaktive ekstrakter, at de er af væsentligt lavere omkostninger, højere udbytte og hurtigere opnåelse end isolerede forbindelser, er mere miljøvenlige og økonomisk mere attraktive.

2.4. Diskrimination af cyanobakterieekstrakter ved PCA-analyse

Søgningen efter bioaktive forbindelser fra naturlige kilder med potentiale for anvendelse som ingredienser inden for kosmetik er vokset i de senere år. Ud over at være potentielt mindre giftige og fuldstændig biologisk nedbrydelige, er cyanobakterier-afledte forbindelser tilgængelige fra vedvarende kilder og kan fås til lave omkostninger i et kontrolleret miljø.cistanche nzKlassificeringen af ​​bioaktive ekstrakter i henhold til deres kemiske sammensætning og biologiske aktiviteter kan være værdifuld for at påpege potentielle sammenhænge. I denne henseende blev principal komponentanalyse (PCA) anvendt under hensyntagen til den kemiske sammensætning af cyanobakterieekstrakter og bioaktiviteten af ​​den højeste koncentration testet i hvert assay (figur 3). Som det kan observeres, kunne 72,99 procent af variabiliteten forklares af de to første dimensioner: PCl tegnede sig for 50,41 procent af variansen, mens PC2 var ansvarlig for 22,58 procent. Der blev skelnet mellem tre grupper (Figur 3A) ): Gl, der involverer Leptolyngbya cf. exocarp LEGE 11479 vandekstrakt; G2, der involverer vandekstrakterne Cephalotrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryama LEGE 15486 og Nodosilinea nodulosa LEGE 06104; og G3, der involverer alle acetoneekstrakterne. Ifølge figur 3B er Gl kemisk adskilt fra de andre prøver på grund af PE-indholdet; Cephalotrix lacustris LEGE 15493, Leptolyngbya boryana LEGE 15486 og Nodosilinea nodulosa LEGE 06104 vandekstrakter er grupperet efter deres indhold i PC, APC og totalproteiner (G2), mens alle acetoneekstrakterne findes i samme gruppe (G3)du. til deres indhold i carotenoider og klorofyl a og dets derivater. Forbindelserne ud over de enzymatiske aktiviteter vises med planerne dannet med den positive PCl-akse (figur 3B). Det kan observeres, at prøver med højere indhold af klorofyl a og carotenoider er nært beslægtet med elastase og tyrosinaseinhibering. Dette demonstreres af den stærke positive sammenhæng mellem carotenoider og elastase (0,725,p<0.01) and="" tyrosinase=""><0.01) inhibition,="" with="" similar="" observations="" between="" chlorophyll="" a="" and="" the="" same="" enzymes=""><0.01 and=""><0.05,respectively). on="" the="" other="" hand,="" hyaluronidase="" inhibition="" is="" more="" correlated="" vvith="" pe="" content="" (figure="" 3b),="" with="" a="" significant="" positive="" correlation="" between="" the="" values=""><0.01).the compounds="" responsible="" for="" the="" radical="" scavenging="" activity="" of="" the="" extracts="" are="" displayed,="" with="" the="" planes="" formed="" with="" the="" pcl="" negative="" axis.="" the="" closest="" correlation="" is="" observed="" for="" tpc=""><0.05); other="" compounds="" such="" as="" total="" proteins,="" pc,and="" apc="" also="" contribute="" to="" the="" activity,="" although="" to="" a="" lower="" extent="" (figure="" 3b).regarding="" the="" spf,="" there="" is="" a="" close="" correlation="" between="" the="" activity="" of="" the="" extracts="" and="" their="" pbp="" content,mainly="" apc=""><0.01)and pc="" (0.838,="" p="" <="" 0.01),="" which="" points="" to="" these="" compounds="" as="" predominantly="" responsible="" for="" blocking="" uv-b="" radiation.="" the="" total="" protein="" content="" also="" contributed="" to="" this="" biological="" activity="" (0.670,=""><0.01), with="" the="" lowest="" contribution="" being="" observed="" for="" pe="" (0.210,p="">0.05). Generelt tillod PCA-analysen gruppering af ekstrakter i henhold til de biologiske aktiviteter, der vises inden for hudældning, hvilket førte til den konklusion, at acetoneekstrakter er mere effektive til at hæmme enzymer, der er ansvarlige for nedbrydningen af den dermale matrix og tab af hudstruktur, mens vandige ekstrakter er mere effektive til at fjerne frie radikaler og beskytte huden mod de skadelige virkninger af UV-stråling.

