Cistanche Deserticola-polysaccharider forbedrer tarmens aldring ved at hæmme NLRP3-inflammasomaktivering

 

 

Aldring fører til et gradvist fald i flere fysiologiske funktioner og øger risikoen for aldersrelaterede sygdomme [1]. Undersøgelser har vist, at aldring har en betydelig indflydelse på tarmens struktur og funktion [2]. Som kerneorgan for fordøjelse, stofskifte og immunforsvar kan ældning af tarmen forårsage malabsorption af næringsstoffer, stofskifteforstyrrelser og nedsat immunfunktion [3-4], og derved øge modtageligheden for gastrointestinale sygdomme [5]. Kronisk betændelse er et kendetegn for tarmens aldring, men dens molekylære mekanismer er endnu ikke fuldt belyst. I øjeblikket omfatter anti-aldringsmidler hovedsageligt beta-nicotinamidmononukleotid (NMN), rapamycin, dasatinib plus quercetin og andre [3]. Blandt disse er NMN en vigtig forløber for det essentielle coenzym NAD+, og adskillige undersøgelser har bekræftet, at det væsentligt forsinker tarmens ældning i naturligt ældede mus; det er bredt anerkendt i feltet som en effektiv intervention [4-5]. Derfor er det af stor betydning at udforske relevante mekanismer og interventionsstrategier.

Cistanche Oral Liquor til aldring-relaterede sygdomme

Kontakt nu lær cistanche farmere i Kina at kende

Supportive Service Of Wecistanche - Den største cistanche-eksportør i Kina:
E-mail:wallence.suen@wecistanche.com

 

 

 

 

Det nukleotidbindende oligomeriseringsdomæne-lignende receptorfamilie pyrin-domæneholdigt 3 (NLRP3) inflammasom er en nøgleregulator for medfødt immunitet og spiller en vigtig rolle i aldringsrelaterede sygdomme. Dens aktivering kræver to signaler. Det første signal: patogen-associerede molekylære mønstre (PAMP'er) og skadesassocierede molekylære mønstre (DAMP'er) inducerer ekspression af NLRP3 og forløberen for interleukin-1 (pro-IL-1). Det andet signal (såsom kaliumudstrømning og mitokondriebeskadigelse) udløser inflammasomsamling, aktiverer caspase-1 og spalter pro-IL-1 og pro-IL-18 for at generere modne IL-1 og IL-18, hvilket driver inflammation [6]. Under aldring afbrydes intestinal homeostase, hvilket fører til frigivelse af pro-inflammatoriske faktorer såsom lipopolysaccharid (LPS), som vedvarende aktiverer NLRP3-inflammasomet og danner kronisk lavgradig inflammation. Dette forværrer yderligere tarmbarriereskader og dysbiose, ændrer ekspressionen af ​​tight junction-proteiner, øger intestinal permeabilitet og accelererer tarmens aldring [7-10].

Cistanche deserticola, en værdsat traditionel kinesisk medicinsk og fødevarehomolog urt kendt som "ørkenens ginseng", tonificerer nyre-yang, nærer essens og blod og fugter tarmene for at lindre forstoppelse. Dens aktive polysaccharider udviser anti-aldrings-, antioxidant- og tarmbeskyttende egenskaber [11-12]. Med hensyn til tarmbeskyttelse kan Cistanche deserticola-polysaccharider (CDP'er) modulere tarmmikrobiotabalancen ved at hæmme aktiveringen af ​​den Toll-lignende receptor 4 (TLR4)/nuklear faktor-kappa B (NF-KB) pathway og derved reducere LPS-niveauer og reparere tarmbarrierefunktion [13-14]. CDP'er kan også forbedre mitokondriel funktion gennem aktivering af den AMP-aktiverede proteinkinase (AMPK)/sirtuin 1 (SIRT1) pathway, forsinke cellulær senescens, regulere lipidmetabolisme og lindre lipotoksisk skade i intestinale epitelceller [15].

Selvom de intestinale beskyttende virkninger af CDP'er er blevet påvist, er det stadig uklart, om de forbedrer tarmens aldring ved at undertrykke NLRP3-inflammasomvejen. Denne undersøgelse har til formål at undersøge den mekanisme, hvorved CDP'er hæmmer NLRP3-inflammasomaktivering tilforbedre tarmens aldring.

