Cistanche Tubulosa Phenylethanoid Glycosider inducerer apoptose i H22 hepatocellulære karcinomceller gennem både ydre og indre signalveje

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Pengfei Yuan, Jinyu Li, Adila Aipire, Yi Yang, Lijie Xia, Xinhui Wang, Yijie Li og Jinyao Li

Abstrakt

Baggrund:Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight er en traditionel kinesisk medicin, der parasitterer Tamarix-plantens rødder og er blevet brugt til at behandle mandlig impotens, sterilitet, kropssvaghed og som tonic. Imidlertid er dens antitumorvirkning på hepatocellulært karcinom stadig uhåndgribelig. Her undersøgte vi antitumoreffekten afC. tubulosa phenylethanoid glycosider(CTPG) på H22 hepatocellulære carcinomceller både in vitro og in vivo og dets mekanismer. Metoder: H22-cellers morfologi, levedygtighed, apoptose, cellecyklus og mitokondrielle membranpotentiale (Δψm) blev analyseret ved henholdsvis inverteret mikroskopi, MTT-assay og flowcytometri. Ekspressionen og aktiveringen af ​​proteiner i apoptosevejen blev påvist ved Western blot. In vivo antitumoreffekten blev evalueret i en tumormusemodel etableret under anvendelse af han-Kunming-mus. Resultater: CTPG-behandling undertrykte signifikant H22-cellevækst på en dosis- og tidsafhængig måde, hvilket var korreleret med den øgede apoptose og cellecyklusstop ved G0/G1- og G2/M-faser. Desuden blev kromosomal kondensation observeret i CTPG-behandlede H22-celler. CTPG-behandling øgede signifikant Bax/Bcl-2-forholdet, reducerede Δψm og øgede frigivelsen af ​​cytochrom c. Niveauerne af spaltet caspase-8 og caspase-9 i både ydre og indre signalveje blev signifikant øget, som sekventielt aktiverede caspase-7 og -3 for at spalte PARP. Endelig, CTPG (Cistanchetubulosaphenylethanoid glycosider) hæmmede væksten af ​​H22-celler i mus og forbedrede overlevelsesraten for tumormus. Konklusioner: Disse resultater antydede, at CTPG undertrykte H22-cellevækst gennem både ydre og indre apoptoseveje.

Baggrund

Leverkræft rangeret som sjette for kræftforekomst og fjerde for kræftdødsfald på verdensplan. Desuden rangerede den på fjerdepladsen for kræftforekomst og først for kræftdødelighed i lande med lavt sociodemografisk indeks [1]. I Kina er leverkræft den tredje hyppigste årsag til kræftrelaterede dødsfald i 2015 [2]. Mere end 90 procent af primær leverkræft er hepatocellulært karcinom (HCC) i verden [3]. I øjeblikket er leverresektion den vigtigste mulighed for behandling af HCC. Mindre end 30 procent af patienterne med HCC opfyldte imidlertid kriterierne for helbredende leverresektion, og den samlede 5-års overlevelsesrate er stadig så lav som 35-50 procent på grund af den høje recidivrate [4, 5 ]. Tilgængeligheden af ​​behandlingsmuligheder for patienter med middel til fremskreden HCC er meget begrænset. Sorafenib, et molekylært målrettet lægemiddel, er blevet godkendt af FDA som førstelinjebehandling til avanceret HCC. Sorafenib forlænger dog kun omkring 3 måneders overlevelse, og responsraten er mindre end 4 procent [6, 7]. Det haster med at udvikle nye lægemidler eller strategier mod HCC. Traditionel kinesisk medicin (TCM) alene eller kombineret med andre strategier er blevet brugt til at behandle HCC og har vist de kliniske fordele, herunder forlænget overlevelsestid, forbedret livskvalitet, reducerede bivirkninger og så videre [8, 9].Cistanche, en slags TCM, har forskellige biologiske funktioner, som f.eksanti-oxidation, anti-inflammation, anti-aging,og neurobeskyttelse [10, 11]. Phenylethanoid glycosider er blevet betragtet som de vigtigste aktive komponenter iCistanche, som har forskellige aktiviteter, herunder antioxidation, anti-inflammation, hepatobeskyttelse og neurobeskyttelse [12-15]. Vores gruppe har rapporteret detCistanche tubulosa phenylethanoid glycosider(CTPG) kunne inducere apoptose i melanom B16-F10-celler og hæmme væksten af ​​tumorer i mus [16]. I denne undersøgelse målte vi antitumoreffekten af ​​CTPG på HCC H22-celler både in vitro og in vivo og undersøgte dets mekanismer. Vi fandt ud af, at CTPG inducerede apoptose i H22-celler gennem både ydre og indre signalveje og undertrykte væksten af ​​H22-tumorer i mus.