Så vidt vi ved, er det første gang, at der er etableret en sammenhæng mellem den kemiske sammensætning og biologiske aktiviteter af ekstrakter fra disse cyanobakteriestammer.

3. Materialer og metoder

3.1. Cyanobakterier Biomasseproduktion

Fire filamentøse cyanobakterielle stammer, Cephalotrix lacustris LEGE 15493 og Lep-tolyngbya boryana LEGE 15486, fra brasilianske ferskvandsøkosystemer, og Leptolyngbya jf. ectocarpi LEGE 11479 og Nodosilinea nodulosa LEGE 06104, fra portugisiske marine økosystemer, blev brugt i denne undersøgelse. Stammerne blev vedligeholdt i Blue Biotechnology and Ecotoxicology Culture Collection (LEGE CC) på det tværfaglige center for hav- og miljøforskning (CIIMAR). Til biomasseproduktionsformål blev der sat en opskaleringskulturordning, startende med 40 ml under laboratorie- kontrollerede forhold, sekventielt skaleret op til 4 L. Stammerne blev dyrket i Z8-medium [53], suppleret med 10 ug/L vitamin B12 og 25 g/LNaCl til marinestammer. Kulturer blev holdt ved 25 grader, med en lysintensitet på 10 umol fotoner m-2 s-4 og med en fotoperiode på 14 timer lys:10 timer mørke. Den friske biomasse blev opsamlet efter 120 eller 150 dages vækst (afhængigt af stammen) via filtrering og frosset, frysetørret og opbevaret ved -20 grad indtil ekstraktfremstilling.

3.2. Forberedelse af ekstrakter

To forskellige ekstrakter blev sekventielt fremstillet fra hver stamme: acetone og vandig. Først blev acetoneekstrakten fremstillet under anvendelse af 2 g tør biomasse. Biomassen blev suspenderet i acetone og ekstraheret i 10 minutter i et ultralydsbad (Fisherbrand[FB15053, Loughborough, UK). Efter acetoneekstraktionen blev den resulterende pellet efterladt til tørre i stinkskabet og derefter ekstraheret med 70 ml destilleret vand efter samme procedure. Cellerester blev fjernet ved centrifugering ved 10,00×× g Gs i 5 minutter ved 4 grader, i en HERAEUS MegafugeTM 16R mikrocentrifuge (Thermo ScientificTM, Waltham, MA, USA). Supernatanter fra hver ekstraktion blev fordampet under reduceret presure (BUCHIR-210 Rotationsfordamper) (acetoneekstrakt), eller frosset og frysetørret (vandigt ekstrakt). Ekstraktion med den tilsvarende supernat blev gentaget 3 gange. De tørre ekstrakter blev holdt ved -20 grad indtil yderligere kemisk og biologisk analyse.

3.3. Celleanalyser

3.3.1.Cellekultur

Humane keratinocytter HaCAT(ATCC), musefibroblaster 3L1(ATCC) og humane endotelceller hCMEC (leveret af Dr. POCouraud (INSERM)) blev brugt til cytotoksicitetsevaluering. Cellelinjer blev dyrket i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM GlutaMAXTM, Gibco, Glasgow, UK), suppleret med 10 procent (v) føtalt bovint serum (Gibco), 1 procent penicillin-streptomycin (Pen-Strep 100 IE) hhv./ml og 10 mg/ml) (Gibco) og 0,1 procent Amphotericin B (Gibco). Cellevedligeholdelse og assays blev udført ved 37 grader i en 5 procent CO2 befugtet atmosfære, og dyrkningsmediet blev fornyet hver anden dag. Ved 80-90 procent cellekonfluens blev adhærente celler vasket med phosphatbufret saltvand (PBS, Gibco), løsnet med TrypLEX express enzym (1×)(Gibco), sendt til vedligeholdelse og podet til de planlagte assays.

