Sammenligning mellem QPCR og RNA-seq afslører udfordringer ved at kvantificere HLA-ekspression, del 1

Abstrakt

Humant leukocytantigen (HLA) klasse I og II loci er væsentlige elementer i medfødt og erhvervet immunitet. Deres funktioner omfatter antigenpræsentation til T-celler, der fører til cellulære og humorale immunresponser og modulering af NK-celler. Deres enestående indflydelse på sygdomsudfald er nu blevet tydeliggjort af genom-dækkende associationsundersøgelser. Exonerne, der koder for den peptidbindende rille, har været hovedfokus for bestemmelse af HLA-effekter på sygdomsmodtagelighed/patogenese. Imidlertid er HLA-ekspressionsniveauer også blevet impliceret i sygdomsudfald, hvilket tilføjer en anden dimension til den ekstreme mangfoldighed af HLA, der påvirker variabiliteten i immunresponser på tværs af individer.

Der er en tæt sammenhæng mellem leukocytantigener og immunitet. Leukocytantigen refererer til molekylet på overfladen af ​​humane hvide blodlegemer, som kan identificere og skelne forskellige celletyper og patogener. Det er en vigtig del af det menneskelige immunsystem og en vigtig regulator af immunrespons.

Forskelle i leukocytantigener kan resultere i forskellige immunresponser og sygdomsmodtagelighed. For eksempel er visse leukocytantigener forbundet med autoimmune sygdomme, infektionssygdomme og tumorer. Ekspressionen af ​​visse leukocytantigener er også relateret til funktionen og mængden af ​​immunceller.

Derfor er forståelsen af ​​de molekylære karakteristika af et individs leukocytoverflade af stor betydning for vurderingen af ​​individets immunstatus og risikoen og prognosen for sygdommen. Samtidig er det også befordrende for formuleringen af ​​personlig behandling og forebyggende foranstaltninger. Fra dette synspunkt er vi nødt til at forbedre immuniteten. Cistanche har en betydelig effekt på at forbedre immuniteten. Cistanche er rig på forskellige antioxidantstoffer, såsom C-vitamin og carotenoider. Disse ingredienser kan fjerne frie radikaler, reducere oxidativt stress og forbedre immunsystemets modstandsdygtighed.

Klik cistanche tubulosa ekstrakt pulver

For at estimere HLA-ekspression er immunogenetiske undersøgelser traditionelt afhængige af kvantitativ PCR (qPCR). Indførelsen af ​​alternative high-throughput-teknologier såsom RNA-seq er blevet hæmmet af tekniske problemer på grund af den ekstreme polymorfi ved HLA-gener. For nylig er der imidlertid udviklet flere bioinformatiske metoder til nøjagtigt at estimere HLA-ekspression fra RNA-seq-data. Dette åbner en spændende mulighed for at kvantificere HLA-ekspression i store datasæt, men stiller også spørgsmål om, hvorvidt RNA-seq-resultater er sammenlignelige med dem ved qPCR. I denne undersøgelse analyserer vi tre klasser af ekspressionsdata for HLA klasse I gener for et matchet sæt af individer: (a) RNA-seq, (b) qPCR og (c) celleoverflade HLA-C ekspression. Vi observerede en moderat korrelation mellem ekspressionsestimater fra qPCR og RNA-seq for HLA-A, -B og -C ({{10}}.2 Mindre end eller lig med rho Mindre end eller lig med 0,53 ). Vi diskuterer tekniske og biologiske faktorer, som skal tages i betragtning, når man sammenligner kvantificeringer for forskellige molekylære fænotyper eller bruger forskellige teknikker.

Nøgleord

HLA · Ekspression · PCR · RNA-seq.

Introduktion

Genekspression giver en molekylær fænotype, der ligger i en mellemposition mellem genetisk variation og komplekse fænotyper, såsom sygdomsstatus. At forstå det genetiske grundlag for genekspression kan være strategisk til at skabe forbindelser mellem genetisk variation og komplekse fænotyper (GTEx Consortium 2013; Lappalainen et al. 2013), herunder modtagelighed for autoimmune og infektionssygdomme. Selvom undersøgelsen af ​​genetisk variation ved det humane leukocytantigen (HLA) loci, og inden for det store histokompatibilitetskompleks (MHC) regionen generelt, er blevet brugt til at dissekere det genetiske grundlag for flere komplekse sygdomme (Trowsdale og Knight 2013; Dendrou et al. . 2018), er inklusion af molekylære fænotyper, især dem, der er forbundet med genekspression, forholdsvis nyere (Apps et al. 2015; Vince et al. 2016; Ramsuran et al. 2018; Johansson et al. 2022).

