Sammenlignende undersøgelse af kemiske bestanddele og indhold af Cistanche Tubulosa (Guanhua Roucongrong) og dets forarbejdede produkter

Abstrakt

Objektiv:At undersøge variationen (ændringsmønstre) i indholdet af kemiske bestanddele i forarbejdede produkter afCistanche tubulosa(Guanhua Roucongrong).
Metoder:Fem typer afkogsstykker blev udvalgt, herunder rå skiver, vindampede skiver, dampede skiver, røre-forarbejdede-med-sorte-bønner-skiver og sort-bønne-juice-forarbejdede skiver. En HPLC-fingeraftryksmetode blev etableret og kombineret med lighedsevaluering, klyngeanalyse (CA) og principal komponentanalyse (PCA) for at screene og bekræfte differentielle komponenter mellem råproduktet og forarbejdede produkter. Kemometriske metoder og HPLC blev anvendt til at bestemme og sammenligne forskellene i indholdet af totale phenylethanoidglycosider, polysaccharider, totale flavonoider og fire phenylethanoidglycosider blandt de rå og forarbejdede prøver.
Resultater:HPLC fingeraftryk afCistanche tubulosa and its processed products were established. With Mark peak matching, 9 common peaks were assigned for raw slices, whereas 11 common peaks were assigned for the other four processed products. Peaks No. 2 and No. 7 were differential chromatographic peaks. By comparison with reference standards, four chromatographic peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Fingerprints of the processed products showed similar profiles with the same number of common peaks; similarity values were all >0,9. Ved at bruge echinacosid som referencetop, varierede RSD for relative retentionstider for almindelige toppe blandt forskellige forarbejdede produkter fra 0,11 % til 0,82 %, mens RSD for relative toparealer varierede fra 15,46 % til 76,07 %. Da afstanden mellem klasserne blev sat til 10, klassificerede CA rå skiver og forarbejdede produkter i tre kategorier. PCA indikerede sammensætningsforskelle mellem rå og behandlede prøver: de 11 spidsvariabler blev reduceret til tre hovedkomponenter; forskellige hovedkomponenter korreleret med forskellige kromatografiske toppe. Baseret på komponentmatrixen og lineær vægtning viste omfattende score, at sort-bønne-juice-forarbejdede skiver og de gul-vin-dampede og vanddampede skiver rangerede højere. Indholdet i rå og forarbejdede prøver var som følger: total phenylethanoid glycosider 3,80%–7,07%, total polysaccharider 5,85%–6,70%, total flavonoider 14,16%–24,26%; echinacosid 4,11%-5,99%, acteosid 0,67%-1,34%, cistanosid A 0,06%-0,36% og isoacteosid 0,25%-1,66%. Der var betydelige forskelle mellem forarbejdede produkter.
Konklusion:Den etablerede HPLC-fingeraftryksmetode har stærk specificitet og adskiller effektivt rå skiver fra forarbejdede produkter afCistanche tubulosa, og er velegnet til kvalitativ og kvantitativ analyse af echinacosid, acteosid, cistanosid A og isoacteosid i det rå lægemiddel og forarbejdede produkter. Den sammenlignende profilering og af indholdsændringer mellem forskellige prøver kan give et videnskabeligt grundlag for identifikation og kvalitetskontrol afCistanche tubulosaog dets forskellige forarbejdede produkter.

Nøgleord: Cistanche tubulosa; forarbejdning; kemiske bestanddele; fingeraftryk; højtydende væskekromatografi (HPLC)

 

1 Indledning

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight (Guanhua Roucongrong) er en flerårig urt i Orobanchaceae og er en officielt opført kilde til Cistanches Herba i Folkerepublikken Kinas farmakopé (i det følgende benævnt "den kinesiske farmakopé"). Den medicinske del er den tørrede kødfulde stilk med skællende blade. Det er varmt af natur, sødt og salt i smagen og kommer ind i nyrernes og tyktarmens meridianer, med funktioner som tonificering af nyre-yang, gavner essens og blod og fugter tarmene for at lindre forstoppelse [1]. Moderne farmakologiske undersøgelser har bekræftet flere aktiviteter, såsom anti-aging, immunforstærkning, nyre-tonificerende og afrodisiakum virkninger, afføringseffekter og antihypertensiv aktivitet.

Cistanche tubulosaer rig på phenylethanoidglycosider, iridoider og deres glycosider, lignaner, oligosaccharidestere, polyoler, polysaccharider, flavonoider og andre bestanddele [2]. Blandt disse er phenylethanoidglycosider de vigtigste aktive komponenter og de mest udbredte forbindelser; de er også markørkomponenter for indholdsbestemmelse i farmakopéen og udviser forskellige bioaktiviteter såsom antioxidantvirkninger, metabolisk fremme, forbedring af indlæring og hukommelse og forbedring af seksuel funktion [3].

