Cistanche Deserticola-ekstrakt øger knogledannelsen i osteoblaster--Del I

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Te-Mao Li^aet a

Abstrakt
Mål Vi undersøgte effekten afCistanchedeserticolaMa. (CD) påknogledannelseaf dyrkede osteoblaster. Metoder Den mineraliserede noduldannelsesanalyse blev brugt til at undersøge in vitro-effekterne af CD(Cistanchedeserticola)påknogledannelse. Alkalisk fosfatase (ALP), knoglemorfogenetiske proteiner (BMP)-2 og osteopontin (OPN) mRNA-ekspression blev analyseret ved kvantitativ realtidspolymerasekædereaktion. Virkningsmekanismen for CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt blev undersøgt under anvendelse af Western blotting. Den in vivo anti-osteoporotiske effekt af CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt blev vurderet i ovarieektomerede mus.
Nøglefund

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt havde ingen effekt på proliferation, migration eller sårheling af dyrkede osteoblaster, men øgede ALP, BMP-2 og OPN mRNA og knoglemineralisering. Mitogen-aktiveret proteinkinase (MAPK) eller nuklear faktor (NF)-kB-hæmmere reducerede CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt-induceretknogledannelseog ALP, BMP-2 og OPN-udtryk. Dog CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt påvirkede ikke osteoklastogenese. Desuden CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt forhindrede knogletab induceret af ovariektomi in vivo.
Konklusioner

CD(Cistanchedeserticola)kan være en romanknogledannelsemiddel til behandling af osteoporose.

Nøgleordknogledannelse; Cistanchedeserticola; kinesiske urter; osteoblaster

Cistanche deserticolaer god tilknogledannelse

Introduktion

Knogle er et komplekst væv sammensat af flere celletyper, der gennemgår en kontinuerlig proces med fornyelse og reparation kaldet 'knogleombygning'. To hovedcelletyper, der er ansvarlige for knogleombygning, er osteoklaster, som resorberer knogler, og osteoblaster, som danner ny knogle. Knogleombygning reguleres af adskillige systemiske hormoner (f.eks. parathyroidhormon, 1, 25-dihydroxy-vitamin D3, kønshormoner og calcitonin) og lokale faktorer (f.eks. nitrogenoxid, prostaglandiner, vækstfaktorer og cytokiner).[1] Osteoporose opstår, når resorption og dannelse af knogle er ukoordineret, og overskydende knoglenedbrydning overstiger knogleopbygningen.[2] Nuværende behandlinger for osteoporose omfatter bisfosfonater, calcitonin og østrogen, som er knogleresorptionshæmmere, der opretholder knoglemasse ved at hæmme osteoklastaktivitet.[3] Imidlertid er virkningen af ​​disse lægemidler til at øge eller genvinde knoglemasse relativt lille, bestemt ikke mere end 2 procent om året.[3] Der er derfor behov for knogleopbyggende midler, såsom teriparatid, der stimulerer nyeknogledannelseog korrigere den ændring i trabekulær mikroarkitektur, der er karakteristisk for etableret osteoporose.[4,5] Fordi nyeknogledannelseer primært en funktion af osteoblasten, midler, der virker ved enten at øge proliferationen af ​​celler fra den osteoblastiske afstamning eller inducere differentiering af osteoblasterne, kan øge knogledannelsen.[5,6]
Selvom mekanismerne for osteoporose forbliver uklare, er de sandsynligvis relateret til den nedsatte tilgængelighed eller virkningerne af knoglevækstfaktorer, såsom knoglemorfogenetiske proteiner (BMP'er).[7] BMP'er, som er strukturelt relateret til den transformerende vækstfaktor-b-superfamilie, blev oprindeligt identificeret ved deres evne til at inducere ektopiskknogle dannelsehos gnavere.[8] BMP'er spiller en vigtig rolle iknogledannelseog knoglecelledifferentiering ved at stimulere alkalisk phosphatase (ALP) aktivitet samt syntesen af ​​proteoglycan, kollagen og osteopontin (OPN).[9] En nylig undersøgelse fandt en sammenhæng mellem osteoporose og specifikke polymorfier i BMP-2-, ALP- og OPN-generne, hvilket tyder på, at de er forbundet med udviklingen af ​​osteoporose.[10]