Den humane MHC-region på kromosom 6p21 udviser en høj gentæthed med unikke mønstre af koblingsuligevægt (LD) og ekstrem polymorfi (de Bakker et al. 2006; Radwan et al. 2020). MHC-regionen indeholder HLA klasse I og II loci, der koder for molekyler involveret i at udløse og modulere immunresponset. HLA klasse I molekyler udtrykkes af de fleste nukleerede celler og præsenterer generelt intracellulære peptider til CD8 plus T-celler. I modsætning hertil udtrykkes HLA klasse II-molekyler primært af professionelle antigen-præsenterende celler og præsenterer for CD4 plus T-celler eksogene antigener, der blev internaliseret ved endocytose. Klasse I-molekyler genkendes også af receptorer på naturlige dræberceller (NK-celler), de dræbercelle-immunoglobulinlignende receptorer (KIR'er), hvilket påvirker både uddannelse og aktivering af NK-celler (Colonna og Samaridis 1995; Goodson-Gregg et al. 2020). Parringen af ​​forskellige HLA klasse I allotyper og specifikke KIR molekyler påvirker NK celle (og en undergruppe af CD8 plus T celle) aktivitet, hvilket resulterer i forskellige risici for cancer, infektionssygdomme og autoimmunitet (gennemgået i Kulkarni et al. 2008).

HLA-sygdomsassociationer er primært blevet tilskrevet allel-specifikke forskelle i antigenpræsentation på grund af de omfattende polymorfismer i den peptidbindende rille. Imidlertid bidrager HLA-ekspressionsniveauer til nogle af de observerede sammenhænge mellem HLA-polymorfismer og sygdomsudfald. HLA-ekspressionsniveau er en vigtig modifikator af autoimmunitet og styrken af ​​det HLA-medierede immunrespons på cancer og infektioner (gennemgået i René et al. 2016).

Der er flere eksempler på sammenhænge mellem HLA-ekspressionsniveauer og virusinfektionsresultater. Det er for eksempel veldokumenteret, at højere HLA-C-ekspressionsniveauer, både på mRNA-niveau og protein på celleoverfladen, er forbundet med bedre kontrol af HIV-1 (Thomas et al. 2009; Kulkarni et al. al. 2011; Apps et al. 2013; Parolini et al. 2018; Bachtel et al. 2018), hvorimod forhøjet HLA-A-ekspression forbindes med svækket HIV-kontrol (Ramsuran et al. 2018). SARS-CoV-2-infektion nedregulerer HLA-C-genekspression (Loi et al. 2022) og HLA klasse I-ekspression på celleoverfladen (Zhang et al. 2021; Arshad et al. 2023) såvel som HLA-klasse II-genekspression, herunder HLA-DPA1, -DPB1, -DRA og -DRB1 (Wilk et al. 2020).

Derudover er der sammenhænge mellem HLA-DPA1 (Ou et al. 2019) og HLA-DPB1 (Thomas et al. 2012; Ou et al. 2021) ekspressionsniveauer med HBV-clearance; HLA-DRA-ekspression med modtagelighed for infektion med flagermus Influenza A-vira i humane cellelinjer (Karakus et al. 2019); og omfattende associationer mellem regulatoriske varianter og ekspressionsniveauer ved HLA klasse II gener, herunder HLA-DQA1, -DQB1, -DQB2, -DRB1 og -DRB5, med antistofrespons mod multiple prævalente vira (Kachuri et al. 2020).

Ekspressionsniveauerne af HLA loci er også forbundet med autoimmunitet (se Johansson et al. 2022 for en gennemgang). HLA-C ekspressionsniveauer på celleoverfladen (Apps et al. 2013; Kulkarni et al. 2013), såvel som HLA-G niveauer på celleoverfladen og i plasma (da Costa Ferreira et al. 2021), er blevet associeret med risiko for inflammatorisk tarmsygdom. Øget HLA-B27-ekspression på celleoverfladen blev observeret blandt patienter med ankyloserende spondylitis (Cauli et al. 2002), og det samme var det overordnede HLA klasse I-ekspression blandt Graves' sygdomspatienter (Weider et al. 2021). HLA klasse II ekspressionsniveauer påvirker også risikoen for autoimmune tilstande.