Cistanche tubulosaforetrækker saltvand-alkali jord og Gobi ørken regioner, snylter på rødder afTamarixspp., og er hovedsageligt distribueret i Indre Mongoliet, Xinjiang og Gansu i Kina [4]. Vilde og dyrkede geo-autentiske områder omfatter Minfeng County, Yutian, Pishan og Moyu i Hotan Prefecture, Xinjiang. Dens forarbejdning er hovedsageligt udviklet til afkogsstykker i skiver, rå urtematerialer, ekstrakter, sundhedsprodukter og funktionelle fødevarer; blandt disse forbliver kommercielle afkogsstykker mainstream. Men på markedet er forskellige forarbejdede produkter - såsom rå skiver, vinforarbejdede skiver, højtemperatur enzym-inaktiverede skiver og vanddampede skiver - ofte blandet og vanskeligt at skelne.

Bearbejdningen af ​​Cistanches Herba har udviklet sig over tid, fra gamle optegnelser som f.eksTaiping Shenghui Fang, Zhenglei Bencao, ogPuji Fang[5–7] (f.eks. vask med vin, omrøring med vin, dampning/bagning med vin, iblødsætning/bagning tør med vin, kogning i vand, tredobbelt dampning og smørrørstegning) til moderne metoder såsom vinmaceration (dampning), enkelt dampning, "fire-dampning", og [8.] Forskellige behandlingsmetoder kan påvirke indholdet af aktive bestanddele, sikkerhed og biologisk aktivitet. Cai Hong et al. [9] fandt, at enzyminaktivering af friskt materiale med 70 grader varmt vand i 6 minutter resulterede i, at indholdet af echinacosid og acteosid var henholdsvis 7,3 gange og 6,5 gange højere end ved direkte soltørring. Tie Xiaoyan et al. [10] rapporterede, at dampbehandling markant forbedrede kvaliteten af ​​afkogsstykker sammenlignet med friske materialer. Chen Weijun et al. [11] observerede, at betainindholdet faldt efter vin-, salt- og dampforarbejdning sammenlignet med friske produkter. Zhang Chao et al. [12] viste, at under vindampning, med længere dampningstid, faldt echinacoside, acteosid, cistanosid A og 2'-acetylacteosid gradvist, hvorimod isoacteosid steg betydeligt.

Den nuværende 2025-udgave af den kinesiske farmakopé sætter kun grænser for echinacosid og acteosid i rå skiver og vindampede skiver, men specificerer ikke markørkomponenter for andre forarbejdede produkter og mangler effektive indholdskontrolmetoder. Derfor er det særligt vigtigt at analysere og sammenligne karakteristiske bestanddele og udforske mønstre for sammensætningsændringer for kvalitativ identifikation og kvantitativ kontrol af rå og forarbejdede produkter.

Traditionel kinesisk medicin (TCM) fingeraftryk er en holistisk repræsentation af kemiske bestanddele. Med fordele af integritet, specificitet og rig information bruges det i vid udstrækning til kvalitetskontrolevaluering af rålægemidler og præparater, tilpasning til internationale standarder, ægthedsidentifikation, overvågning af fremstillingsprocesser og forskning i farmakodynamiske stoffer [13]. Baseret på HPLC-fingeraftryk valgte denne undersøgelse echinacosid, acteosid, cistanosid A og isoacteosid som kvalitetsmarkører og anvendte lighedsanalyse, CA og PCA kombineret med indholdsbestemmelse til at sammenligne kemiske bestanddele og indholdsændringsmønstre mellem forskellige forarbejdede produkter, hvilket giver et videnskabeligt grundlag for identifikation og kvalitetskontrol.

 

2 Instrumenter og materialer

2.1 Instrumenter

U3000 HPLC-system (Thermo Fisher); UPL-111-20R ultrarent vandsystem (Sichuan Youpu); AB 265-S elektronisk vægt (Mettler Toledo); KQ-5200DA ultralydsekstraktor/renser (Kunshan Ultrasonic); GZX-9240MBE elektrisk tørreovn (Shanghai Boxun); UV-2600 UV–Vis spektrofotometer (Shimadzu, Kina).

2.2 Lægemidler og reagenser

FriskCistanche tubulosa(Batch No. 20241008) blev leveret af Xinjiang Congrongtang Biotechnology Co., Ltd. og godkendt af forskeren Wang Guoping (Xinjiang Uygur Autonomous Region Institute of Materia Medica) som den kødfulde stamme afCistanche tubulosa(Schenk) Wight (Orobanchaceae).

