Sammensætningsanalyse og immunologiske aktiviteter af oligosaccharider isoleret fra Cistanche Deserticola

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Abstrakt.Et oligosaccharid (CDOS) blev opnået fraCistanche deserticolaved alkali (pH{{0}}) ekstraktion, ethanoludfældning og fraktioneret i to oprensede fraktioner (dvs. CDOS-1 og CDOS-2) af Sephadex G-100 og Sephadex G-25 kolonnefiltreringskromatografi. Monosaccharidsammensætningen af ​​CDOS blev analyseret ved højtydende væskekromatografi (HPLC). Det blev fundet, at CDOS-1 kun var sammensat af saccharose, og CDOS-2 hovedsageligt var sammensat af saccharose, rhamnose og mannitol med et molforhold på 1:0,73:3,61. Immunologiske test indikerede, at CDOS udviste en signifikant effekt på musemiltindekset, hvilket øgede makrofagernes fagocytoseaktivitet og stimulerede antistofproducerende celleproliferation. Det er håbet, at CDOS vil blive udviklet til funktionel mad eller medicin.

Nøgleord:Cistanchedeserticola, oligosaccharid, oprensning, sammensætning, immunologiske aktiviteter.

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

1. Introduktion

Cistanchedeserticola YCMa. (Familie Orobanchaceae) er en kort parasitplante, der er hjemmehørende i det nordvestlige Kina. Hele den tørrede plante (uden blomster) er kendt som en tonic og kaldes "Rou Congrong". I orientalsk medicin er den klassificeret som sød og salt i smagen, varm i naturen og tilskrives nyre- og tyktarmskanaler, med funktion afopkvikkendedetnyreog supplerer essens, fugter tarmen og afslapper tarmene [1]-[3]. Den moderne farmakologiske undersøgelse viste, at den kunne sætte gang i DNA-syntesen og forsinke senilitetsprocessen, øge antioxidativet [4], forebygge og behandle hjerte-kar-sygdomme [3]. Derudover kan det også forårsage smertestillende oganti-inflammatoriskeffekter [5], forbedrer indlæring og hukommelse ved at inducere nervevækstfaktorer [6]. Nogle undersøgelser indikerede, at C. deserticola-ekstrakter kunne aktivere den fagocytiske funktion af intra-abdominal makrofag i mus [7]-[9] ogforbedrelegeme's immunitet[10]. Ifølge de tidligere undersøgelser indeholder denne plante flere aktive bestanddele, som omfatter phenylethanoid glycosider, iridoider, lignaner, saccharider, alkaloid osv. [11] Som C.deserticolaphenylethanoidglykosiderog polysaccharider er anerkendt som de vigtigste aktive komponenter, talrige undersøgelser har fokuseret på deres strukturer og bioaktiviteter i løbet af de sidste årtier [12]-[17]. Hvad angår de værdifulde oligosaccharider iC. deserticola, rapporterne er ret begrænsede. Oligosaccharider, et kortkædet saccharid, der indeholder homo- eller heterosukker, er velkendte for deres gavnlige virkninger på menneskers liv og har været udstrakt brugt i lang tid [18]. Funktionelle oligosaccharider, som har en fysiologisk funktion såsom lav cariogenicitet og bifidobakterier vækstfaktor [19], forbedrer menneskers og dyrs sundhed. De er blevet brugt som fødevareingrediens. For nylig er der rapporteret om nye funktioner af oligosaccharider, som har evnen til at modulere immunsystemet hos mennesker, dyr og fisk [20]. I dette papir rapporterer vi den første del af resultaterne af forskningsprogrammet, fraktioneringen af de samlede oligosaccharider opnået fra alkaliekstrakten af ​​C. deserticola ved en kombination af ultrafiltrering og gelpermeationskromatografi, og sammensætningsanalysen af ​​dem ved højtydende væskekromatografi (HPLC). Derudover præsenterer vi også de immunologiske aktiviteter af C. deserticola oligosacchariderne. Så vidt vi ved, er der kun offentliggjort få rapporter om undersøgelser af immunstimulerende aktivitetC. deserticolaoligosaccharider.