Metoder

Cellelinje

Muse H22 hepatocellulære carcinomceller blev opnået fra Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Xinjiang University (Urumqi, Xinjiang, Kina) og dyrket i RPMI 1640 medium (Gibco) suppleret med 100 U/ml penicillin og 100 ug/ml streptomycin, og 10 procent varmeinaktiveret føtalt bovint serum (Gibco) ved 37 grader i en befugtet atmosfære på 5 procent CO2.

MTT assay

CTPG blev købt fra Hetian Dichen Biotech Co., Ltd. (Hetian, Xinjiang, Kina), og de vigtigste forbindelser af CTPG blev kvalificeret og kvantificeret ved højtydende væskekromatografi [16]. Cellelevedygtighed blev evalueret af 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) (Sigma, St. Louis, MO, USA , USA) assay. H22-celler blev inokuleret i 96-brøndsplader med en tæthed på 2 × 104 celler i 100 ul medium pr. brønd og dyrket ved 37 grader. Efter 24 timer blev celler behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG (0, 100, 200, 300 og 400 ug/ml) eller 0,3 procent DMSO (svarende til det i 400 ug/ml CTPG) i henholdsvis 24, 48 og 72 timer . Efter centrifugering ved 1000 rpm i 7 minutter blev supernatanten kasseret, og 100 µl MTT-opløsning (5 mg/ml i PBS) blev tilsat til hver brønd. Pladerne blev inkuberet ved 37 grader i 4 timer, og 100 µl DMSO blev tilsat for at opløse de dannede formazankrystaller. OD490-værdierne blev detekteret af en 96--brønds mikropladelæser (Bio-Rad Laboratories, CA, USA). Cellelevedygtigheden blev beregnet efter formlen: Cellelevedygtighed (procent)=(ODbehandlet/ODubehandlet) × 100 procent.

Påvisning af apoptose

H22-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG (0, 100, 200, 300 og 400 ug/ml) eller 0,3 procent DMSO i 24 timer og derefter farvet med Annexin V FITC/ Propidiumiodid (PI) Apoptose Detection Kit (YEASEN, Kina) i henhold til producentens instruktioner. Prøver blev analyseret ved flowcytometri (BD FACSCalibur, USA).

Påvisning af mitokondriemembranpotentiale

H22-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG (0, 200 og 400 ug/ml) i 24 timer og derefter farvet med det membranpermeable JC-1-farvestof (Beyotime, Kina) i 20 timer min ved 37 grader. Efter vask to gange med JC-1-buffer blev prøverne resuspenderet med 300 ul JC-1-buffer og analyseret ved flowcytometri (BD FACSCalibur, USA).

Analyse af cellecyklus

H22-celler blev inokuleret i 60 mm kulturskåle og behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG (0, 100, 200, 300 og 400 ug/ml) eller 0,3 procent DMSO for 24 timer. Alle celler blev opsamlet og vasket to gange med PBS. Celler blev fikseret i 70 procent iskold ethanol ved -20 grader i 2 timer og vasket to gange med PBS, derefter resuspenderet i 300 ul Propidiumiodid/RNase-farvningsbuffer (BD Biosciences). Efter 10 minutter ved stuetemperatur blev prøver opsamlet ved flowcytometri (BD FACSCalibur, USA), og cellecyklusfordeling blev analyseret med ModFit LT 3.0-softwaren.

Hoechst 33.258 farvning

De morfologiske ændringer af H22-cellekerner blev analyseret ved membranpermeabelt DNA-bindende farvestof Hoechst 33.258-farvning. H22-celler blev podet i en 6-brøndplade i koncentrationen på 1 x 105 celler/brønd i et 2 ml medium. Efter 60 % ~ 70 % konfluens blev cellerne behandlet med CTPG (0, 100, 200, 300 og 400 ug/ml) i 24 timer. Cellerne blev opsamlet og fikseret med 4 procent iskold Paraformaldehyd ved 4 grader i 10 min. Efter vask med PBS blev celler farvet med Hoechst 33.258 (Beyotime, Kina) ved 4 grader i 10 minutter. Prøver blev observeret med et inverteret fluorescensmikroskop (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).

