Kloning, funktionel identifikation og ekspressionsanalyse af Chalcone Synthase fra Cistanche Tubulosa

Abstrakt: Målsætning

At studere funktionen afchalcone syntase fra Cistanche tubulosaog ekspressionsmønsteret af CtCHS-genet i hvide, røde og lilla blomster.

MetoderCtCHS-genet blev klonet ved RT-PCR, og bioinformatikanalyse blev udført. pET-28a-CtCHS-plasmidet blev overført til Escherichia coli for at inducere proteinekspression af IPTG. Det rekombinante CtCHS-protein blev inkuberet med substraterne p-coumaroyl CoA og malonyl CoA, og produkterne blev påvist ved HPLC og MS. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS-plasmidet blev overført til protoplasten af ​​Arabidopsis thaliana for at observere den subcellulære lokalisering af CtCHS-proteinet. Ekspressionsmønsteret af CtCHS-genet i blomsterne af C. tubulosa med tre farver blev påvist ved qRT-PCR.

ResultaterEt CtCHS-gen blev klonet. Længden af ​​den åbne læseramme (ORF) var 1173 bp, kodende for 390 aminosyrer, og proteinets molekylvægt var 42 8000.

ØKOLOGISK CISTANCHE EKSTRAKT MED 30% ECHINACOSIDE OG 12% ACTEOSIDE

CtCHS indeholdt de katalytiske rester Cys164, His303, Asn336, som var konserveret i chalconsyntase. CtCHS-proteinet blev udtrykt i E. coli og oprenset for at opnå det rekombinante protein. CtCHS-protein kunne katalysere p-coumaroyl CoA og malonyl CoA til at producere naringenin-chalcon. CtCHS-protein var hovedsageligt lokaliseret i cytoplasmaet. CtCHS-genet var stærkt udtrykt i lilla og røde blomster, og de relative ekspressionsniveauer var henholdsvis 8,44 og 3,21 gange højere end i hvide blomster.

Konklusion Et CtCHS-gen blev klonet fra blomsten af ​​C. tubulosa, og protein blev udtrykt. CtCHS-protein har chalcone-syntasefunktion, og ekspressionen af ​​CtCHS-genet er højere i mørkere blomster, hvilket indikerer, at CtCHS-genet kan regulere blomsterfarven på C. tubulosa, hvilket lægger et fundament for yderligere forskning i reguleringsmekanismen for blomsterfarven på C. tubulosa.

Nøgleord: Cistanche tubulosa (Schenk) Wight; chalcone syntase; analyse af enzymaktivitet; subcellulær lokalisering; ekspressionsanalyse

Cistanche Tubulosa(SCHENK) WIGHT er slægten Pyreal-plante, som er naturligt udbredt i det sydlige Xinjiang [1] i Hetian-området i Xinjiang [2]. Pibeblomsterne har høj medicinsk værdi. Dens kødstængler er en af ​​kilderne til 2020-versionen af ​​"Kinesisk farmakopé". [3] Forskningen i pibeblomsterne cordonus kødstængler er steget, men der er relativt få biologisk forskning på dens blomster. Blomstringsperioden for pibeblomsterne er fra april til maj [4], hovedsageligt Der er tre farver hvid , rød og lilla Pibeblomsterne er rige på farver, men deres blomsterfarvereguleringsmekanisme er ikke blevet rapporteret og genetiske faktorer [5] Pigmentet i planteblomster omfatter hovedsageligt tre kategorier: flavonoider, caroten og beetin, det mest udbredte store farveområde [7] som de tre varianter af Paeonia Lactiflora Pall.

Den fremstår som hvid, og farvens hovedfarve indeholder farven på den røde og smukke kompetence gør, at blomsterne er til stede som lilla-røde [8]. Blomsterfarve er et vigtigt træk ved mange prydplanter, og det er også den nøglefaktor, der tiltrækker de lyserøde insekter [9]. Undersøgelser har vist, at det går i arv. Den højeste hyppighed af insektbesøg er den dyb lilla cistancheplante [10]. For biologisk forskning i den syntetiske genetiske forskning af cistanoider i rørblomsten cistanosaurus-blomster er det befordrende for at tydeliggøre rørblomstens cordon-farvekontrolmekanisme, hvilket giver et teoretisk grundlag for at forbedre farven på genteknologisk teknologi, fremme dens rigere farver, øge visningen, udvidelse af anvendelsesområde.