Referencestoffer: D-glucose vandfri (batchnr.. 361810, 100,00%, Shenzhen Jinhui Biotechnology Co., Ltd.); echinacosid (batchnr.. 111670-201907), rutin (batchnr.. 100080-202012), acteosid (batchnr.. 11530-202315), cistanosid A (batchnr.. 313512) og isoacteosid (batchnr.. 313413), med HPLC-analyserenhed større end eller lig med 91,2 %, 91,8 %, 91,8 %, 98,06 % og 98,09 % fra henholdsvis National Institutes for Food and Drug Control (Kina).(Bemærk: en renhedslinje er afkortet i den medfølgende tekst; ovenstående følger den læsbare del.)

Gul risvin (halvtør type, alkohol 16%; Zhejiang Guyuelongshan Shaoxing Wine Co., Ltd.); methanol og acetonitril (HPLC-kvalitet, Fisher Scientific, USA). Andre reagenser var af analytisk kvalitet.

3 Metoder og resultater

3.1 Tilberedning af rå skiver og forarbejdede produkter afCistanche tubulosa

Følgende metoder blev brugt til at fremstille rå skiver og forarbejdede produkter, hver i 6 batches.

Rå skiver:FriskCistancheblev skåret i 3 mm skiver og tørret ved 60 grader.

Dampmetode:Ifølge litteraturen [14] blev 20 g rene skiver blandet med 6 mL destilleret vand i en forseglet beholder, fugtet i 4 timer [12], dampet over vand i 12 timer, afkølet og tørret ved 60 grader.

Vinforarbejdningsmetode:Tilberedt i overensstemmelse med vinstuvnings- eller vindampningsmetoden (generel regel 0213, kinesisk farmakopé).

Omrøring med sorte bønner:Udarbejdet iflgKinesisk Materia Medica(Zhonghua Bencao) under Cistanches Herba; sorte bønner blev tilsat ved 1 kg pr. 10 kgCistanchemateriale.

Forarbejdning af sort-bønnejuice:Skiverne blev blandet med sort bønnejuice og derefter behandlet ved dampningsmetoden ovenfor; doseringen af ​​sorte bønner var den samme som ovenfor.

3.2 Fastlæggelse af inspektionsgenstande

Fugtighed blev bestemt ved ovntørring (generel regel 0832, kinesisk farmakopé); total aske i henhold til almindelig regel 2302; alkoholopløselige ekstraktiver ved koldmacerationsmetoden i henhold til generel regel 2201. Resultaterne er vist i tabel 1.

 

3.3 Sammenlignende analyse af HPLC-fingeraftryk afCistanche tubulosaog dets forarbejdede produkter

3.3.1 Kromatografiske betingelser

Waters Xterra RP18-søjle (250 mm × 4,6 mm, 5 µm). Mobil fase: acetonitril (A)–0,1 % myresyre (B) med gradienteluering: 0–12 min, 14 % A → 17 % A; 12–30 min, 17 % A → 19 % A; 30–35 min, 19 % A → 14 % A; 35–50 min., 14 % A. Flowhastighed: 1,0 mL·min⁻¹. Søjletemperatur: 30 grader. Detektionsbølgelængde: 330 nm. Injektionsvolumen: 10 µL.

3.3.2 Forberedelse af løsninger

Referenceløsninger:Echinacosid-, acteosid-, cistanosid A- og isoacteosid-referencestoffer blev nøjagtigt vejet og opløst i 50% methanol i 10 ml målekolber for at opnå opløsninger på henholdsvis 1,1301, 0,2294, 0,2255 og 0,2109 mg-¹mL filtreret for at opnå endelige opløsninger.

Eksempel på løsninger:0,5 g 80-mesh pulver af rå og behandlede prøver blev nøjagtigt vejet, ekstraheret med 50% methanol i en 25 ml målekolbe, ultralydbehandlet (200 W, 40 kHz) i 40 minutter, afkølet, blandet, lov til at stå og filtreret gennem en 0,22 µm membran; filtratet blev anvendt.

3.3.3 Metodevalidering (fingeraftryk)

3.3.3.1 Præcision

Den samme prøveopløsning blev injiceret seks på hinanden følgende gange. Ved at bruge echinacosid som referencetop var RSD for relative retentionstider for almindelige toppe<0.48% and the RSD of relative peak areas was <2.86%, indicating good instrumental precision.

3.3.3.2 Gentagelighed

Seks parallelle prøveopløsninger blev fremstillet fra den samme batch (rå skive S1). Ved at bruge echinacosid som referencetop var RSD for relative retentionstider<0.07% and the RSD of relative peak areas was <2.77%, indicating good method repeatability.