2. Eksperimentel

2.1. Materialer

C. deserticola blev dyrket og indsamlet fra Alxa League (Indre Mongoliet, Kina). Kunming-mus (Grade II, seks uger gamle) blev købt fra Pharmacology Experimental Center of Inner Mongolia University. Sephadex G-100,Sephadex G-25, trifluoreddikesyre (TFA), 1-phenyl-3-methyl-5- pyrazolon(PMP), D-glucose, D- galactose, D-fructose, D-xylose, D-mannose, D-galacturonsyre, D-glucuronsyre, saccharose, rhamnose, mannitol, fucose, rhamnose, blev købt fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Medium RPMI-1640 blev købt fra Gibco Invitrogen Co. (San Diego, CA, USA). Alle andre kemikalier var af analytisk kvalitet.

2.2. Ekstraktion af oligosaccharider

De tørrede kroppe af C. deserticola blev skåret i mindre stykker og yderligere formalet til pulver med en mølle blev ekstraheret med vandfri ethanol (3 x 5000 ml) ved 70 grader i 3 timer under atmosfærisk tryk. En tilbagesvaler blev fikseret for at fjerne lipider. Resten blev derefter ekstraheret med alkali (pH=10) ved 60 grader i 3 gange (2 timer hver gang). Efter centrifugering (2000 g i 15 minutter ved 20 grader) blev supernatanten koncentreret til en tiendedel af volumenet i en rotationsfordamper under reduceret tryk ved 50 grader og filtreret. Derefter blev filtratet deproteiniseret under anvendelse af Sevag-reagenset [21] og affarvet med aktivt kul.

2.3. Isolering og oprensning af oligosaccharider

De frysetørrede rå oligosaccharider blev opløst i destilleret vand, centrifugeret, og derefter blev supernatanten oprenset med en Sephadex G-100-søjle (1 x 50 cm), ækvilibreret med ultrarent vand. Efter påfyldning med prøven blev søjlen elueret med ultrarent vand ved en strømningshastighed på 5 ml/min. Forskellige fraktioner blev opsamlet under anvendelse af reagensglas. Det totale kulhydratindhold i hvert rør blev målt ved 490 nm ved phenol-H2SO4-metoden [22]. Den vand-eluerede opløsning blev adskilt i to fraktioner CDOS-1 og CDO'er-2. To fraktioner blev henholdsvis oprenset yderligere på en Sephadex G-25-søjle (2,7 x 85 cm) ved anvendelse af ultrarent vand (ved en strømningshastighed på 1 ml/min). Efter opsamling af den rensede fraktion blev den lyofiliseret.

2.4. Analyse af monosaccharidsammensætning

Monosaccharidsammensætningen af ​​CDO'erne blev opnået ved HPLC-analyse. CDO'erne (2 mg) blev først hydrolyseret med vandfri methanol indeholdende 2 M HCl ved 8 0 grader i 16 timer under en nitrogenatmosfære og derefter med 2 M TFA ved 120 grader i 1 time. Efter at TFA var fjernet ved fordampning, blev hydrolysaterne efterfølgende derivatiseret med PMP ifølge den rapporterede metode [23] og analyseret ved HPLC. HPLC-separation blev udført på EF-2002 HPLC-systemet (KNAUER-virksomhed, Tyskland). PMP-derivaterne blev kromatograferet under anvendelse af Sugar-PAK volumen (6,5 x 300 mm, glas vandfirma, Amerika), og absorbansen blev målt ved 245 nm. Injektionsvolumenet var 20 µL, og den mobile fase, sammensat af PBS (opløsningsmiddel A) og acetonitril (opløsningsmiddel B), blev anvendt til isokratisk eluering i volumenforholdet på 82 procent (A) til 18 procent (B). Den samlede HPLC-kørselstid var 40 minutter, og strømningshastigheden var 0,5 ml/min.