Den biosyntetiske vej afflavonoiderbegynder medphenylpropanoid vej. Phenylalanin omdannes først til kanelsyre under påvirkning af phenylalanin ammonialyase (PAL), og kanelsyre 4-hydroxyleres af kanelsyre. Enzymet (kanelsyre-4-hydroxylase, C4H) og 4-coumaratcoenzym A-ligase (4-coumaratcoenzym A-ligase, 4CL) katalyserer reaktionen til dannelse af 4-coumaroyl-CoA [11]. Et molekyle af 4- coumaroyl-CoA og tre molekyler af malonyl-CoA katalyseres af chalcone syntase (CHS) for at generere naringenin chalcon, som harflavonoidforbindelser.Det grundlæggende skelet af chalcone isomerase, flavanon-3-hydroxylase, dihydroflavonol 4-reduktase osv. genererer en række flavonoider såsom isoflavoner, flavonoler, anthocyaniner osv. [12]. Som et nøgleenzym i flavonoidbiosyntesevejen regulerer CHS indholdet af flavonoider i planter og spiller også en vigtig rolle i reguleringen af ​​planteblomsters farve [13]. For eksempel kan post-transkriptionel gendæmpning af Gentiana scabra Bunge CHS hæmme biosyntesen af ​​anthocyaniner og forårsage specifik blegning af kronblade [14]. CHS-gendæmpning af Actinidia eriantha Benth. CHS reducerer anthocyaninindholdet i kronblade og forårsager Farven på de røde kronblade bliver lysere [15]. Derfor blev et CtCHS-gen i denne undersøgelse klonet fra Cistanche deserticola-blomster, og bioinformatikanalyse, prokaryot ekspression og oprensning, enzymaktivitetsanalyse, subcellulær lokaliseringsanalyse og ekspressionsanalyse i tre blomsterfarver blev udført på det for at udforske funktionen af ​​CtCHS protein og ekspressionsmønsteret af CtCHS-genet blev brugt til foreløbigt at udforske forholdet mellem CtCHS og Cistanche deserticola blomsterfarve, som lagde grundlaget for studiet af reguleringsmekanismen for Cistanche deserticola blomsterfarve.

1 Materialer og instrumenter

1.1 Materialer

Cistanche tuberosa-blomster blev indsamlet fra Yutian County, Hotan Prefecture, Xinjiang i maj 2018. Det tilfældige princip blev fulgt under prøveudtagningen, og Cistanche tuberosa-blomster med god fysiologisk status og ensartet plantehøjde blev udvalgt. Tre stammer af Cistanche deserticola med tre blomsterfarver af hvid, rød og lilla blev taget og identificeret som Cistanche tubulosa (Schenk) Wight af professor Tu Pengfei fra Peking University School of Pharmacy. De blev hurtigt frosset ned i flydende nitrogen, opbevaret på tøris og transporteret til Beijing. E. coli DH5 kemisk kompetente celler blev købt fra Nanjing Novezan Biotechnology Co., Ltd., og E. coli BL21 (DE3) kemisk kompetente celler blev købt fra Beijing Quanshijin Biotechnology Co., Ltd.; pET-28a, pCAMBIA1300-35S-GFP Vektoren blev købt fra Wuhan Transduction Biology Laboratory Co., Ltd. Malonyl-CoA blev købt fra Sigma Company, 4-coumaroyl-CoA, naringenin -chalcone blev købt fra Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., og naringenin blev købt fra Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd.