Materialer

 

1.1 Forsøgsdyr

Halvtreds sunde C57BL/6J hanmus (10 ved 2 måneders alderen; 40 ved 20 måneders alderen) blev købt fra Beijing Speifu Biotechnology Co., Ltd. Produktionslicens: SYXK (Beijing) 2023-0011. Dyrene blev opstaldet i et barrieremiljø på den eksperimentelle dyrefacilitet i Hebei Provincial Hospital for Traditionel Kinesisk Medicin under følgende betingelser: temperatur 22 ± 2 grader, relativ fugtighed 50 % ± 10 % og en 12 timers lys/12 timers mørke cyklus. Alle mus blev akklimatiseret i 1 uge. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee på Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine (IACUC-HPHCM-2025001).

 

1.2 Instrumenter og reagenser

 

Kryostat (Thermo Fisher; CryoStar NX50)

Laser scanning konfokalmikroskop (Nikon; AX)

Realtids PCR-system (Thermo Fisher; 7500)

Multimode pladelæser (Tecan; Spark)

Beta-nicotinamid mononukleotid (Bontac, Kina; Kat. BT05N120A005)

SA- -gal farvningssæt (Solarbio, Beijing; Cat. 250003003)

Mus LPS ELISA kit (CUSABIO/Huamei, Wuhan; Kat. CSB-E13066m)

TransZol Up Plus RNA-kit (TransGen Biotech, Beijing; Kat. ER501-01-V2)

MonAmp ChemoHS qPCR-blanding (Monad; Kat. MQ00501S)

Lgr5 polyklonalt antistof (Wuhan Sanying; Cat. 30007-1-AP)

ZO-1 monoklonalt antistof, NLRP3 monoklonalt antistof, Caspase-1 monoklonalt antistof, ASC monoklonalt antistof, GAPDH monoklonalt antistof, Ki67 monoklonalt antistof (Abcam; Cats. ab307799, ab263899, ab179545, ab30545, ab30545, ab30545, ab30545, ab30545, ab30545, ab30545)

Metoder

 

2.1 Fremstilling af Cistanche deserticola polysaccharider

Cistanche-materiale (50 g) blev ekstraheret to gange ved afkogning med 8-fold volumener vand, 1 time hver gang. Filtrater blev kombineret og afkølet til stuetemperatur. Vandfri ethanol blev tilsat til en slutkoncentration på 80% til udfældning. Efter centrifugering blev supernatanten kasseret. Bundfaldet blev opløst i vand, dialyseret og derefter lyofiliseret for at opnå prøven.

 

2.2 Dyregruppering og administration

Efter akklimatisering blev fyrre 20 måneder gamle C57BL/6J mus tilfældigt tildelt til: naturlig aldrende gruppe, lavdosis CDP-gruppe (2,5 g·kg−1), højdosis CDP-gruppe (5,0 g·kg−1) og NMN-gruppe (200 mg·kg−1). Yderligere ti 2 måneder gamle SPF C57BL/6J mus fungerede som en ung kontrolgruppe. De lave og høje CDP-doser blev givet ved oral sondeernæring ved henholdsvis 2,5 g·kg−1 og 5,0 g·kg−1. Ved at bruge kropsoverfladeomdannelse og en menneske-til-mus-konverteringsfaktor på 12 [16], svarer disse til ca. 1× og 2× den kliniske ækvivalente dosis for voksne. NMN-gruppen modtog NMN 200 mg·kg−1 ved sondemad. Unge kontrolgrupper og grupper med naturligt aldrende modtog lige store mængder fysiologisk saltvand (10 mL·kg−1). Behandlinger blev administreret kontinuerligt i 2 måneder.

 

2.3 Forberedelse af frosne sektioner

Mus blev bedøvet ved intraperitoneal injektion af natriumpentobarbital (30 mg·kg-1) og aflivet. Abdomen blev åbnet hurtigt, mesenteriet adskilt, og ilealvæv blev opsamlet og snittet ved 5 μm til frosne snit [17].

 

2.4 SA- -gal-assay for intestinal-galactosidase-aktivitet

Farvning blev udført i henhold til SA- -gal kit-vejledningen. Efter inkubation blev farvningsopløsningen fjernet, og sektioner blev vasket med PBS. Billeder blev opsamlet ved hjælp af et omvendt mikroskop.

 

2.5 Real-time PCR for senescens-associeret sekretorisk fænotype (SASP)

Totalt RNA fra ilealvæv blev ekstraheret under anvendelse af TransZol Up Plus-sættet. Omvendt transkription blev udført med GoScript-systemet under følgende betingelser: 42 grader i 15 minutter, 70 grader i 15 minutter, 4 grader i 10 minutter. Real-time PCR blev udført under anvendelse af MonAmp ChemoHS qPCR Mix med følgende cyklus: 95 grader 10 min; derefter 40 cyklusser af 95 grader 15 s, 60 grader 1 min. Smeltekurve: 95 grader 15 s, 60 grader 15 s, 95 grader 15 s. GAPDH fungerede som den interne reference, og relativ kvantificering brugte 2^-ΔΔCt-metoden. Primere blev købt hos Promega. Primersekvenser er vist i tabel 1.