2.5. Immunbiologiske aktiviteter

2.5.1. Fagocytisk funktion af monocyt-makrofager

Tres Kunming-mus (Grade II, seks uger gamle) blev købt fra Pharmacology Experimental Center ved Inner Mongolia University og blev akklimatiseret i 1 uge før brug. Alle mus blev tilfældigt opdelt i fire grupper, bestående af en saltvandskontrolgruppe, høj CDO dosis gruppe, moderat dosis gruppe og lav CDO dosis gruppe. Musene blev injiceret intraperitonealt med 0,5 ml oligosaccharidopløsning én gang dagligt i 5 dage. Den høje, moderate eller lave CDO-dosisgruppe modtog henholdsvis 10{{10}}, 50 eller 25 mg/kg/BW CDO'er; og 0,5 ml saltvand blev injiceret i kontrolgruppen. På den syvende dag blev der udført et carbonpartikel-clearance-eksperiment ifølge Hou [24], og miltindekset og thymusindekset blev målt. Kort fortalt blev 0,05 mL/10 g/bw India blæk injiceret i hver mus gennem vena caudalis, hvorefter 20μL blod blev opnået fra vena orbitalis posterior 3 og 7 minutter efter injektionen. Blodprøverne blev anbragt i rør med 2 ml 0,1 procent Na2CO3, og OD-værdier blev målt ved 600 nm. Clearanceindekset (K), fagocytisk indeks ( ) og immunorganindekset blev beregnet som følger(1), t2 og t1 betyder henholdsvis 7 minutter og 3 minutter.

2.5.2. Den antistofproducerende celleproliferation

Grupper af Kunming-mus (fem pr. gruppe) blev immuniseret ved intraperitoneal injektion af 2 x 1 07 SRBC i 1,0 ml PBS tilsat 50 ug testmateriale (ingen i kontrollen). En uge senere blev splenocytter (106 celler pr. 2 ml pr. brønd) fra Kunming-mus dyrket med eller uden testmaterialer i 72 timer i 10% RPMI 1640-medium under 5% CO2 i luften, i tre eksemplarer for hver kultur. Antallet af PFC mod SRBC pr. 106 splenocytter blev bestemt [25], [26].

2.6. Statistisk analyse

Dataene blev udtrykt som middelværdier ±SD. Forskellen mellem testede grupper og kontrol blev analyseret ved Students t-test. P < 0.05="" blev="" anset="" for="" at="" være="">

3. Resultater og diskussioner

3.1. Isolering og oprensning af oligosaccharider

CDO'er blev isoleret fra alkaliekstrakten af ​​de tørrede legemer af C. deserticola med et udbytte på 3,07 procent. To fraktioner af CDOS-1 og CDOS-2 blev isoleret fra destilleret vand elueret af henholdsvis Sephadex G-100 kolonnen (fig. 1). De oprensede fraktioner af CDOS-1 og CDOS-2 viste en enkelt top på Sephadex G-25-søjlen, hvilket indikerer, at der ikke var andre oligosaccharider til stede i prøven. Resultaterne af monosaccharidsammensætninger viste, at CDOS-1 kun var sammensat af saccharose (fig. 2) og CDOS-2 hovedsageligt var sammensat af saccharose, rhamnose og mannitol (fig. 3) med et molforhold på 1:0,73:3,61.

3.2. Immunbiologiske aktiviteter af CDO'er

Meget in vivo og in vitro bevis har vist, at naturlige oligosaccharider udviste immunmodulerende funktion ved at stimulere både cellulære og humoraleimmun svar[27], [28]. I dette papir øgede 100 mg/kg/BW CDO'er musemiltindekset, men der var ingen signifikante forskelle i thymusindekset mellem de behandlede grupper og kontrolgrupperne (tabel 1). Makrofager er en vigtig komponent i værtens forsvar mod virusinfektion ved at hæmme intracellulær replikation af vira og ved at dræbe virusinficerede celler [29]. Når de aktiveres, frigives en række ilt- eller nitrogenmellemprodukter og cytokiner fra makrofager og deltager i forskellige vigtige biologiske funktioner, såsom antiinflammatoriske og anti-tumoraktiviteter [30]-[32]. Derfor er den fagocytiske aktivitet af makrofager en vigtig indikator for organismens immunfunktioner. I denne undersøgelse øgede de moderate og høje doser af CDO'er makrofagernes fagocytoseaktivitet (tabel 1). Antistofproducerende celleproliferation induceret af CDO'er blev undersøgt ved undersøgelse af stigningen i hæmolytisk PFC i milten af ​​Kunming-mus, som blev immuniseret med SRBC plus testprøven. Resultater indikerede, at moderate og høje doser af CDO'er signifikant forbedrer antistofproducerende celleproliferation (tabel 2). Høje doser af CDO'er forårsagede en meget signifikant stigning i PFC-tal (P <>