3.3.2.Cytotoksicitet—MTT-assay

Cellulær levedygtighed blev evalueret ved reduktionen af ​​{{0}}(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTI, Sigma-Aldrich, Tyskland) assay, som tidligere rapporteret [26]. Alle cellelinjer (endotelceller, fibroblaster og keratinocytter) blev podet i 96-brøndsplader med en tæthed på henholdsvis 1,0 × 10 celler/ml, 3,3 × 104 celler/ml og 2,5 × 104 celler/ml.cistanche penis størrelseEfter 24 timers celleadhæsion blev dyrkningsmediet fjernet, og cellerne blev eksponeret i 24 og 48 timer for frisk medium indeholdende de forskellige cyanobakterieekstrakter i fem serielle koncentrationer, fra 12,5 til 200 ug/ml. Til acetoneekstrakterne blev stamopløsninger fremstillet i dimethylsulfoxid (DMSO) (Gibco) og fortyndet med DMEM før cellernes eksponering, således at den maksimale DMSO-koncentration ikke oversteg 1 procent. Vandige ekstrakter blev fremstillet i PBS og fortyndet med DMEM før celleeksponering. Den negative kontrol var PBS, og kontrollen for celledød var DMSO 20 procent. Efter inkubation blev MIT cytotoksicitetsassayet udført. Kort fortalt blev 20 μL MTT-opløsning tilsat til hver brønd og inkuberet ved 37 grader i 3 timer. Efter inkubation blev mediet forsigtigt fjernet, og de lillafarvede formazansalte blev opløst i DMSO. Absorbansen blev aflæst ved 550 nm med en Synergy HT multi-detektion mikropladelæser (Biorek, Bad Friedrichshall, Tyskland) drevet af GEN51M software. Assayet blev kørt i firdobbelt og gennemsnittet. For reproducerbarhed blev hvert assay gentaget uafhængigt mindst tre gange. Cytotoksicitet blev udtrykt som procentdelen af ​​cellelevedygtighed under hensyntagen til 100 procent levedygtighed i opløsningsmiddelkontrollen.

3.4. Kemisk profilering af cyanobakterieekstrakter

3.4.1.Totalt phenolindhold (TPC)

For at bestemme ekstrakternes TPC blev der anvendt et kolorimetrisk assay baseret på Folin-Ciocalteu metodologien [54] med små modifikationer. Acetoneekstrakterne blev solubiliseret i DMSO, og de vandige ekstrakter i vand. Kort fortalt blev 25 μL af hvert ekstrakt (10mg/mL) fuldstændigt blandet med 25 μL Folin-Ciocalteu-reagens (Sigma-Aldrich)20{{20}} μL NagCO3-opløsning og 500 μL deioniseret vand. Til blindprøven blev Folin-Ciocalteu-reagenset erstattet med deioniseret vand. Absorbansen af ​​det dannede farvede produkt blev målt ved 725 nm under anvendelse af en Synergy HT Multi-detection mikropladelæser (Biotek, Bad Friedrichshall, Tyskland) betjent via GEN51M software. Standardkurver for TPC-kvantificering blev opnået under anvendelse af syv koncentrationer af gallussyre (GA) (0,025 til 0,5 mg/ml), fremstillet i det samme opløsningsmiddel som ekstrakterne, der skal testes (y=2.097x＋0,01560 R²{{ 22}}.9989,for acetone,og y=2.204x＋0.01401,R2=0.9982,for vand,hvor"y"refererer til absorbansen og"x"refererer til koncentrationen) . Tre uafhængige bestemmelser blev udført i to eksemplarer. Totalt phenolindhold blev udtrykt som ug GA-ækvivalenter (GAE) pr. mg tørekstrakt.