Western blot

Anti-caspase-3, anti-spaltet caspase-3, Anti-Bcl-2 og anti-Bax blev købt fra Beyotime Biotech Co., Ltd. (Shanghai, Kina). Anti-caspase-7, anti-spaltet-caspase-7, anti-caspase-8, anti-spaltet-caspase-8, anti-caspase-9, anti-caspase -spaltet-caspase-9, anti-PARP, anti-spaltet PARP, anti-muse IgG-HRP og anti-kanin IgG-HRP blev købt fra Cell Signaling Technology. Anti- -aktin blev købt fra Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Beijing, Kina).

H22-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG (0, 100, 200, 300 og 400 ug/ml) eller 0,3 procent DMSO i 24 timer. Celler blev opsamlet og lyseret med Cell Lysis Solution RIPA (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) i 30 minutter på is. Prøver blev centrifugeret ned (12,000 g i 15 minutter ved 4 grader) for at opsamle supernatanterne, og proteinkoncentrationerne blev målt med BCA-kit (Thermo Fisher Scientific, USA). En lige stor mængde protein i hver prøve blev isoleret med 12 procent SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner (Biosharp, Kina). Efter blokering med TBST-buffer indeholdt 5 procent fedtfri mælk, blev membraner inkuberet med henholdsvis tilsvarende primære antistoffer og sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase (HRP). Efter vask med TBST blev målproteinerne detekteret ved hjælp af ECL assay kit (Beyotime, Kina).

Dyr og etikerklæring

6-8 uger gamle Kunming-hanmus blev købt fra Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kina). Mus blev holdt i en standard temperatur-kontrolleret, lys-cyklus dyrefacilitet ved Xinjiang University. Alle dyreforsøg blev udført i henhold til retningslinjerne fra Animal Care and Use Committee ved Xinjiang University. Protokollen blev godkendt af Udvalget for Etik af Dyreforsøg ved Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering (BRGE-AE001), Xinjiang University.

Tumor mus undersøgelse

Til induktion af tumormusemodel blev Kunming-hanmus injiceret subkutant med 1 × 106 H22-celler i 100 ul PBS i højre flanke. Efter 3 dage blev mus tilfældigt opdelt i 3 grupper (7 mus/gruppe). Kontrolgruppen blev injiceret med 0,1 ml DMSO subkutant omkring tumoren. CTPG-200- og CTPG{10}}-grupper blev subkutant injiceret med 200 eller 400 mg/kg CTPG i 0,1 ml DMSO omkring tumoren. Mus blev behandlet hver anden dag i op til 21 dage. Tumorstørrelser blev målt ved hjælp af skydelære op til 25 dage, og tumorvolumen blev beregnet i henhold til formlen: tumorvolumen (mm3)=(længde×bredde2)/2. Efter 25 dage blev overlevelsen af ​​tumormus overvåget hver dag indtil afslutningen af ​​denne undersøgelse.

Statistisk analyse

Statistisk signifikans blev beregnet ved envejsanalyse af varians blandt behandlings- og kontrolgrupperne. Alle data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (SD). p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="">

Resultater

CTPG reducerede levedygtigheden af ​​H22-celler in vitro

For at udforske antitumoreffekten af ​​CTPG på HCC blev H22-celler behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG (0, 100, 200, 300 og 400 ug/ml) in vitro. Efter 24 timer blev morfologien af ​​H22-celler observeret under anvendelse af et omvendt mikroskop. Vi fandt ud af, at morfologien af ​​H22-celler blev dramatisk ændret ved CTPG-behandling. Med stigende CTPG-koncentration blev cellerne små og runde, og celleantallet blev også stærkt reduceret (fig. 1a). MTT-assay blev brugt til at analysere levedygtigheden af ​​H22-celler efter CTPG-behandling i henholdsvis 24, 48 og 72 timer. CTPG reducerede signifikant H22-cellernes levedygtighed på en dosisafhængig og tidsafhængig måde (fig. 1b). CTPG ved 300 ug/ml nåede frem til den bedste inhiberende hastighed (fig. 1c). Værdierne af IC50 af CTPG for H22-celler er 236 ug/ml ved 24 timer og 169,8 ug/ml ved 48 timer.

