Artsidentifikation og kemisk sammensætningsanalyse af vilde cistancheplanter fra Kenya

Abstrakt:Denne undersøgelse anvendte plantemorfologi, histologi og DNA-stregkodningsteknikker til at identificere de vilde Cistanche-arter i Kenya. Indholdet af de vigtigste aktive komponenter, herunder phenylethanoidglycosider, sukkeralkoholer og betain, i den vilde Cistanche fra Kenya blev bestemt ved hjælp af HPLC-metoden. I mellemtiden blev fingeraftryksanalysen udført. Resultaterne viste, at den vilde Cistanche-plante indsamlet fra Kenya blev identificeret som Cistanche senegalensis (Reut.) Beck. Indholdet af aktive ingredienser som f.eksechinacoside,cistanoside A, akteosid, isoacteosid, og 2'-acetylacteosid i C. senegalensis fra Kenya var lavere end dem i den tamme C. tubulosa, men højere end dem i den tamme C. deserticola. Indholdet af betain svarede til indholdet i den tamme C. deserticola, men det indeholder ikke glukose. Fingeraftrykkets egenskaber minder mere om dem hos tam C. tubulosa. Denne undersøgelse giver grundlag for ressourcebeskyttelse, dybdegående forskning og udvikling af Cistanche-ressourcen i Kenya.

Nøgleord: Cistanches Herba; Cistanche senegalensis (Reut.) Beck; Kenya; artsidentifikation; DNA-stregkodning; indholdsbestemmelse

 

 

 

Cistanche deserticolaYC Ma

 

Cistanche, en værdsat urt i traditionel kinesisk medicin, henviser til de tørrede, skællende, saftige stængler af ørkenplanter som f.eks.Cistanche deserticolaYC MaogCistanche tubulosa(Schenk) Wight, begge medlemmer af Orobanchaceae-familien. Kendt for sin evne til at tonificere nyre-yang, nære essens og blod og fugte tarmene for at lindre forstoppelse, er Cistanche blevet fejret i kinesiske urtetekster i århundreder. Dens tidligste medicinske optegnelse vises i den antikke klassikerShennongs klassiker af Materia Medica, hvor Cistanche er klassificeret som en "superior grade" urt. I løbet af historien har talrige traditionelle medicinske tekster dokumenteret de kraftfulde fordele ved Cistanche, hvilket har givet den det værdsatte kaldenavn "ørkenens ginseng."

De forskellige farmakologiske virkninger af Cistanche tilskrives dens række af bioaktive forbindelser. Blandt dem er phenylethanoidglycosider de primære aktive ingredienser, der er ansvarlige for Cistanches nyre-tonificerende og marv-nærende virkning. Disse forbindelser - såsom echinacosid og acteosid - udviser neurobeskyttende, antidemens-, anti-aldrings- og leverbeskyttende aktiviteter. Navnlig er echinacosid og acteosid de to benchmarkforbindelser, der bruges til kvalitetskontrol af Cistanche som specificeret i 2020-udgaven af ​​den kinesiske farmakopé. Derudover skyldes den afførende virkning af Cistanche hovedsageligt dets oligosaccharidalkoholkomponenter, herunder betain, mannitol, fructose, glucose og saccharose. Disse fem komponenter er bredt anerkendt som indikatorer for Cistanches evne til at fugte tarmene og fremme afføring.

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight

I Kina omfatter store arter af CistancheCistanche deserticolaYC Ma,Cistanche tubulosa(Schenk) R. Wight,Cistanche salsa(CA Mey.) G., ogCistanche sinensisG. Beck. Disse arter er hjemmehørende i regioner som Indre Mongoliet, Ningxia, Gansu og Xinjiang. Ud over det nordvestlige Kina er Cistanche-arter også fordelt på tværs af tørre og ørkenområder i Eurasien og det nordlige og østlige Afrika, herunder lande som Iran, Afghanistan, Kenya, Pakistan og Mongoliet.