3.4.2.Proteiner i alt

Den totale proteinkoncentration blev bestemt ved hjælp af BCA-proteinassay-kittet (#23227, Thermo-Scientific). Vandige ekstrakter blev fremstillet i vand, mens acetoneekstrakter blev fremstillet i DMSO. Kort fortalt i en 96-brøndplade, 25 µl af hver ekstrakt (1 mg/ml) blev blandet med 200 µl af arbejdsreagenset. Absorbansen blev målt ved 562 nm ved hjælp af en Synergy HT Multi-detection mikropladelæser (Biotek, Bad Friedrichshall, Tyskland) betjent via GEN5IM software. En standardkurve(y=-126.87x3＋547.73.353 -10.017; R2=0.999,og y=162.87x3-248.51x²＋932.13x -11.715;R2=0.99,hvor "y" refererer til absorbansen og "x" refererer til koncentrationen) blev opnået for hvert ekstrakt under anvendelse af ni koncentrationer af albumin (BSA)(25 til 2000 ug/mL) for at kvantificere proteinerne. Tre uafhængige eksperimenter blev udført i tre eksemplarer. Det totale proteinindhold blev udtrykt som ug bovint serumalbumin (BSA)-ækvivalenter pr. mg tørekstrakt.

3.4.3.Pigmenter

Pigmenterne til stede i både vandige og acetoneekstrakter blev kvantificeret spektrofotometrisk. Klorofyl a og dets derivater blev kvantificeret ved hjælp af en kalibreringskurve opnået med den kommercielle standard (Sigma-Aldrich): y=8.0791x-0.0{{19} }22 (R2=0.996), hvor "y" refererer til absorbansen og "x" refererer til koncentrationen. Det samlede antal carotenoider blev kvantificeret som -caroten (Sigma-Aldrich) gennem dets kalibreringskurve （y=17.133x＋0.0099; R²=0.990, hvor "y" refererer til absorbansen og "x" refererer til koncentrationen). Total carotenoidkoncentration blev udtrykt som ug -caroten pr. mg tørekstrakt. Kalibreringskurver for begge standarder blev opnået ved brug af fem forskellige koncentrationer (0,001 til 0,025 mg/ml). en Synergy HT Multi-detection mikropladelæser (Biotek, Bad Friedrichshall, Tyskland) betjent via GEN5TM software.

PBP-indhold blev bestemt spektrofotometrisk ved at måle absorbanserne af de vandige ekstrakter ved forskellige bølgelængder (562, 615 og 645 nm) og anvende de tilsvarende formler, som tidligere beskrevet af Pagels et al. [34]: Vandige ekstrakter blev resuspenderet til en slutkoncentration på 0,5 mg/ml. Eksperimentet blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne blev udtrykt i ug/mg tørekstrakt. 3.5.Biologiske aktiviteter

3.5.1. Superoxidanionradikal (O2*-) fjernelse

Den frie radikalopfangende analyse af Oz*- blev udført for at evaluere antioxidantpotentialet af cyanobakterieekstrakterne, ifølge Barbosa og kolleger [55], med mindre modifikationer. De vandige ekstrakter blev fremstillet i vand, mens acetoneekstrakter blev fremstillet i DMSO. Fem serielle fortyndinger blev fremstillet for hvert ekstrakt og testet for at evaluere ekstrakternes adfærd og IC-værdier. Alle reagenser blev opløst i fosfatbuffer (19 uM, pH 7,4). Et volumen på 50 μL af hver fortynding blev blandet med 50 µl 166 uM -nicotinamid-adenindinukleotid-reduceret form (NADH) opløsning og 150 µl 43 uM nitrotetrazoliumblåt chlorid (NBT) i en 96-brøndsplade. Efter tilsætning af 50 μL 2,7 μM phenazinmethosulfat (PMS) blev prøvernes radikalopfangende aktivitet overvåget med en Synergy HT Multi-detection mikropladelæser (Biotek, Bad Friedrichshall, Tyskland) betjent via GEN51M software, i kinetisk funktion. ved stuetemperatur i 2 minutter ved 562 nm. Tre uafhængige assays blev udført i tre eksemplarer. GA blev brugt som en positiv kontrol. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​radikalopfangning i sammenligning med den ubehandlede kontrol. Resultaterne for de beregnede IC-værdier blev udtrykt som middelværdien ± SD (ug/ml) af mindst tre uafhængige assays udført i duplikat. IC-værdierne og tilsvarende dosis-responskurver blev beregnet med Graphpad Prism@-software (San Diego, CA, USA; version 9, til MacOS).