3.3.3.3 Stabilitet

Den samme prøveopløsning blev analyseret efter 0, 3, 6, 9, 12 og 24 timer. Ved at bruge echinacosid som referencetop var RSD for relative retentionstider<0.11% and the RSD of relative peak areas was <2.33%, indicating stability within 24 h.

3.3.4 Etablering af fingeraftryk

Tredive partier afCistanche tubulosaog forarbejdede produkter blev analyseret. "Similarity Evaluation System for Chromatography Fingerprint of Traditional Chinese Medicine" (2012-udgaven) blev brugt. Rå skive S1 og gulvinsdampet skive J1 blev brugt som referencefingeraftryk; middelmetoden og en tidsvinduebredde på 0,1 min blev anvendt til flerpunktskorrektion og Mark peak-matching for at generere fingeraftryk (figur 1-2), og overlejrede kromatogrammer med blandede referencestandarder blev opnået (figur 3).

Resultaterne viste, at de fire forarbejdede produkter havde fingeraftryksprofiler svarende til dem for rå skiver. Rå skiver havde 9 fælles toppe, mens vindampede, dampede, røre-behandlede-med-sorte-bønner og sort-bønne-juice-behandlede skiver havde 11 fælles toppe. Ni fælles toppe blev delt af begge. Toppe No. 2 og No. 7 var karakteristiske toppe, der adskilte rå skiver fra forarbejdede produkter. Fingeraftryksprofiler blandt de fire forarbejdede produkter var ens og afspejlede ikke tydeligt forskelle mellem dem.

3.3.5 Lighedsanalyse

Using J1 as the reference fingerprint, similarity analysis was performed for different processed products (Table 2). Similarities were all >0.9, hvilket indikerer lignende fingeraftrykskarakteristika blandt forskellige forarbejdede produkter.

3.3.6 Identifikation af almindelige toppe

Ved at sammenligne retentionstider med blandede referencestandarder og råskromatogrammet, blev fire kromatografiske toppe identificeret: Top 4, echinacosid; top 9, cistanosid A; top 10, acteosid; Top 11, isoacteosid (figur 2). Med Peak 4 (echinacosid) som referencetop, varierede RSD-værdier for relative retentionstider for almindelige toppe blandt forskellige batcher af de fire forarbejdede produkter fra 0,11 % til 0,82 %, og RSD-værdier for relative toparealer varierede fra 15,46 % til 76,07 %.

3.3.7 Klyngeanalyse

SPSS 27.0 blev brugt til klyngeanalyse af rå skiver og forarbejdede produkter. Inter-gruppe binding blev påført, og kvadratisk euklidisk afstand blev anvendt (figur 4). Da mellemklassedistancen var<5, water-steamed slices and wine-steamed slices clustered together. When the inter-class distance was 10, raw slices and the four processed products were classified into three categories: raw materials (S1–S6) as one category; black-bean-juice-processed slices (H1–H6) as one category; and wine-steamed slices (J1–J6) together with water-steamed slices (Q1–Q6) and stir-processed-with-black-beans slices (C1–C6) as one category. When the inter-class distance was between 15 and 25, black-bean-juice-processed slices formed a separate cluster from the other samples.

3.3.8 Hovedkomponentanalyse

Efter standardisering af topområder blev PCA udført med SPSS 27.0. KMO-værdien var 0,679 og Bartletts testsignifikans var<0.001, indicating suitability for PCA. With eigenvalues >1 blev tre hovedkomponenter ekstraheret med egenværdier 6,815, 1,987 og 1,105. Afvigelsesbidragssatserne var henholdsvis 61,954 %, 18,063 % og 10,047 % med en kumulativ afvigelsesbidragssats på 90,064 % (tabel 3). Dette indikerer, at den første hovedkomponent er den vigtigste indikator for den omfattende score.

Komponentmatricen viste, at i den første hovedkomponent var de absolutte koefficienter for spidsarealvariabler for Peaks 2-9 og Peak 11 relativt store, hvilket tyder på en stærk indflydelse på F1. Den anden hovedkomponent korrelerede med informationen om top 1 og 10, og den tredje hovedkomponent korrelerede med top 1. Komponentmatricen er vist i tabel 4; scree plot og loading plot er vist i figur 5 og 6. Ved at bruge scorerne for de tre hovedkomponenter og deres variansbidragssatser som vægte for lineær vægtning, blev omfattende scores beregnet (tabel 5), hvilket indikerer, at sort-bønne-juice-forarbejdede skiver, vanddampede skiver, og vindampede højere rangerede skiver.