Kenya, der ligger i Østafrika og skrævende ækvator, består for det meste af højland med en gennemsnitlig højde på 1.500 meter, men dets nordlige områder er ørken eller halvørken. De oprindelige folk i Kenya har en lang historie med at bruge lægeplanter til helbredelse. Regionen kan prale af et væld af medicinsk flora - for eksempel ekstrakter fra bark og rødder af tandbørstetræet (Salvadora persicaL.) er kendt for deres antiinflammatoriske og antibakterielle egenskaber og bruges ofte til at behandle tandpine og infektioner. Barken af ​​sandeltræet (Osyris lanceolataHochst. & Steud.) bruges til at behandle diarré, mens afkog af Maasai-nælde (Urtica massaicaMildbr.) blade bruges mod mavesmerter. Denne rige tradition har fremmet en levende lægeplantekultur, men på grund af økonomiske udviklingsudfordringer er brugen af ​​disse lægeplanter ikke blevet fuldt dokumenteret eller systematisk undersøgt.

Interessant nok bliver Cistanche-arter ofte betragtet som ukrudt i Afrika og har ikke fået meget opmærksomhed eller forskning. Faktisk er der næsten ingen offentliggjorte undersøgelser om afrikansk Cistanche. Som svar på en invitation fra Department of Regional Development for Arid and Semi-Arid Lands of the East African Community gennemførte vores forskerhold et feltstudie i Kenya for at undersøge lokale Cistanche-ressourcer. Vi indsamlede vilde Cistanche-prøver, udførte botanisk identifikation og analyserede deres primære bioaktive forbindelser. Målet var at forstå artsdiversiteten og udviklingspotentialet i Cistanche i Kenya og at skabe et videnskabeligt grundlag for yderligere forskning og udnyttelse af disse værdifulde ørkenplanter.

Cistanche tubulosa tørret helrod Salg i Kina

Whatsapp os for flere detaljer

 

 

Materialer og metoder

Plantematerialer

Vilde Cistanche-prøver fra Kenya blev indsamlet i august 2023 af professorerne Pengfei Tu og Yong Jiang fra School of Pharmaceutical Sciences, Peking University, i Kajiado, Kenya (01 grad 50'01"S; 36 grad 47'00"E). To vilde Cistanche-planter blev indsamlet og mærket K1 og K2 sammen med rødderne af deres værtsplante (se figur 1). Værtsplanten blev identificeret af Kennedy Matheka, en forskningsassistent ved East African Herbarium, National Museums of Kenya, somSericocomopsis hildebrandtiiSchinz, der tilhører Amaranthaceae-familien. Prøver afCistanche deserticolaogCistanche tubulosablev indsamlet fra henholdsvis Turpan City og Yutian County i Xinjiang Uygur Autonome Region, og blev godkendt af professor Pengfei Tu som friske saftige stængler afCistanche deserticolaYC Ma ogCistanche tubulosa(Schrenk) Wight. Alle kuponprøver opbevares i vores laboratorium.

Instrumenter

Waters Arc HPLC-system

Quintix125D-1CN elektronisk vægt (Sartorius, Beijing)

Olympus BX-50 optisk mikroskop (Olympus, Japan)

NanoZoomer-SQ panoramisk diasscanner (Hamamatsu Photonics, Japan)

KQ500DE digital ultralydsrenser (Kunshan Ultrasonic Instruments, Kina)

MM400 DNA-ekstraktionsmølle (Retsch, Tyskland)

PCR termisk cykler (Analytik Jena, Tyskland)

DYY-8C elektroforeseapparat og tank (Liuyi Instrument Factory, Beijing)

MINI Space 1000 gel billedbehandlingssystem (Tanon, Shanghai)

Konstant temperatur inkubator (Yiheng, Shanghai)

Reagenser

Echinacosid (parti: DST191008-038), acteosid (DSTDL006101), isoacteosid (DST210601-060), D-mannitol (DSTDG006201) blev købt fra Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.; tubulosid A (MUST-15040115), 2'-acetylacteosid (MUST-15071504), betain (MUST-23082505), vandfri D-glucose (MUST-23030214), fructose (MUST-23031403) og saccharose (MUST-23082505) blev opnået fra Chengdu Mansite Biotechnology Co., Ltd. OCEANPAK), myresyre (HPLC-kvalitet, VOKA-reagenser) var alle af kromatografisk renhed. Plantegenomisk DNA-ekstraktionssæt (DP305, Tiangen Biotech, Kina) og ultrarent vand blev brugt til molekylær analyse.