CTPG inducerede apoptose i H22-celler

For at undersøge, om den nedsatte levedygtighed af H22-celler er medieret af induktion af apoptose, blev H22-celler behandlet med forskellige koncentrationer af CTPG (0, 100, 200, 300 og 400 ug/ml) i 24 timer og farvet med PI og Annexin V. Flowcytometriresultaterne viste, at CTPG signifikant inducerede apoptose af H22-celler (herunder tidlig og sen apoptose) på en dosisafhængig måde (fig. 2a). Selvom den høje dosis af CTPG også signifikant øgede nekrose af H22-celler, spiller nekrose en mindre rolle i hæmningen af ​​H22-cellevækst på grund af dens lavere andel (8,3 procent) sammenlignet med apoptose (52,6 procent). Yderligere blev totale proteiner af H22-celler isoleret efter CTPG-behandling, og ekspressionerne af anti-apoptotisk B-celle lymfom 2 (Bcl-2) og pro-apoptotisk BCL-2-associeret X-protein (Bax) blev påvist af Western blot. Gråtonescanningsdata viste, at ekspressionsniveauerne for Bax og Bcl-2 blev henholdsvis øget og reduceret. Bax/Bcl-2-forholdet blev signifikant forøget (fig. 2b). Disse resultater tyder på, at CTPG inducerer apoptose i H22-celler.

CTPG inducerer kromosomal kondensation og cellecyklusstop i H22-celler

Det er blevet rapporteret, at DNA-beskadigelse og cellecyklusstop induceret af lægemidler kan hæmme tumorcellevækst og forårsage apoptose i tumorceller [17, 18]. For at detektere morfologien af ​​kerner i H22-celler efter CTPG-behandling i 24 timer blev H22-celler farvet af Hoechst 33.342 og observeret ved hjælp af inverteret fluorescerende mikroskopi. CTPG-behandlede celler viste en dosisafhængig stigning af klart kondenseret kromatin af kerner, mens de ubehandlede celler viste homogent farvede kerner (fig. 3a). Cellecyklusfordeling i H22-celler blev yderligere analyseret ved PI-farvning efter CTPG-behandling i 24 timer. Som vist i fig. 3b øgede CTPG-behandling signifikant andelen af ​​G0/G1-- og G2/M-faseceller og reducerede signifikant andelen af ​​S-faseceller, hvilket tyder på, at CTPG inducerede G 0/G1 og G2/M fasestop i H22-celler. Den høje dosis af CTPG øgede også signifikant andelen af ​​sub G1-celler.

CTPG reducerede mitokondrielle membranpotentiale og øgede frigivelsen af ​​cytochrom c

Mitokondrieafhængig vej spiller en vigtig rolle i induktionen af ​​apoptose [19, 20]. Ændringerne af mitokondrielt membranpotentiale (Δψm) kan overvåges ved JC-1-farvning på grund af JC-1-aggregat (rød fluorescens) kan desintegrere til monomer (grøn fluorescens) med reduktion af Δψm [21]. Efter CTPG-behandling i 24 timer blev H22-celler farvet med JC- 1 farvestof. Flowcytometridataene viste, at den røde fluorescens i FL-2-kanalen og den grønne fluorescens i FL-1-kanalen var signifikant reduceret og øget ved CTPG-behandling. Andelen af ​​PE-FITC plus-celler blev signifikant forøget (fig. 4a), hvilket tyder på, at CTPG reducerede Δψm i H22-celler. Dette stemmer overens med det øgede Bax/Bcl-2-forhold. Som følge heraf observerede vi, at frigivelsen af ​​cytochrom c var signifikant øget efter CTPG-behandling (fig. 4b). Disse resultater indikerede, at CTPG delvist kunne inducere apoptose i H22-celler via en mitokondrieafhængig (iboende) vej.

CTPG aktiverede caspase-vejen og forhindrede DNA-reparation

Dernæst blev aktiveringen af ​​caspase induceret af CTPG via både ydre og indre signalveje analyseret. Efter CTPG-behandling i 24 timer blev totale proteiner isoleret fra H22-celler, og niveauerne af pro- og spaltede caspaser blev påvist ved Western blot. Sammenlignet med den ubehandlede eller DMSO-kontrollen opregulerede CTPG-behandling signifikant ikke kun niveauet af spaltet caspase-8 (ekstrinsisk vej), men også niveauet af spaltet caspase-9 (intrinsisk vej) (fig. 5). Sekventielt spaltede aktiveret caspase-8 og -9 den nedstrøms pro-caspase-3 og -7, der blev observeret i fig. 5. Aktiveret caspase-3 spaltede DNA'et reparationsenzym af poly (ADP-ribose) polymerase (PARP) for at forhindre DNA-reparation og akkumulere DNA-skade som observeret i fig. 3a.