1.2 Instrumenter

Nanodrop 2000C spektrofotometer (Thermo Fisher Company, USA); gradient PCR-instrument (Eppendorf Company, Tyskland); CFX 96 fluorescens kvantitativt PCR-instrument, UVP-gelimager, gelelektroforeseinstrument, proteinelektroforeseinstrument (BioRad Company, USA) ;EnSpire

Mikropladelæser (PerkinElmer Company, USA); konstant temperatur inkubator (Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.); DHZ-D stor kapacitet fuld-temperatur oscillator (Taicang Experimental Equipment Factory); THZ-82En vandbads konstant temperaturoscillator (Jiangsu Kexi Instrument Co., Ltd.); AIRTECH ultra-ren arbejdsbænk (Suzhou Antai Air Technology Co., Ltd.); højtryksdampsterilisator (TOMY Company, Japan); Milli Q instrument til rent vand (Millipore, USA); LC-20En højeffektiv væskefasekromatograf (Shimadzu Company, Japan); UPLC-Q-Exactive-Orbitrap højopløsnings massespektrometri (Thermo Fisher Company, USA); FV1200 laserkonfokalmikroskop (Olympus Company, Japan).

2 Eksperimentelle metoder

2.1 RNA-ekstraktion og cDNA-syntese. Cistanche deserticola-blomster blev malet i flydende nitrogen og derefter udsat for RNA-ekstraktionsassay.

Total RNA blev ekstraheret ved hjælp af et kit (Norgen, Cat 17200), RNA-koncentrationen og -kvaliteten blev detekteret af NanoDrop 2000C, og RNA-prøver med et A260/A280-forhold mellem 1,8 og 2,1 blev udvalgt til revers transkriptionssyntese af cDNA. M-MLV revers transkriptase (Promega, M170B) blev anvendt til revers-transskribering af det kvalificerede totale RNA til cDNA. De eksperimentelle operationer blev udført i overensstemmelse med instruktionerne.

2.2 Kloning af CtCHS-gen

Baseret på Cistanche deserticola blomst transkriptomdata fra vores forskningsgruppe [16], blev en CtCHS med en komplet åben læseramme screenet ud, og SnapGene software blev brugt til at designe specifikke primere baseret på gensekvensen (tabel 1). PCR-amplifikation blev udført under anvendelse af Cistanche deserticola flower cDNA som skabelon. Amplifikationssystemet var 2×Phanta Max Buffer 25 μL, dNTP Mix (10 mmol/L) 1 μL, opstrøms og nedstrøms primere (10 μmol/L) 2 μL hver, cDNA 2 μL, Phanta Max Super-Fidelity

DNA Polymerase 1 μL, ddH2O 17 μL. Reaktionsbetingelserne var: præ-denaturering ved 95 grader i 3 minutter; 25 cyklusser af denaturering ved 95 grader i 15 s, annealing ved 55 grader i 15 s og forlængelse ved 72 grader i 1 min; og reaktionsforlængelse ved 72 grader i 5 min. PCR-produktet blev påvist ved 1 % agarosegelelektroforese, og DNA-oprensningskittet (Novizan, Cat DC301-01) blev brugt til gelgenvinding, og derefter blev det genvundne DNA oprenset med et hurtigkloningskit (Novizan, Cat) C601-01). DNA-fragmentet blev ligeret med pCE2 TA/Blunt-Zero-vektoren, transformeret ind i Escherichia coli DH5-kompetente celler, og efter dyrkning natten over ved 37 grader blev enkelte klonstammer selekteret og sendt til virksomheden til sekventering.

Tabel 1 Primersekvenser

2.3 Bioinformatikanalyse

Brug ProtParam online software til at analysere proteins fysiske og kemiske egenskaber; brug Prot Scale online værktøj til at analysere protein hydrofilicitet/hydrofobicitet; bruge online værktøj SOPMA til at forudsige protein sekundær struktur; bruge online analysesoftware SWISS-MODEL til at forudsige protein tertiær struktur; brug online software TMHMM Forudsige proteinets transmembranstruktur; bruge DNAMAN-software til at sammenligne homologien af ​​CtCHS med CHS-aminosyresekvenserne for andre arter; brug MEGA-X-software til at konstruere et fylogenetisk træ, ved hjælp af neighbor-joining (NJ) og Poisson-korrektion. Den evolutionære afstand beregnes ved hjælp af Bootstrap-metoden, og antallet af Bootstrap-gentagelser er 1000 gange.