3.5.2.Hyaluronidasehæmning

Hyaluronidaseinhiberingsassayet blev en smule modificeret i forhold til det foreslåede af Ferreres et al.【56】. Kort fortalt, 25 μL af hvert ekstrakt (9mg/mL), 175 μL hyaluronsyre (HA) (0,7 mg/mL), og 25 μL hyaluronidase (HAase) ({{9{{8}) 14}} U/ml i NaCl0,9 procent ）blev blandet i et reaktionsrør. Vandige ekstrakter blev fremstillet i vand, og acetoneekstrakter blev fremstillet i DMSO. Efter 30 minutters inkubation ved 37 grader blev reaktionen standset ved tilsætning af 25 μL dinatriumtetraborat (0,8 M i vand), efterfulgt af inkubation i 3 minutter ved 90 grader i et vandbad. Reaktionsrørene blev afkølet til stuetemperatur, før 375 uL DMAB[4-(dimethylamino)benzaldehyd]-opløsning blev tilsat. Efter 20 minutters inkubation ved 37 grader blev absorbansen af ​​det dannede farvede produkt målt ved 560 nm i en Synergy, HT Multi-detection mikropladelæser (Biotek, Bad Friedrichshall, Tyskland) betjent via GEN5IM software. Den negative kontrol blev udført i fravær af ekstrakt. Dinatriumkromoglycat (DSCG) blev anvendt som en positiv kontrol.

Tre uafhængige assays blev udført i tre eksemplarer, og resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​enzyminhibering i sammenligning med den ubehandlede kontrol.

3.5.3. Elastaseinhibering

Porcin pancreatisk elastasehæmningsassay blev udført ifølge Mota og kolleger[57] med små modifikationer. Vandige ekstrakter blev fremstillet i vand, mens acetoneekstrakter blev fremstillet i DMSO. Kort fortalt, i en 96-brøndsplade, blev 50 μL af ekstraktet blandet med 90 uL HEPES-buffer (0,1 M), 10 µL N-succinyl-Ala-Ala-Ala p-nitroanilidsubstrat (100 uM), 70 µL acetatbuffer (200 mM) og 30 µL elastase (1 U/mL) Pladen blev inkuberet ved 37 grader 10 minutter, og absorbansen af ​​reaktionsproduktet blev målt ved 405 nm i en Synergy HT Multi-detection mikropladelæser (Biotek, Bad Friedrichshall, Tyskland) betjent via GEN51M. Den negative kontrol blev udført i fravær af ekstrakt, og ascorbinsyre blev anvendt som en positiv kontrol.cistanche pulverTre uafhængige assays blev udført i tre eksemplarer. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​enzyminhibering i sammenligning med den ubehandlede kontrol.

3.5.4.Tyrosinasehæmning

Tyrosinaseinhiberingsassayet blev udført ifølge Adhikari et al.[58] med små modifikationer. Kort fortalt, i en 96-brøndsplade blev 20 μL af hver ekstrakt blandet med 100 μL tyrosinase (30 U/mL i fosfatbuffer). Vandige ekstrakter blev fremstillet i vand, mens acetoneekstrakter blev fremstillet i DMSO. Blandingen blev inkuberet ved 30 grader i 8 min. Derefter blev 80 μL L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanin) opløsning (2,5 mM i phosphatbuffer) tilsat, og absorptionen (T0, absorbans på et tidspunkt "nul") blev øjeblikkeligt målt med en Synergy HT Multi-detection mikropladelæser (Biotek, Bad Friedrichshall, Tyskland) betjent via GEN5TM software ved 475 nm. Bestemmelsen af ​​absorbansen ved TO (før reaktionsproduktet blev dannet) tillod eliminering af mulige interferenser på grund af den naturlige farve af ekstrakterne under undersøgelse. Efter 8 minutters inkubation ved 30 grader blev absorbansen målt igen (T8). Procentdelen af ​​tyrosinaseinhibering i nærværelse af cyanobakterieekstrakter blev beregnet i sammenligning med den ubehandlede (negative) kontrol, hvor forskellen mellem absorbanserne (T{ {21}}T0) svarer til 100 procent af enzymaktiviteten. Den negative kontrol blev udført i fravær af ekstrakt, og kojinsyre blev anvendt som en positiv kontrol. Tre uafhængige assays blev udført i tre eksemplarer. Resultaterne blev udtrykt som procentdelen af ​​enzyminhibering i sammenligning med den ubehandlede kontrol.