HLA-DQA1- og -DRB1-genekspression og ekspression af DQ- og DR-molekyler på celleoverfladen øges i perifere blodmonocytter fra vitiligopatienter (Cavalli et al. 2016); regulatoriske varianter forbundet med højere HLA-DQA1, -DQB1 og -DRB1 genekspression og DQ og DR ekspression på celleoverfladen er forbundet med risiko for systemisk lupus erythematosus (Raj et al. 2016); HLA-DRB5 genekspression er højere hos sklerodermipatienter med interstitiel lungesygdom (Odani et al. 2012); specifikke HLA-DRB1 alleler er stærkt udtrykt i patienter med reumatoid arthritis (Houtman et al. 2021); og højere ekspression af DRB1*15:01 associerer med risiko for multipel sklerose (Alcina et al. 2012). Derfor vil forståelsen af ​​variationen af ​​HLA-ekspression blandt individer og mekanismerne, der regulerer HLA-ekspressionsniveauer, være nøglen til at afdække det genetiske grundlag for sygdomsfænotyper.

Traditionelt er HLA-ekspression blevet estimeret ved antistofbaserede teknikker til ekspressionsniveauer på celleoverfladen (Thomas et al. 2012; Apps et al. 2013) eller ved kvantitativ PCR (qPCR eller RT-PCR) for mRNA-transskriptionsniveauer (Bettens et al. al. 2014; Ramsuran et al. 2015, 2017). Det er udfordrende at sammenligne resultater på tværs af undersøgelser eller endda sammenligne forskellige HLA-loci inden for samme undersøgelse, da forskellige eksperimentelle procedurer bruges til hver analyse og for hvert HLA-locus, hvilket kan resultere i forskellige amplifikationseffektiviteter i qPCR eller antistofaffiniteter i flowcytometri.

High-throughput-teknologier såsom RNA-seq giver ekspressionsestimater for alle generne i genomet, inklusive HLA-gener, hvilket muliggør evaluering af HLA-ekspression i en genomomfattende kontekst. Imidlertid bringer disse teknologier mange udfordringer, når de bruges til at estimere ekspressionsniveauer af HLA-generne. Ud over veldokumenterede skævheder forbundet med RNA-seq-assays (f.eks. batch-effekter, biblioteksforberedelse, GC-indhold ('t Hoen et al. 2013), skyldes vanskeligheden ved at estimere ekspressionsniveauer for HLA-gener, at kvantificeringen involverer justering af korte læsninger til et referencegenom, som ikke giver en fuldstændig repræsentation af HLA-allel-diversiteten.

Derfor kan nogle læsninger muligvis ikke tilpasses på grund af et stort antal forskelle vedrørende referencegenomet (Brandt et al. 2015). Derudover er HLA-generne en del af en genfamilie dannet efter successive runder af duplikationer og indeholder ofte segmenter, der er meget ens mellem paraloger, hvilket resulterer i krydsjusteringer mellem gener og forudindtaget kvantificering af ekspressionsniveauer. Disse vanskeligheder motiverede udviklingen af ​​beregningsmæssige pipelines (se Johansson et al. 2022 for en gennemgang), som tegner sig for kendt HLA-diversitet i tilpasningstrinnet og har vist sig at give nøjagtige ekspressionsniveauer for HLA-gener (Boegel et al. 2012; Lee et al. al. 2018; Aguiar et al. 2019; Gutierrez-Arcelus et al. 2020; Darby et al. 2020).

Mens både RNA-seq og qPCR-tilgange estimerer HLA-ekspression ved at kvantificere mængden af ​​transkripter, involverer metoderne forskellige eksperimentelle og bioinformatiske behandlingsprocedurer. Så vidt vi ved, er der ikke udført en kvantitativ sammenligning af resultater fra RNA-seq med dem, der stammer fra qPCR for HLA-gener. I denne undersøgelse søgte vi at sammenligne forskellige teknikker og molekylære fænotyper til kvantificering af HLA klasse I-ekspression, idet vi huskede på, at ingen teknik kan betragtes som en guldstandard. For at reducere effekten af ​​teknisk og biologisk variation i sammenligningen af ​​forskellige undersøgelser udførte vi et RNA-seq-assay på et sæt af 96 individer, for hvilke qPCR-ekspressionsestimater var tilgængelige (for HLA-A, -B, -C) og for en undergruppe, hvoraf HLA-C-antistofbaseret celleoverfladeekspression også var tilgængelig. RNA-seq kvantificering blev udført med en HLA-skræddersyet pipeline, som muliggør nøjagtig ekspressionsvurdering, hvilket minimerer skævheden ved standardtilgange, der er afhængige af et enkelt referencegenom.