 

3.4 HPLC-bestemmelse af flere bestanddele iCistanche tubulosaog dets forarbejdede produkter

3.4.1 Kromatografiske betingelser og specificitet

Kromatografiske betingelser var de samme som dem, der blev brugt til fingeraftryk. Prøveopløsninger, referenceopløsninger og negative blindopløsninger (gul risvin, renset vand, sort bønnejuice) blev hver injiceret (10 µL). Retentionstider blev sammenlignet. De negative blindopløsninger viste ingen interferens med echinacosid, cistanosid A, acteosid og isoacteosid.[tekst mangler i kilden]

3.4.2 Linearitet

Referenceopløsninger af echinacosid, acteosid, cistanosid A og isoacteosid i koncentrationer på 1,1301, 0,2294, 0,2255 og 0,2109 mg·mL⁻1 blev nøjagtigt pipetteret ved 1, 2, 4, 8, 10 µl og 10 µl. Lineær regression blev udført med topareal XXX versus injiceret koncentration YYY (mg·mL⁻1). De lineære ligninger og områder er vist i tabel 6.

3.4.3 Præcision

Den samme prøveopløsning blev injiceret seks på hinanden følgende gange. RSD-værdier af indholdet for de fire analytter (echinacosid, cistanosid A, acteosid, isoacteosid) var henholdsvis 0,23 %, 2,71 %, 0,53 % og 2,08 % (tabel 7), alle<3%, indicating good instrumental precision.

3.4.4 Gentagelighed

Seks parallelle prøveopløsninger blev fremstillet fra den samme batch (rå skive S1). RSD-værdier af indholdet for de fire analytter var henholdsvis 0,22 %, 2,46 %, 0,50 % og 2,46 % (tabel 7), alle<3%, indicating good repeatability.

3.4.5 Stabilitet (intra-dag)

Den samme prøveopløsning blev analyseret efter 0, 3, 6, 9, 12 og 24 timer. RSD-værdier af indholdet for de fire analytter var henholdsvis 0,80 %, 1,62 %, 1,72 % og 1,49 % (tabel 7), alle<2.0%, indicating stability within 24 h.

3.4.6 Stabilitet (inter-dage)

Den samme prøveopløsning blev analyseret i fem på hinanden følgende dage. RSD-værdier af indholdet for de fire analytter over fem dage var henholdsvis 2,80 %, 2,53 %, 3,53 % og 2,88 % (tabel 7), hvilket indikerer stabilitet inden for fem dage.

3.4.7 Inddrivelse

En passende mængdeCistanche tubulosaprøven blev vejet, og referencestandarder for echinacosid, acteosid, cistanosid A og isoacteosid blev tilsat i forholdet 1:1. Seks parallelle prøveopløsninger blev fremstillet og analyseret (10 µL injektion). Gennemsnitlige gendannelser var 99,29 %, 98,75 %, 99,45 % og 96,13 % (n=6), med RSD-værdier på henholdsvis 2,51 %, 0,38 %, 1,71 % og 0,49 %.

3.4.8 Bestemmelsesresultater

For hver prøve blev 0,5 g pulver nøjagtigt vejet; 10 µL blev injiceret for at bestemme og beregne det procentvise indhold af de fire bestanddele. Resultaterne er vist i figur 7-10.

 

3.5 Bestemmelse af totale phenylethanoidglycosider, totale polysaccharider og totale flavonoider

3.5.1 Bestemmelse af totale phenylethanoidglycosider

3.5.1.1 Fremstilling af referenceopløsning

En passende mængde echinacosid-referencestof blev nøjagtigt vejet og opløst i methanol i en 10 ml målekolbe for at opnå en opløsning med en koncentration på 0,32 mg·ml-1. Ifølge litteraturen [15] blev 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 og 1,2 ml af referenceopløsningen pipetteret, fortyndet til 10 ml med methanol, og absorbans (A) blev målt ved 333 nm. Den tilpassede standardkurveligning var Y=24.7596X+0.0147Y=24.7596X + 0.0147Y=24.7596X+0.0147, R2=0.9995R^2=0.9995R2=0.9995, med et lineært område på 0,0029 mg·0.0359 mg·0.0359 mg·0.0359

3.5.1.2 Klargøring af prøveopløsning

100 mg prøvepulver (passeret gennem en 100-mesh sigte) blev nøjagtigt vejet, ekstraheret ultralyd med methanol i 30 minutter (200 W, 40 kHz), fortyndet til 10 ml og filtreret gennem en 0,22 µm membran. Derefter blev 0,2 ml filtrat yderligere fortyndet til 10 ml med methanol og blandet til analyse.