CistanchedeserticolaMa. (Orobanchaceae; forkortet som CD)(Cistanchedeserticola)er en hjemmehørende urt i Kina og er meget brugt i traditionel medicin som et terapeutisk middel på grund af dets beroligende, smertestillende og immunstimulerende egenskaber.[11] Moderne farmakologiske undersøgelser har vist, at CD(Cistanchedeserticola)ekstrakter kan stimulere immunitet,[12] opfange frie radikaler[13] og øge aktiviteten af ​​superoxiddismutase.[14] Anti-inflammatoriske og antioxidante midler har potentialet til at behandle osteoporose ved at øgeknogle dannelseog/eller undertrykke knogleresorption.[15,16] Men effekten af ​​CD(Cistanchedeserticola)på knoglecellefunktionen er endnu ikke fastlagt. Her rapporterer vi den cd(Cistanchedeserticola)ekstrakt påvirkede ikke proliferation, migration eller sårhelingsaktivitet af dyrkede osteoblaster, men øgede ALP, BMP-2 og OPN-ekspression og knoglemineralisering. Derudover viser vi, at den mitogen-aktiverede proteinkinase (MAPK) og nuklear faktor (NF)-kB signalveje kan være involveret i den CD-medierede stigning i genekspression og knoglemineralisering. Derimod CD'en(Cistanchedeserticola)ekstrakt undertrykte ikke osteoklastogenese in vitro. Især behandling af mus med CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt forhindrede knogletab induceret af ovariektomi in vivo. Vores data tyder derfor på, at CD(Cistanchedeserticola)kan bruges til at stimulereknogledannelsetil behandling af osteoporose.

Cistanche deserticolaøge immuniteten

Materialer og metoder

Cistanche deserticola ekstrakt og materialer

CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt blev købt fra Chuang Song-Zong Pharmaceutical Company (Kaohsiung, Taiwan). Ekstraktion og isolering af CD(Cistanchedeserticola)blev fulgt som tidligere beskrevet (på grundlag af spektrale data har de identificeret den kemiske sammensætning, herunder beta-sitosterol, daucosterol, ravsyre, triacontanol, acteosid, betain og polysaccharid).[17] Kanin polyklonale antistoffer, der er specifikke for p-ekstracellulære signalregulerede kinaser (ERK), ERK, p-p38, p38, pc-Jun N-terminale kinaser (JNK), JNK, p-p65 og p65 blev købt fra Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, USA). Osteocalcin ELISA-kittet blev købt fra Biosource Technology (Nivelles, Belgien). De C-terminale telopeptider af type-I collagen ELISA kittet blev opnået fra Cross Laps (Herlev, Danmark). Den p38 dominant-negative mutant blev leveret af Dr. J. Han (South-Western Medical Center, Dallas, USA). Den JNK dominant-negative mutant blev leveret af Dr. M. Karin (University of California, San Diego, USA). Den dominant-negative ERK2-mutant blev leveret af Dr. M. Cobb (South-Western Medical Center). Alle andre reagenser blev opnået fra Sigma-Aldrich (St. Louis, USA).

Cellekultur

Den murine osteoblastcellelinje MC3T3-E1 blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC; Rockville, USA). Celler blev dyrket i 95 procent luft, 5 procent CO2 med a-MEM, der blev suppleret med 20 mm HEPES og 10 procent varme-inaktiveret føtalt kalveserum, 2 mm-glutamin, penicillin (100 U/ml) og streptomycin (100 mg) /ml).

Måling af mineraliseret knudedannelse

Mineraliseret knudedannelse blev evalueret som beskrevet.[18] Kort fortalt blev osteoblaster dyrket i et medium indeholdende vitamin C (50 mg/ml) og b-glycerophosphat (10 mm) i to uger, og mediet blev skiftet hver tredje dag. Efter inkubation med CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt i 12 dage, celler blev vasket to gange med 20 mm Tris-bufret saltvand indeholdende 0,15 m NaCl (pH 7,4), fikseret i iskold 75 procent (v/v) ethanol i 30 minutter, og luft- tørret. Calciumaflejring blev bestemt under anvendelse af alizarin red-S-farvning. Kort fortalt blev ethanol-fikserede celler og matrix farvet i 1 time med 40 mm alizarin red-S (pH 4,2) og skyllet grundigt med vand. Den bundne farve blev elueret med 10% (vægt/volumen) cetylpyridiniumchlorid og alizarin red-S i prøverne blev kvantificeret ved at måle absorbans ved 550 nm og sammenlignet med en standardkurve. Et mol alizarin red-S binder selektivt ca. to mol calcium.