Materialer og metoder

Prøver

Blodprøver blev opnået fra 96 ​​raske bloddonorer, der var tilmeldt det frivillige donorprogram ved Frederick National Laboratory for Cancer Research (FNLCR). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle forsøgspersoner, og prøver blev anonymiseret ved IRB-godkendte procedurer fra National Cancer Institute. RNA blev ekstraheret fra frisk isolerede perifere mononukleære blodceller (PBMC) ved hjælp af RNeasy Universal kit (Qiagen). RNA blev behandlet med RNAse-fri DNAse til fjernelse af genomisk DNA. Totalt RNA ekstraheret fra PBMC'er blev kvantificeret under anvendelse af HT RNA Lab Chip (Caliper, Life Sciences). Alle prøver, der viste en RNA-kvalitetsscore større end 8, blev brugt i genekspressionsanalyserne.

HLA-tastning

HLA-alleler blev bestemt ved Sanger-sekventering. Derudover kørte vi HLApers (Aguiar et al. 2019) og Kourami (Lee og Kingsford 2018) for at udlede HLA-alleler direkte fra RNAseq og tjekkede for overensstemmelse med Sanger-sekventeringsbaserede opkald. Hvis vi overvejer konsistente opkald mellem HLApers og Kourami, observerede vi kun 10 uoverensstemmelser med Sanger-kaldene ud af 288 sammenligninger (3 loci×96 individer). De fleste af dem (n=5) viste støtte fra RNA-seq for en allel meget tæt på den, der blev bestemt ved Sanger-sekventering, og derfor valgte vi at beholde de RNA-seq-baserede kald. For 3 genotyper observerer vi homozygote opkald fra RNA-seq sandsynligvis fordi en allel ikke blev udtrykt, og vi beholdt opkaldene fra Sanger-sekventering. Dette påvirker ikke ekspressionsestimeringen, da ingen læsninger aligner med allelen, der ikke er påvist via RNA-seq. For en genotype observerede vi god støtte for et heterozygot kald, hvorimod Sanger-sekventeringen blev kaldt en homozygot. I det tilfælde beholdt vi det RNA-seq-baserede opkald, da det bedre forklarede de observerede læsninger. For et allelkald betragtede vi en fejl i de RNA-seq-baserede opkald på grund af utilstrækkelig læsedækning.

Kvantitativ PCR (qPCR)

HLA mRNA-transkriptionsniveauer for HLA-A, -B og -C blev målt ved qPCR i et assay, der sikrer upartisk amplifikation af de fælles alleler på hvert locus, mens amplifikation af alle andre loci undgås. De anvendte primere var: HLA-A (F, GCTCCCACTCCATGAGGTAT; R, AGTCTG TGACTGGGCCTTCA); HLA-B (F, ACTGAGCTTGG GAGACCAGA; R, GCAGCCCCTCATGCTGT); HLA-C (F, CTGGCCCTGACCGAGACCTG; R, CGCTTGTAC TTCTGTGTCTCC). Revers transkription blev udført under anvendelse af High-Capacity RNA-to-cDNA kit (Applied Biosystems). Amplifikation af HLA og husholdningsgenet 2 mikroglobulin (B2M) cDNA blev udført under anvendelse af Power SYBR green master mix (Applied Biosystems) på en ABI 7900HT maskine. Primersekvenser for B2M er beskrevet i tabel S4 af Kulkarni et al. (2013). Det gennemsnitlige ekspressionsniveau for hvert HLA-gen blev normaliseret til det for B2M og beregnet ved hjælp af 2-∆∆Ct-metoden (hvor Ct er tærskelcyklussen).

Gennemsnitlige allelspecifikke ekspressionsniveauer af almindelige HLA-alleler blev estimeret ved en lineær model som beskrevet i Ramsuran et al. (2015). Specifikt modellerede vi ekspression som en lineær funktion af de to alleler båret af hvert individ og ekstraherede virkningerne af hver allel på genekspression. Vi udførte dette trin i R (se afsnittet Kode tilgængelighed).

Overflade udtryk

HLA-C-celleoverfladeekspression blev målt på CD3 plus-celler fra frisk isolerede PBMC'er ved flowcytometri under anvendelse af det HLA-C-specifikke monoklonale antistof DT9 (Apps et al. 2013). Til HLA-A-analysen i en undergruppe af individer, der bærer A*03 og A*11, farvede vi celler med antistoffet 0554HA (One Lambda, Inc.).