Disse resultater indikerede, at CTPG inducerede apoptose i H22-celler gennem både ydre og indre signalveje.

CTPG undertrykker væksten af ​​H22 HCC in vivo og forbedrer overlevelsesraten for tumormus

Endelig blev antitumoreffekten af ​​CTPG på HCC evalueret i en tumormusemodel, som blev etableret ved subkutan injektion af H22-celler. Efter 3 dages H22-celle-injektion blev tumormus behandlet med CTPG 8 gange. Kropsvægten af ​​mus og tumorstørrelser blev overvåget på angivne tidspunkter. Som vist i fig. 6a har kropsvægten af ​​mus i hver gruppe ingen signifikant forskel, hvilket tyder på, at de udvalgte doser af CTPG ikke har nogen åbenlyse bivirkninger. Interessant nok blev tumorvæksten hos mus behandlet med både 200 mg/kg og 400 mg/kg CTPG signifikant hæmmet (fig. 6b). Desuden forbedrede de to doser af CTPG-behandling i høj grad overlevelsen af ​​tumormus (3/7, 3/7) sammenlignet med kontrolgruppen (0/7) ved afslutningen af ​​eksperimentet (fig. 6b). Vi fandt også, at CTPG signifikant forbedrede proliferationen af ​​splenocytter isoleret fra han-Kunming-mus på en dosisafhængig måde (fig. 6c), hvilket tyder på, at CTPG har en immunstimulerende virkning.

Diskussion

TCM har været brugt til at behandle forskellige sygdomme, herunder kræftformer i en lang historie. Det er blevet rapporteret, at TCM kan inducere apoptose i forskellige typer tumorceller gennem både ydre (dødsreceptormedieret) og indre (mitokondrierafhængige) signalveje for at udøve antitumoreffekter [22-25]. De to veje kan aktivere henholdsvis caspase-8 og -9 [24, 26]. Her fandt vi, at CTPG signifikant undertrykte H22-cellevækst gennem induktion af apoptose og cellecyklusstandsning. Niveauerne af spaltet caspase-8 og -9 blev signifikant opreguleret af CTPG-behandling, hvilket tyder på, at både ydre og indre signalveje var involveret i induktionen af ​​apoptose. Vores tidligere undersøgelse viste, at CTPG inducerede apoptose i melanom B16-F10-celler via den mitokondrieafhængige vej, der øgede niveauet af spaltet caspase-9 men ikke caspase-8 [16]. CTPG kan aktivere forskellige signalveje i forskellige typer tumorceller.

Mitokondriel membranintegritet er stramt reguleret af medlemmerne af BCL-2-proteinfamilien inklusive Bax og Bcl-2 [27, 28]. Forholdet mellem Bax og Bcl-2 spiller en afgørende rolle i den mitokondrieafhængige apoptosevej [29]. I H22-celler behandlet med CTPG var Bax/Bcl-2-forholdet signifikant opreguleret, hvilket kan forårsage reduktionen af ​​Δψm og frigivelsen af ​​cytochrom c observeret i denne undersøgelse. Som følge heraf blev pro-caspase-9 spaltet og aktiveret. Endelig aktiverede initiativtagerne af aktiv caspase-8 og -9 bøddelen af ​​caspase-3 for at spalte PARP for at forhindre DNA-reparation. Tilsammen antydede disse resultater, at CTPG inducerede apoptose i H22-celler gennem både ydre og indre signalveje.

I tumormusemodellen undertrykte CTPG væksten af ​​H22 HCC signifikant og forbedrede i høj grad overlevelsen af ​​tumormus. Interessant nok fremmede CTPG dosisafhængigt proliferationen af ​​splenocytter fra Kunming-mus, hvilket er i overensstemmelse med vores tidligere undersøgelse [16].

Disse resultater antydede, at CTPG kunne undertrykke væksten af ​​H22 HCC i mus gennem både direkte antitumoreffekt og indirekte immunforstærkning.

Konklusioner

CTPG undertrykte væksten af ​​H22-celler både in vitro og in vivo og inducerede apoptose i H22-celler gennem både ydre og indre signalveje. Disse data indikerede, at CTPG kunne være en potentiel kandidat til behandling af HCC.