3.5.1.3 Bestemmelse

For hver prøve blev 100 mg pulver brugt til at fremstille prøveopløsningen. Absorbansen blev målt ved 333 nm, og det procentvise indhold af totale phenylethanoidglycosider blev beregnet (tabel 9).

Ligning (1):
Indhold (%) =C×V×Dm×100%= \\dfrac{C \\times V \\times D}{m} \\times 100\\%=mC×V×D​×100%
hvor CCC er koncentrationen af ​​analytten i prøveopløsningen, VVV er fortyndingsvolumenet, DDD er fortyndingsfaktoren, og mmm er prøvemassen (mg).

3.5.2 Bestemmelse af totale polysaccharider

3.5.2.1 Fremstilling af referenceopløsning

En passende mængde vandfrit D-glucose-referencestof blev nøjagtigt vejet, opløst i renset vand og fortyndet til 10 ml for at opnå en opløsning på 0,190 mg·mL-1. Efter blanding og filtrering (0,22 µm) blev 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 og 1,0 ml pipetteret. Farveudvikling blev udført ved anthron-svovlsyremetoden [16]. Absorbansen blev målt ved 625 nm. Den tilpassede standardkurveligning var Y=35.1316X−0,0079Y=35.1316X - 0.0079Y=35.1316X−0,0079, R2=0.9957R^2=0.9957R2=0.9957, med et lineært interval på 0,0038 mg⁻¹.01.

3.5.2.2 Klargøring af prøveopløsning

40 mg prøvepulver blev nøjagtigt vejet, ultralyd opløst i renset vand i 30 minutter (200 W, 40 kHz), fortyndet til 10 ml og filtreret gennem en 0,22 µm membran.

3.5.2.3 Bestemmelse

For hver prøve blev der brugt 40 mg til at fremstille prøveopløsningen. Derefter blev 0,1 ml filtrat pipetteret og suppleret med renset vand til 2,00 ml. Efter farveudvikling ved anthron-svovlsyremetoden blev absorbansen målt, og det procentvise indhold af totale polysaccharider blev beregnet (tabel 8).

3.5.3 Bestemmelse af totalflavonoider

3.5.3.1 Fremstilling af referenceopløsning

En passende mængde rutin-referencestof blev nøjagtigt vejet, opløst i 70% ethanol og fortyndet til 25 ml; filtreret gennem en 0,22 µm membran. Derefter blev 0,5, 1,0, 2,0, 3,0 og 4,0 ml pipetteret. Farveudvikling blev udført ved hjælp af natriumnitrit-aluminiumnitrat-natriumhydroxid-metoden [17]. Absorbans blev målt ved 510 nm. Den tilpassede standardkurveligning var Y=11.5699X+0.0684Y=11.5699X + 0.0684Y=11.5699X+0.0684, R2=0.9989R^2=0.9989R2=0.9989, med et lineært interval på 0,0097-0,0097 mg¹.

3.5.3.2 Klargøring af prøveopløsning

50 mg pulver blev nøjagtigt vejet, ultralyd opløst i 70 % ethanol i 30 minutter (200 W, 40 kHz), fortyndet til 10 ml og filtreret gennem en 0,22 µm membran.

3.5.3.3 Bestemmelse

For hver prøve blev der brugt 50 mg til at fremstille prøveopløsningen. Derefter blev 0,5 ml filtrat overført til en 10 ml målekolbe, og farvereagenser blev tilsat i rækkefølge som ovenfor. Renset vand tjente som blank. Absorbansen blev målt, og det procentvise indhold af totale flavonoider blev beregnet (tabel 8).

 

4 Diskussion

I denne undersøgelse er HPLC-fingeraftryk afCistanche tubulosa and its various processed products were established. Peak matching across different batches confirmed 9 common peaks in raw slices and 11 common peaks in processed products. By comparison with reference standards, four common peaks were identified as echinacoside, cistanoside A, acteoside, and isoacteoside. Similarity analysis showed that similarity values among four processed products were all >0,9, og de overordnede fingeraftryksprofiler var ens, hvilket indikerer, at deres bestanddele var tætte. De store forskelle i RSD af relative topområder tyder dog på bemærkelsesværdige forskelle i indholdet af bestanddele.

Sammenlignet med rå skiver udviste de fire forarbejdede produkter yderligere to toppe (top 2 og 7), hvilket indikerer, at kemiske bestanddele ændrede sig efter vindampning, vanddampning eller forarbejdning af sorte bønner. Disse nyligt genererede toppe formodes at blive dannet under behandling; deres komponentkarakterisering vil blive behandlet i efterfølgende undersøgelser.