 

2.6 Immunfluorescensfarvning for ZO-1-ekspression

Ilealvæv blev fikseret i 4% paraformaldehyd og paraffinskåret ved 5 μm. Sektioner blev permeabiliseret med 0,3 % Triton X-100 i 15 minutter og blokeret med 10 % gedeserum i 1 time ved stuetemperatur. Primært antistof mod ZO-1 (1:200) blev påført natten over ved 4 grader. Efter PBS-vaske blev Cy3-konjugeret sekundært antistof (1:500) inkuberet i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Kerner blev modfarvet med DAPI i 5 min. Objektglassene blev monteret med antifade-medium og afbildet ved konfokal mikroskopi. Fluorescensintensiteten blev kvantificeret ved hjælp af Image-Pro software.

2.7 Immunhistokemi for Ki67 og Lgr5 ekspression

Ileal-sektioner blev inkuberet med primære antistoffer Ki67 (1:1000) og Lgr5 (1:200) natten over ved 4 grader efter IHC-kittets protokol, derefter med tilsvarende sekundære antistoffer. DAB blev brugt til kromogen udvikling. Resultater blev observeret ved lysmikroskopi. Den gennemsnitlige optiske tæthed blev kvantificeret ved hjælp af Image-Pro-software.

 

2.8 ELISA for LPS-niveauer

Standarder og prøver (100 μL pr. brønd) blev tilsat til pladen og inkuberet ved stuetemperatur i 1,5 time. HRP-konjugeret streptavidinopløsning (100 μL pr. brønd) blev derefter tilsat og inkuberet i 30 min. Substrat blev tilsat under lysbeskyttede betingelser og reageret i 30 min. Reaktionen blev afsluttet med stopopløsning, og absorbans blev målt ved 450 nm.

 

2.9 Western blot for NLRP3, Caspase-1 og ASC

Ca. 30 mg ilealvæv blev malet i flydende nitrogen. RIPA-lysebuffer indeholdende protease/phosphatase-inhibitorer blev tilsat; lysater blev inkuberet på is i 30 minutter og centrifugeret ved 12.000 x g, 4 grader i 15 minutter for at opsamle supernatanter. Proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-assay og justeret til 2 ug/μL. Lige store mængder protein (20-40 ug) blev adskilt ved SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret med 5 % fedtfri mælk i 1 time ved stuetemperatur, inkuberet med primære antistoffer (NLRP3 1:1000, Caspase-1 1:500, ASC 1:1000) natten over ved 4 grader, derefter med HRP-konjugerede sekundære antistoffer ved stuetemperatur (1:10 timer) ved stuetemperatur (1:50 timer). Efter TBST-vaske blev der udviklet signaler. Båndintensiteter blev normaliseret til GAPDH.

 

2.10 Statistisk analyse

Data er udtrykt som middel ± standardafvigelse. Statistisk analyse og graftegning blev udført ved hjælp af henholdsvis SPSS 26.0 og GraphPad Prism 8.0.2. Envejs ANOVA blev brugt til at vurdere forskelle mellem grupper, efterfulgt af Tukeys post hoc test. Statistisk signifikans blev sat til P < 0,05.

 

Praktiske noter til læsere, der er interesseret i tarmmotilitet og udvikling af kosttilskud

 

Funktionelt fokus for Cistanche deserticola: Traditionelt brugt til at fugte tarmene og lindre forstoppelse; moderne data understøtter barrierestøtte, inflammationsmodulation (TLR4/NF-κB) og mitokondriefunktion via AMPK/SIRT1.

Potentiel anti-aging tarmmekanisme udforsket her: Undertrykkelse af NLRP3-inflammasomaktivering; reduktion af LPS-drevet lavgradig inflammation; bevarelse af tætte kryds (f.eks. ZO-1); vedligeholdelse af epitheliale proliferation/stammemarkører (Ki67, Lgr5).

Typiske eksperimentelle orale doser hos mus: 2,5-5,0 g·kg−1 CDP'er i 2 måneder; NMN 200 mg·kg−1 som positiv kontrol.

Translationel forsigtighed: Musedoser er ikke direkte humane anbefalinger. Undersøgelsen bruger skalering af kropsoverfladeareal; human-ækvivalent formulering og sikkerhed, identitetstestning og GMP-fremstilling er nødvendige før produktudvikling.