Cistanche deserticolaer god tilknogledannelse

Kvantitativ polymerasekædereaktion i realtid

Total RNA blev ekstraheret fra osteoblaster under anvendelse af et TRIzol-kit (MDBio Inc., Taipei, Taiwan). Omvendt transkription blev udført under anvendelse af 2 mg total RNA og en oligo(dT) primer.[19,20] Kvantitativ real-time polymerase kædereaktion (qPCR) blev udført ved hjælp af TaqMan® et-trins PCR Master Mix (Applied Biosystems, Carlsbad, USA). Total cDNA blev tilsat (100 ng pr. 25-ml reaktion) med sekvensspecifikke primere og Taqman®-prober. Alle målgenprimere og prober blev købt kommercielt, inklusive b-actin som en intern kontrol (Applied Biosystems). qPCR-assays blev udført i tre eksemplarer på et StepOnePlus-sekvensdetektionssystem (Applied Biosystems). Cyklusbetingelserne var 10-min. polymeraseaktivering ved 95 grader efterfulgt af 40 cyklusser på 95 grader i 15 sekunder og 60 grader i 60 sekunder. Tærsklen blev sat over ikke-skabelonkontrolbaggrunden og inden for den lineære fase af målgenamplifikation for at beregne cyklusnummeret, ved hvilket transkriptet blev detekteret (betegnet CT).

Western blot analyse

Cellelysater blev fremstillet som beskrevet tidligere. [21,22] Proteiner blev opløst ved SDS-PAGE og overført til Immobilon polyvinyldifluoridmembraner (Millipore, Billerica, USA). Blottene blev blokeret med 4 procent bovint serumalbumin i 1 time ved stuetemperatur og derefter probet med kanin-anti-humane antistoffer mod p-65 eller p-p65 (1:1000) i 1 time ved stuetemperatur. Efter tre vaske blev blottene inkuberet med peroxidase-konjugeret æsel-anti-kanin sekundært antistof (1:1000) i 1 time ved stuetemperatur. Blottene blev visualiseret ved forstærket kemiluminescens under anvendelse af X-OMAT LS-film (Eastman Kodak, Rochester, USA).

Ovariektomi-induceret osteoporose

ICR-hunmus, fire uger gamle, 22~28 g, blev brugt til denne undersøgelse. Mus blev ovariektomiseret bilateralt under trichloracetaldehyd (100 mg/kg) bedøvelse, og kontrolmus blev sham-opereret (Sham) til sammenligning. Knoglemineraldensitet og knoglemineralindhold blev målt efter oral administration af forskellige koncentrationer af CD(Cistanchedeserticola)ekstraher hver anden dag i fire uger. Kroppens samlede knoglemineraltæthed og knoglemineralindhold blev bestemt ved hjælp af et dobbeltenergi røntgenabsorptiometer (DEXA; XR-26; Norland, Fort Atkinson, USA) ved hjælp af en tilstand for små forsøgspersoner som beskrevet tidligere.[18, 23] Alle protokoller overholdt institutionelle retningslinjer og blev godkendt af Animal Care Committee of China Medical University.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført ved hjælp af Prism 4.01-software. (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). De angivne værdier er middel SEM. Statistisk analyse mellem to prøver blev udført under anvendelse af Student's t-test. Statistiske sammenligninger af mere end to grupper blev udført ved hjælp af en envejs-variansanalyse med Bonferronis posthoc-test. I alle tilfælde blev P < 0,05="" betragtet="" som="">