CA resultater viste, at når inter-klasse distancen var<5, wine-steamed and water-steamed slices clustered together, suggesting similar chemical composition and content. At an inter-class distance of 10, raw slices could be separated from black-bean-juice-processed slices, stir-processed-with-black-beans slices, and wine/water-steamed slices. At inter-class distances of 15–25, differences between black-bean-juice-processed slices and other samples became more prominent. PCA results indicated that three principal components had substantial influence on comprehensive evaluation.

Forskellige behandlingsmetoder påvirkede direkte niveauerne af forskellige bestanddele. Baseret på kemometrisk bestemmelse rangeres de samlede phenylethanoidglycosider som: sort-bønne-juice-forarbejdet > rå skiver > vanddampet > vin-dampet > røre-behandlet-med-sorte-bønner. Det samlede antal polysaccharider rangeret som: vanddampet > vindampet > røre-behandlet-med-sorte-bønner > sort-bønne-juice-forarbejdet > rå skiver. Samlet antal flavonoider rangeret som: sort-bønne-juice-forarbejdet > vanddampet > røre-behandlet-med-sorte-bønner > vin-dampet > rå skiver. Sammenlignet med rå skiver øgede bearbejdning af sort-bønnejuice det samlede antal phenylethanoidglycosider, mens andre forarbejdningsmetoder reducerede det; alle fire forarbejdningsmetoder øgede det samlede antal polysaccharider og det samlede antal flavonoider markant. Mellem de to sorte-bønne-metoder producerede sort-bønne-juice-forarbejdning større stigninger i det samlede antal phenylethanoid-glycosider og det samlede antal flavonoider end omrøring-forarbejdning med sorte bønner, med statistiske forskelle.

 

Tabel 8. Bestemmelsesresultater af totale phenylethanoidglycosider, totale polysaccharider og totale flavonoider iCistanche tubulosaog dets forarbejdede produkter

Forarbejdet produkt (afkogsstykker)	Samlede phenylethanoidglykosider (%)	Totalt antal polysaccharider (%)	Samlet antal flavonoider (%)
Rå skiver	6.81 ± 0.06	5.85 ± 0.10	14.16 ± 0.24
Vindampede skiver	5.10 ± 0.05***	6.61 ± 0.05***	20.84 ± 0.33***
Vanddampede skiver	5.23 ± 0.05***	6.70 ± 0.15***	21.59 ± 0.37***
Rørbehandlet med skiver af sorte bønner	3.80 ± 0.02***	6.56 ± 0.09***	21.02 ± 0.35***
Sort-bønne-juice-forarbejdede skiver	7.07 ± 0.09****	6.09 ± 0.03****	24.26 ± 0.18****

Bemærkninger: Sammenlignet med rå skiver: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001; sammenlignet med røre-behandlede-med-sorte-bønner-skiver: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Echinacosid, acteosid, cistanosid A og isoacteosid er nøglephenylethanoidglykosider, der bidrager til de nyretonificerende og essens-begunstigende virkninger afCistanche tubulosa. HPLC-sammenligning af disse fire bestanddele viste, at spidsarealforskelle mellem almindelige toppe kunne tjene som grundlag for at skelne mellem forskellige forarbejdede produkter. Sammenlignet med rå skiver steg echinacosid, cistanosid A og isoacteosid i varierende grad i forarbejdede produkter, med mere udtalte stigninger i sort-bønne-juice-produkter. Acteosid faldt i tre forarbejdede produkter, men steg i omrørings-forarbejdede-med-sorte-bønner-produkter. Dette kan relatere til den iboende stabilitet af acteosid: som et phenylethanoid diglycosid med en caffeoyl-del kan det undergå esterbindingsspaltning under ændringer i opvarmningstemperatur, tid og pH for at generere koffeinsyre og delvist isomerisere til isoacteosid. Det observerede fald i acteosid og stigning i isoacteosid i de fire forarbejdede produkter kan være forbundet med højtemperaturdampning, i overensstemmelse med mønstre rapporteret for Rehmanniae Radix-behandling [18].

Echinacoside steg efter vin/vanddampning og sortbønnebehandling i denne undersøgelse, hvilket er i modstrid med Zhang Chao et al. [12]. Ved at sammenligne røre-bearbejdning med sorte bønner og sort-bønne-juice-bearbejdning, viste sidstnævnte signifikant højere indhold af echinacosid og cistanosid A og en mere udtalt omdannelsestendens fra acteosid til isoacteosid. Samlet set afslører denne undersøgelse ændringer i sammensætning og indhold efter forskellige behandlingsmetoder og verificerer ændringen mellem acteosid og isoacteosid. HPLC-fingeraftrykkene giver en videnskabelig metode til at identificere rå skiver og forarbejdede produkter og tilbyder en reference til etablering af kvalitetskontrolstandarder og til kvalitative og kvantitative analyser.