UPLC-Q-Exactive-Orbitrap MS blev brugt til yderligere detektion. Væskefasebetingelserne var Waters Acquity UPLC BEH Sheild RP18 kolonne (100 mm × 3.0 mm, 1,7 μm), kolonnetemperatur 40 grader, naringenin , chalcone og naringenin. Ladningsvolumenet af kontrolstoffet er 4 μL, og ladningsvolumenet af enzymreaktionsproduktet er 7 μL. Vand (A)-acetonitril (B) anvendes som den mobile fase. Elueringsgradienten er: 0 til 5 minutter, 30 % B; 5 til 15 min. 30%-60% B; 15~20 min, 60%~100% B; 20-25 minutter, 100% B; 25~31 min, 100%~30% B. Den volumetriske flowhastighed er 0,3 ml/min. Massespektrometriforholdene er elektrospray-ionkilde, nitrogen som bæregas, kappegastryk 3,5 MPa, hjælpegastryk 1,0 MPa, spraytryk 3500 V, kapillærtemperatur 350 grader, hjælpegasopvarmningstemperatur 200 grader, positive og negative iontilstande, scanning ionområde m/z er 100-1500, fuld MS-opløsning er 35 000, dd-MS2-opløsning er 17 500, (N)

CE/trinnet nce indstillet til 35, 60.

2.6 Subcellulær lokalisering af CtCHS-protein

Baseret på CtCHS-sekvensen og princippet om sømløs kloning blev primere med enzymskæringssteder Kpn Ⅰ og BamH Ⅰ designet, og de tilsvarende målfragmenter blev amplificeret ved PCR. pCAMBIA1300-35S-GFP-plasmidet blev fordøjet med restriktionsendonukleaserne Kpn Ⅰ og BamH Ⅰ, og målfragmentet og vektoren blev forbundet gennem det sømløse kloningskit (Novizan, Cat C115-01) og derefter overført ind i E. coli DH5 kompetente celler. , vælg enkelte klonstammer til sekventering og ekstraher plasmider fra de korrekte stammer. pCAMBIA1300-35S-GFP-CtCHS og pCAMBIA 1300-35S-GFP-plasmiderne blev transformeret til Arabidopsis thaliana-protoplaster under anvendelse af PEG4000 og dyrket under svagt lys i 8 til 10 timer. Den subcellulære lokalisering af CtCHS-protein blev observeret under et konfokalt lasermikroskop.

2.7 CtCHS-ekspressionsmønsteranalyse

Baseret på CtCHS-sekvensen blev DNAMAN brugt til at designe real-time fluorescens kvantitative primere med F-box som det interne referencegen. Primersekvenserne er vist i tabel 1. Den relative ekspression af CtCHS i Cistanche deserticola-blomster af forskellige farver blev påvist ved real-time fluorescens kvantitativ PCR. Brug TransStart Green qPCR SuperMix (fuld guld, AQ101-02) til at måle med SYBR Green fluorescerende farvemetode, reaktionssystem: 2×TransStart Green qPCR SuperMix 5 μL, opstrøms og nedstrøms primere (10

μmol/L) {{0}},2 μL hver, cDNA-skabelon 0,5 μL, nukleotidasefrit vand 4,1 μL, en to-trins metode blev brugt til reaktionen, og reaktionsproceduren var baseret på metoden af Dong Xianjuan et al. [18]. Hver prøve indeholdt 3 biologiske replikater, og eksperimentet blev gentaget tre gange. Eksperimentelle data blev analyseret ved hjælp af Excel til 2

Det relative udtryk for CtCHS blev beregnet ved hjælp af −ΔΔCt-metoden, og GraphPad Prism 8 blev brugt til at udføre signifikansanalyse og tegne histogrammer.