RNA-sekv

RNA præparation

RNA-seq blev udført på RNA opbevaret ved -80 grader. Totalt RNA blev kvantificeret ved anvendelse af Qubit RNA HS-assay (Thermo Fisher). RNA-kvaliteten blev vurderet ved hjælp af et 2100 Bioanalyzer-instrument og et Agilent 6000 RNA Pico Kit (Agilent Technologies). For hver prøve blev 500 ng totalt RNA anvendt som input til fremstilling af hele transkriptom-rRNA-udtømte biblioteker. Et adapter-ligeret bibliotek blev fremstillet med KAPA HyperPrep Kit (KAPA Biosystems, Wilmington, MA) under anvendelse af Bioo Scientific NEXTfex™ DNA-stregkodede adaptere (BioScientifc, Austin, TX, USA) i henhold til KAPA-leveret protokol.

rRNA-depletering ved hjælp af RiboErase

Ribosomalt RNA blev udtømt ved at inkubere totalt RNA med prober komplementære til rRNA-sekvenser. Efter hybridisering blev RNase H anvendt til enzymatisk at nedbryde rRNA. Oprydning og DNase-fordøjelse blev udført under anvendelse af Kapa Pure Beads og DNase i henhold til Kapa-protokollen.

Fragmentering, cDNA-syntese og bibliotekskonstruktion

rRNA-udtømte prøver blev fragmenteret ved 85 grader i 4,5 minutter i nærvær af magnesium før syntese af 1. og 2. streng og A-Tailing-reaktioner. NEXTfex DNA-stregkodede adaptere (1,5 uM) blev ligeret til A-hale-cDNA med en unik stregkode for hver prøve. Produkter blev oprenset med Kapa Pure Beads og 8 cyklusser af biblioteksforstærkning blev udført. Efter amplifikation blev der udført en sidste biblioteksoprydning, og bibliotekskvantificering og QC blev vurderet ved anvendelse af Qubit DNA HS Assay (Thermo Fisher) og Agilent DNA HS kit på 2100 Bioanalyzer instrumentet.

Sekvensering

De resulterende multipleksede sekventeringsbiblioteker blev brugt i klyngedannelse på en Illumina cBOT (Illumina, San Diego, CA, USA), og sekventering blev udført ved hjælp af en Illumina HiSeq 2500 efter Illumina-leverede protokoller til 2 × 126 bp parret ende-sekventering. Hvert transkriptom blev sekventeret til en måldybde på 40-50 millioner aflæsninger.

RNA-seq på friske prøver fra 11 individer

For at undersøge muligheden for prøvenedbrydning af materiale lagret ved -80 grader før RNA-sekventering, en potentiel kilde til uenighed med qPCR-estimater, udtog vi blod fra 11 donorer og udførte RNA-seq på de nye prøver. Eksperimentet blev udført med samme biblioteksforberedelse og -metoder som før, men sekventeret ved hjælp af en Illumina NextSeq med 2×150 pb-læsninger.

Kvantificering af ekspression for RNA-seq

Reference transkriptom

Vi brugte Salmon (Patro et al. 2017) til at estimere ekspressionsniveauer for alle transkripter annoteret i Gencode v37-databasen. Vi brugte alle muligheder for bias-korrektion på laks (GC-bias, positional bias og sekvensspecifik bias).

Personliggjort

Samme som "Ref-transkriptomet", men med personlige HLA-transkripter i henhold til HLA-A-, -B- og -C-genotyperne, der bæres af hvert individ. Personaliseringen blev udført ved at tilpasse sekvensen for referencegenomets HLA-allel til genomet for at få koordinaterne. Derefter, ved at bruge multi-sekvens alignment af allelen til stede på referencegenomet med alle de andre alleler (tilgængelig fra IPD-IMGT/HLA release 3.43.0 (Robinson et al. 2020)), tilskrev vi genomisk positioner til alle HLA-alleller. Til sidst konstruerede vi et personligt transkript baseret på kombinationen af ​​information om transkriptionskoordinater og HLA-allelens sekvens. Denne procedure blev udført i R (R Core Team 2020), ved hjælp af Biostrings-pakken (Pagès et al. 2020) og tidyverse meta-pakken (Wickham et al. 2019).

For more information:1950477648nn@gmail.com