Cistanche deserticolaer god tilknogledannelse

Resultater

Cistanche deserticolaekstrakt øger knoglemineralisering af osteoblaster Tilføjelse af CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt i 24 eller 48 timer påvirkede ikke proliferationen af ​​museosteoblast MC3T3-E1-celler i et MTT-assay (data ikke vist). Fordi osteoblastdifferentiering er en kompleks proces, der involverer celleproliferation og migration, testede vi også MC3T3-E1-cellers migrationsevne efter behandling med CD(Cistanchedeserticola)uddrag. Ved at bruge Transwell og sårhelingsassays fandt vi den CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt påvirkede ikke osteoblastmigrering (data ikke vist). Dannelsen af ​​mineraliserede knuder er en af ​​markørerne for osteoblastmodning. Alizarin rød S-farvning viste, at mineraliserede knuder dannedes, når osteoblaster blev dyrket i to uger i et medium indeholdende vitamin C (50 ug/ml) og -glycerofosfat (10 mm), den koncentrationsafhængige måde ved tilsætning af CD(Cistanchedeserticola)(Figur 1a). Derfor CD(Cistanchedeserticola)ekstraherer induceret knogleknudedannelse af dyrkede osteoblaster, men ikke deres proliferation eller migration. Vi undersøgte også CD'ens rolle(Cistanchedeserticola)ekstrakt i RANKL-induceret osteoklastogenese, men fandt ingen effekt (data ikke vist).

Cistanche deserticola-ekstrakt øger alkalisk fosfatase, knoglemorfogenetisk protein-2 og osteopontin-ekspression i dyrkede osteoblaster

Differentierede osteoblaster udviser forhøjet ALP-aktivitet, som korrelerer med høje niveauer af enzymekspression.[18] Vi fandt den behandling med CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt i 72 timer øgede signifikant osteoblast ALP-aktivitet (figur 1b). I betragtning af den afgørende rolle, som BMP-2, ALP og OPN spiller i osteoblastdifferentiering, testede vi, om CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt udøver sin effekt på osteoblastdifferentiering ved at regulere BMP-2-, ALP- og OPN-ekspression. Behandling af celler med CD(Cistanchedeserticola)ekstrakter øget mRNA-ekspression af ALP, BMP-2 og OPN på en koncentrationsafhængig måde (figur 1c), hvilket viser, at CD(Cistanchedeserticola)ekstraherer induceret differentiering af osteoblaster ved at opregulere ALP-, BMP--2- og OPN-ekspression.

Cistanche deserticola ekstrakt øger knogleknudedannelse gennem mitogenaktiveret proteinkinasevej

Det er blevet rapporteret, at MAPK spiller en vigtig rolle iknogledannelse[24,25] så vi undersøgte derefter, om denne signalvej er involveret i CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt-induceret knoglemineralisering. Forbehandling af celler med ERK-hæmmer U0126, p38-hæmmer SB203580 eller JNK-hæmmer SP600125 reduceret CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt-øget knoglemineralisering (figur 2a, 3a og 4a). Desuden blokerede inhibitorerne også CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt-induceret ALP-, BMP-2- og OPN-ekspression (figur 2b-4c). Transfektion af celler med ERK2, p38 eller JNK mutant reduceret CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt-stigning i ALP-, BMP-2- og OPN-mRNA-ekspression (figur 2c, 3c og 4c). Dernæst undersøgte vi direkte ERK-, p38- og JNK-aktiveringen efter CD(Cistanchedeserticola)ekstraktbehandling. Inkubation af celler med CD(Cistanchedeserticola)ekstraktinduceret ERK-, p38- og JNK-phosphorylering (figur 2d, 3d og 4d). Derfor medierer ERK, p38 og JNK den øgedeknogledannelseinduceret af CD(Cistanchedeserticola)behandling af osteoblaster.

Cistanche deserticola-ekstrakt øger knogleknogledannelsen gennem nuklear faktor-kB-vejen

Som tidligere nævnt er NF-kB aktivering nødvendig forknogledannelse.[26,27] Vi behandlede derefter osteoblaster med NF-kB-hæmmerne pyrrolidin-dithiocarbamat (PDTC) og N-tosyl-L-phenylalanin-chlormethylketon (TPCK) blev købt fra Calbiochem (Darmstadt, Tyskland) for at bestemme, om NF-kB-aktivering er involveret i CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt-induceret knoglemineralisering. Figur 5a viser, at forbehandling af osteoblaster med PDTC eller TPCK hæmmede CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt-induceret knogleknudedannelse og reducerede også stigningen i ALP, BMP-2 og OPN-ekspression (figur 5b og 5c). Fosforylering af NF-kB p65-underenheden er en indikator for NF-kB-aktivering;[28] i overensstemmelse hermed fandt vi, at CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt øget p65-phosphorylering i osteoblasterne (figur 5d). Disse resultater indikerede, at NF-kB-aktivering er vigtig for CD-ekstrakt-induceret ALP, BMP-2 og OPN-ekspression og knogleknudedannelse.