Referencer

[1] J. Li, Y. Jiang, R. Fan. Genkendelse af biologisk signal blandet baseret på wavelet-analyse. I: Y. Jiang, et al. (red.). Proc. af UK-China Sports Engineering Workshop. Liverpool: World Academic Union. 2007, s. 1-8.

[2] J. Ouyang, XD Wang, B. Zhao, et al. Virkninger af sjældne jordarters elementer på væksten af ​​Cistanche deserticola-celler og produktionen af ​​phenylethanoidglycosider. JB io-technol, 2003, 102 (2): 129-134

[3] Xu Zhaohui, Yang Junshan, Lu Ruimian, et al. Et nyt naturprodukt fra Cistanche deserticola YCMA. Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences, 1999, 8(2):61-63.

[4] X. Wang, L. Li, Muhuyati, X. Wanag, N. Du. Antioxidativ virkning af glycosiderne af Cistanche i muses væv. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1998, 23(9):554-5.

[5] Lin LW, Hsieh MT, Tsai FH, Wang WH, Wu CRAnti-nociceptiv og antiinflammatorisk aktivitet forårsaget af Cistanche deserticola hos gnavere. J Ethnopharmacol. 2002, 83(3):177-82.

[6] Choi, JG; Måne, M; Jeong, HU; Kim, MC; Kim, SY; Åh, MS Cistanches Herba forbedrer indlæring og hukommelse ved at inducere nervevækstfaktor. Adfærdsmæssig hjerneforskning. 2011, 216 (2): 652–8.

[7] Zong G, He W, Wu G, Chen M, Shen X, Shi M. Sammenligning mellem Cistanche deserticola YC Ma og C, tubulosa (Shenk) Wight på nogle farmakologiske handlinger.Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 1996, 21(7):436-7.

[8] He W, Shu XF, Zeng GZ, et al. Undersøgelse af øget sexstyrke af C. deserticola. J Chin Med.1996, 21(9): 534- 537.

[9] Zeng GZ, He W, Wu GL, et al. Sammenligninger mellem Cistanche deserticola YC Ma og C.tubulosa vægt på nogle farmakologiske virkninger. J Chin Med. 1996, 21(7): 436-438.

[10] Zeng QL, Zheng YF, Lu ZL Immunmodulerende virkninger af polysaccharid af Cistanche deserticola YC Ma. J Zhejiang Univ, Med Sci. 2002, 31(4): 284- 287.

[11] Li Yuan, Sang Yuanyuan, Zhang Hongquan. Fremskridt inden for forskning af kemiske bestanddele og medicinsk aktivitet af Cistanche. Chinese Wild Plant Resources, 2010, 29(1):7-11.

[12] Du NS, Wang H, Yi YH. Isolering og identifikation af phenylethanoid glycosider fra Cistanche deserticola. Nat Prod R & D, 1993, 5(4): 5- 8.

[13] Lu NS, Liu JL Bestemmelse af phenylethanoidglycosider i Cistanche deserticola ved makroretikulær resinspektrofotometri. Nat Prod R & D, 1993, 5(3): 30-33.

[14] Xiong QB, Tezuka Y, Kaneko T, et al. Hæmning af nitrogenoxid af phenylethanoider i aktiverede makrofager.

European Journal of Pharmacology, 2000, 400: 137- 144.

[15] Zhao Wei, Yan Hong, Liang Zhong-Yan, et al. Strukturel analyse af vandopløseligt polysaccharid SPA isoleret fra stammen af ​​Cistanche Deserticola Ma. Chemical Journal of Chinese Universities, 2005, 26(3):461-463.

[16] Wang Xiangyan. Undersøgelse af immunfarmakologien og absorptionskarakteren af ​​polysaccharider af Cistanche deserticola. 2011, No.S1, Medicine and Health Sciences, E057-235-1-70.