3.5.5.Solbeskyttelsesfaktor (SPF)

In vitro solbeskyttende faktor blev bestemt ifølge Rohr og kolleger[59] med små modifikationer. Vandige ekstrakter blev fremstillet i vand, mens acetoneekstrakter blev fremstillet i acetone. Kort fortalt blev absorbansen af ​​2 ml af hver ekstrakt (20 og 1000 ug/ml) målt i et spektrofotometer (fra 290 til 320 nm, 5 i 5 nm). SPF blev beregnet ved hjælp af formlen foreslået af Mansur [60]: hvor EE（A） er det erytemiske effektspektrum, I（A） er solintensitetsspektret, Abs（λ） er absorbansen af ​​ekstrakt, og CF er korrektionen faktor (28) bestemt ved hjælp af en kommerciel solcreme med en kendt SFP-værdi på 30.

3.6.Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af IBM SPSS statistiksoftware (version 23.0 til macOS, IBM Corporation, New York, NY, USA, 2015). Data blev analyseret for normalitet og variansens homogenitet af Kolmogorov-Smirnov og Leven's test, derefter underkastet en envejs ANOVA ved hjælp af en Tukey's HSD (helt ærligt signifikant forskel) som en post-doc test, eller til en uparret t-test. En Pearson-korrelationstest blev brugt til at sammenligne de normaliserede ekspressionsdata mellem de kemiske profiler og biologiske aktiviteter af cyanobakterieekstrakter.

3.7.Principal Component Analysis (PCA)

PCA blev brugt til at transformere en række potentielt korrelerede variabler til en række relativt uafhængige variabler, der kunne rangeres baseret på deres bidrag til at forklare variationen af ​​hele datasættet[61]. De relativt vigtige komponenter i højdimensionelle mønstre kan med succes identificeres. De originale højdimensionelle data kan kortlægges på et lavere dimensionelt rum, og derfor er kompleksiteten af ​​et højdimensionelt mønsterklassificeringsproblem stærkt reduceret [62]. Til denne undersøgelse blev mønstergenkendelse baseret på PCA udført ved hjælp af IBM SPSS statistiksoftware (version 23.0 til macOS, IBM Corporation, New York, NY, USA, 2015). Datamatricen bestod af metabolitterne i de vandige og acetoneekstrakter af de fire cyanobakteriestammer og deres aktivitet ved den højeste testede koncentration.

4 konklusioner

Den biologiske aktivitet udvist af cyanobakterieekstrakterne analyseret heri viste sig at være klart korreleret. Ifølge tilstedeværelsen af ​​bioaktive PBP'er var de vandige ekstrakter de mest effektive til UV-beskyttelse, hvilket sammen med deres radikalfjernende kapacitet antyder dem som lovende ingredienser til brug i anti-aldringsformuleringer med det formål at forhindre hudældning forværret af eksterne faktorer. På den anden side viste acetoneekstrakterne sig mere effektive til at hæmme aktiviteten af ​​enzymer, der er ansvarlige for nedbrydningen af ​​den dermale matrix og tab af hudstruktur, og er således mere velegnet til aldersrelateret hudældning.cistanche salsa ekstraktDet sekventielle ekstraktionsskema, vi foreslår, kan vise sig at være fordelagtigt, hvilket muliggør opnåelse af kemisk forskellige bioaktive ekstrakter gennem monetarisering af cyanobakteriebiomasse, hvilket gør processen mere bæredygtig og økonomisk attraktiv. Alt i alt viste cyanobakterieekstrakter sig værdige til yderligere udnyttelse inden for hudens aldring, målrettet søgen efter naturlige, sikre og bæredygtige ingredienser til kosmetiske formuleringer.

Denne artikel er uddraget fra Mar. Drugs 2022, 20, 183. https://doi.org/10.3390/md20030183 https://www.mdpi.com/journal/marinedrugs