Figur 4 Involvering af c-Jun N-terminale kinaser (JNK) iCistanchedeserticola(CD) ekstrakt-induceret knoglemineralisering i osteoblaster. (a) Celler blev udpladet i 24-brøndsplader og dyrket i et medium indeholdende vitamin C (50 mg/ml) og b-glycerophosphat (10 mM) i to uger. Cellerne blev samtidig behandlet med CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt (26 mg/ml) plus SP600125 (3 mM). Den mineraliserede knudedannelse blev vurderet ved alizarin red-S farvning (n=5). (b, c) Celler blev forbehandlet med SP600125 i 30 minutter eller transficeret med JNK-mutant eller 24 timer efterfulgt af stimulering med CD-ekstrakt og alkalisk phosphatase (ALP) aktivitet og ALP, knoglemorfogenetisk protein (BMP)-2 og osteopontin (OPN) mRNA-ekspression blev målt ved ALP-kit og kvantitativ real-time polymerasekædereaktion. (d) Celler blev behandlet med CD-ekstrakt i angivne tidsintervaller, og p-JNK-ekspression blev undersøgt ved Western blotting. *P< 0.05,="" compared="" with="" control="" group;="">< 0.05,="" compared="" with="" cd="">(Cistanchedeserticola)ekstraktbehandlet gruppe.

Hæmning af knogletab af Cistanche deserticola-ekstrakt i ovariektomiserede mus

For at undersøge effekten af ​​CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt ved knogletab, blev osteoporose induceret hos hunmus ved ovariektomi. Som forventet udviste ovariektomerede mus nedsat total kropsknoglemineraltæthed og knoglemineralindhold (figur 6a og 6b). Behandling med CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt i fire uger hæmmede tabet af knoglemineraltæthed og knoglemineralindhold på en dosisafhængig måde (figur 6a og 6b). Blodkoncentrationer af ALP kan afspejle den osteoblastiske aktivitet.[29] Som vist i figur 6c, CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt hæmmede faldet i serum-ALP-aktivitet induceret af ovariektomi. Desuden CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt øgede også niveauet af osteocalcin, en markør forknogledannelseog reducerede niveauet af C-terminale telopeptider af type-I collagen, en markør for knogleresorption (figur 6d og 6e). Disse resultater understøtter således styrken og effektiviteten af ​​CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt for at forhindre knogletab in vivo.

Figur 6 Hæmning af ovariektomi-induceret faldet i knoglemineraltæthed og knoglemineralindhold vha.Cistanchedeserticola(CD) ekstrakt. ICR-hunmus fik en simuleret operation eller blev ovariektomiseret. Ovariektomiserede mus blev behandlet med de angivne koncentrationer af CD(Cistanchedeserticola)ekstrakt ved oral fodring. Kroppens samlede knoglemineraltæthed (a), knoglemineralindhold (b), serum alkalisk phosphatase (ALP) aktivitet (c), serum osteocalcin (d) og serum C-terminale telopeptider af type I kollagen (e), blev bestemt fire uger efter operationen. Data præsenteres som middel SE, n=8–10 mus/gruppe. *P < 0.05,="" sammenlignet="" med="" sham;="" #p="">< 0,05="" sammenlignet="" med="" ovariektomiseret="">

DISKUSSION

Klik her for information om del II (Diskussion og konklusion) af denne artikel.

Fra: 'Cistanchedeserticolaekstrakt stigerknogledannelsei osteoblaster' vedTe-Mao Li^aet al

---© 2012 Forfatterne. JPP © 2012 Royal Pharmaceutical Society 2012Tidsskrift for farmaci og farmakologi, 64, s. 897-907