[17] Xiong Q, Hase K, Tezuka Y, Tani T, Namba T, Kadota S. Hepatoprotektiv aktivitet af phenylethanoider fra Cistanche deserticola. Planta Med. 1998, 64(2):120-5.

[18] Handbook of Amylases and Related Enzymes (red. af The Amylase Research Society of Japan), Pergamon Press (1988)

[19] Araya, S. (red.) Proceedings of the 5th Conference on Dental Caries and Coupling Sugar (på japansk), National Institute of Health, Tokyo (1980)

[20] Kodo Otaka. Funktionelt oligosaccharid og dets nye aspekt som immunmodulering. J. Biol. Macromol. 2006, 6(1), 3-9.

[21] Navarini L, Gilli R, Gombac V, Abatangelo A, Bosco M, Toffanin R. Polysaccharider fra varmtvandsekstrakter af ristede Coffea arabica bønner: Isolering og karakterisering. Kulhydrat. Polym.1999, 40:71-81.

[22] Dubois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. Kolorimetrisk metode til bestemmelse af sukkerarter og beslægtede stoffer. Anal. Chem. 1956, 28:350-356.

[23] Yang X, Zhao Y, Wang Q, Wang H, Mei Q. Analyse af monosaccharidkomponenterne i Angelica polysaccharider ved højtydende væskekromatografi. Anal Sci. 2005, 21:1177-1180.

[24] Yufang Hou, Yubao Hou, Liu Yanyan, et al. Ekstraktion og oprensning af et lektin fra rød nyrebønne og indledende immunfunktionsundersøgelser af lektin og fire kinesiske urtepolysaccharider. Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2010:1-9.

[25] Cunningham, AJ og A. Szenberg. Yderligere forbedringer i plakteknikken til påvisning af enkelte antistofdannende celler. Immunology.1968, 14:599-600.

[26] Haruhiko Takada, Tomohiko Ogawa, Fuminobu Yoshimura, et al. Immunbiologiske aktiviteter af en porinfraktion isoleret fra Fusobacterium nucleatum ATCC 10953 [J]. Infektion og immunitet. 1988, 56(4): 855-863.

[27] Wang MQ, Guilbert LJ, Ling L, Li J, Wu YQ, Xu SR, Pang P, Shan JJ Immunmodulerende aktivitet af CVT-E002: et proprietært ekstrakt fra nordamerikansk ginseng (Panax quinque folium). J Pharm Pharmacol.2001, 53:1515-1523.

[28] Nergard CS, Kiyohara H, Reynolds JC, Thomas-Oates JE, Matsumoto T, Yamada H, Patel T, Petersen D, Michaelsen TE, Diallo D, Paulsen BS Strukturer og struktur-aktivitetsforhold af tre mitogene og komplementfikserende pektiske arabinogalaktaner fra de maliske antiulcusplanter Cochlospermum tinctorium A. Rich og Vernonia kotschyana Sch Bip. ex Walp. Biomakromolekyler. 2006, 7:71-79.

[29] E.-M. Choi, A.-J. Kim, Y.-O. Kim og J.-K. Hwang, Immunmodulerende aktivitet af Arabinogalactan og Fucoidan in vitro. Journal of Medicinal Food. 2005, 8(4):446-453.

[30] Y. Chen, J.-A. Duan, D. Qian, et al. Vurdering og sammenligning af den immunregulerende aktivitet af fire vandopløselige fraktioner af Angelica Sinensis in vitro på de peritoneale makrofager i ICR-mus. International immunfarmakologi. 2010, 10:422-430.

[31] YS Lee, OK Han, CW Park, et al. Pro-inflammatorisk cytokin-genekspression og nitrogenoxidregulering af vandigt ekstraheret Astragali radix i RAW 264.7 makrofagceller. Journal of Ethnopharmacology. 2005, 100(3): 289-294.

[32] KY Lee og YJ Jeon. Polysaccharid isoleret fra Poria cocos sclerotium inducerer NF-KB/Rel-aktivering og iNOS-ekspression i murine makrofager. International immunfarmakologi. 2003, 3(10-11):1353-1362.