 

Interessekonflikt

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.

Forfatterbidrag

XU Xiaoqin: projektstøtte, studiedesign, eksperimentel bestemmelse og manuskriptskrivning;
QING Degang: overordnet koordinering og indsamling af medicinske materialer;
ZHANG Juan og ZHAO Peng'an: bestemmelse af bestanddele og dataanalyse;
WANG Guoping: autentificering af medicinske materialer.

 

Cistanche Sample Factory:

https://www.xjcistanche.com/about-us

 

 

Referencer

[1] Farmakopékommissionen under Folkerepublikken Kinas sundhedsministerium.Farmakopé for Folkerepublikken Kina[M]. Beijing: Chemical Industry Press, 2025.
[2] Jia Xiaoguang, Ni Hui, Zhang Juan, et al. Forskning og industriel udvikling status afCistanche tubulosa [J]. Journal of Xinjiang Medical University, 2012, 35(7): 876–880.
[3] Liu Yuewen. Forskningsfremskridt om phenylethanoid glycosider iCistanche tubulosa [J]. Moderne landbrugsmaskiner, 2020(11): 60–62.
[4] Tu Pengfei. Genundersøgelse af de urtetekstuelle beviser for Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 2022, 47(20): 5670–5679.
[5] Zhu Su, Teng Shuo, Liu Chun.Puji Fang[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 1959.
[6] Wang Huaiyin.Taiping Shenghui Fang[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 1959.
[7] Tang Shenwei.Chongxiu Zhenghe Jingshi Zhenglei Beiyong Bencao[M]. Beijing: People's Medical Publishing House, 1957.
[8] Zhang Yong, Wu Huan. Historisk udvikling af forarbejdningsmetoder for Cistanches Herba [J].China Journal of Chinese Materia Medica, 1992, 17(4): 213–214.
[9] Cai Hong, Bao Zhong, Jiang Yong. Forarbejdningsteknologi til friskCistanche tubulosa [J]. China Journal of Chinese Materia Medica, 2007, 32(13): 1289–1291.
[10] Tie Xiaoyan, Feng Yinping, Ma Dongni. Effekt af dampbehandling i oprindelsesområdet på kvaliteten af ​​ørkencistanches Herba [J].Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine, 2021, 40(2): 54–56.
[11] Chen Weijun, Jia Cuiyu, Li Lianjiang. Effekter af forskellige behandlingsmetoder på betainindhold i XinjiangCistanche tubulosa [J]. Landbrugsindvindingsmedicin, 2009, 31(5): 400–402.
[12] Zhang Chao, Hua Yue, Lian Jing, et al. Undersøgelse af indholdsvariation规律 af phenylethanoidglycosider under forarbejdning af Cistanches Herba [J].Kinesisk tidsskrift for information om traditionel kinesisk medicin, 2022, 29(4): 92–97.
[13] Wu Chunxing, Yang Yang, Meng Mei, et al. Forskningsstatus og trendanalyse af TCM-fingeraftryk i det sidste årti [J].Journal of Minzu University of China (Natural Sciences Edition), 2024, 33(4): 63–72.
[14] Jiang Yong, Bao Zhong, Sun Yongqiang. Undersøgelse af forarbejdningsteknologi af Cistanches Herba-skiver [J].Chinese Pharmaceutical Journal, 2011, 46(14): 1074–1076.
[15] Zhang Leihong, Du Niansheng, Wang Qing. Bestemmelse af phenylethanoidglykosider i Cistanches Herba totalglykosidkapsler ved UV-spektrofotometri [J].Journal of Xinjiang Medical University, 2002, 25(4): 407–408.
[16] Ailadan·Maimaiti Aili, Yang Ting, Yuan Jie. Ekstraktionsproces og in vitro antioxidantaktivitet af polysaccharider fra rester afCistanche tubulosa [J]. Kvartalsvis kemisk og biokemisk teknik(oversat tidsskriftsnavn baseret på kinesisk), 2020, 37(2): 36–41.
[17] Luo Yan. Optimering af ekstraktionsproces af totale flavonoider fraCistanche tubulosa[D]. Shihezi: Shihezi University, 2015.
[18] Shan Guoshun, Zhao Qimiao, Li Rui, et al. Dynamisk undersøgelse af akteosidindhold under bearbejdning afRehmannia glutinosa [J]. Traditionel medicin i Asien-Stillehavsområdet, 2019, 15(3): 37–39.