Forberedelse, farvning og observation af sukkulente stængelsektioner

Ved at følge metoden i reference [10] blev friske Cistanche-sukkulente stængler skåret til passende størrelser og konserveret i FAA-fikseringsmiddel (70 % ethanol: iseddike: formaldehyd=90:5:5). Efter vask med rindende vand for at fjerne resterende fikseringsmiddel, blev væv blødgjort med flussyre, farvet med Safranin, dehydreret, indlejret i paraffin og snittet. Efter montering blev objektglassene bagt, paraffin smeltet og sektioner farvet med 95 % ethanol Fast Green-opløsning og derefter forseglet med neutral harpiks. Vævsmorfologien blev observeret under et mikroskop, og velformede snit blev scannet ved hjælp af en panoramascanner for at opnå billeder i høj opløsning.

DNA-ekstraktion, PCR-amplifikation og sekventering

Samlet DNA fra Cistanche-prøver og værtsplanterødder blev ekstraheret under anvendelse af et plantegenomisk DNA-ekstraktionssæt (Tiangen) efter producentens protokol. DNA-koncentrationer og OD260/OD280-forhold blev målt med et mikrovolumen UV-spektrofotometer for at vurdere kvaliteten, før man fortsætter.

PCR-amplifikation målrettede den interne transskriberede spacer 2 (ITS2)-region af ribosomalt DNA og chloroplast psbA-trnH-genet til molekylær identifikation [11]. Primersekvenser var som følger:

ITS2 frem: 5'-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3'

ITS2 omvendt: 5'-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3'

psbA-trnH fremad: 5'-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3'

psbA-trnH omvendt: 5'-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3'

PCR-reaktioner (25 μL) inkluderede 12,5 μL 2x Taq Master Mix, 1 μL hver af fremadgående og reverse primere (2,5 μmol·L⁻¹), 2 μL DNA-skabelon og 8,5 μL ddH₂O. ITS2-forstærkning: 94 grader 5 min; derefter 35-40 cyklusser af 94 grader 30 s, 56 grader 30 s, 72 grader 45 s; sidste forlængelse ved 72 grader 10 min. psbA-trnH amplifikation: 95 grader 4 min; 35 cyklusser af 94 grader 30 s, 55 grader 1 min, 72 grader 1 min; sidste forlængelse ved 72 grader 10 min. PCR-produkter blev analyseret ved gelelektroforese, og målbånd blev udsat for Sanger tovejs sekventering. Sekvenskromatogrammer blev analyseret ved hjælp af CodonCode Aligner (v3.7.1, CodonCode Co., USA) for at opnå mål-DNA-sekvenser, som blev identificeret ved hjælp af det kinesiske Materia Medica DNA-stregkodesystem og BLAST-analyse i GenBank-databasen. Fylogenetiske træer blev konstrueret med MEGA X-software til artsidentifikation.

Kvantitativ bestemmelse af fem phenylethanoidglycosider

Indholdet af fem phenylethanoidglykosider blev bestemt efter tidligere etablerede metoder [13]. Fremstilling af referenceopløsninger: Vej nøjagtigt echinacosid, tubulosid A, acteosid, isoacteosid og 2'-acetylacteosid, og opløs i 50 % methanol for at fremstille en blandet standardopløsning med forudbestemt koncentration. Kromatografiske forhold: Phenomenex Luna C18-søjle (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fase A: acetonitril-methanol (6:1, v:v); mobil fase B: 0,1 % myresyrebuffer; gradienteluering: 0-5 minutter, 10%-18% A; 5-15 min, 18%-24% A; 15–20 min, 24 %–26 % A; 20–28 min, 26 %–30 % A; 28–35 min, 30 %–35 % A. Flowhastighed: 1,0 ml·min⁻¹; kolonnetemperatur: 30 grader; detektionsbølgelængde: 330 nm. Metode: Injicer 10 μL hver af standard- og prøveopløsninger i HPLC'en til analyse.

Kvantitativ bestemmelse af betain, mannitol, fructose, glukose og saccharose

Disse komponenter blev kvantificeret ifølge tidligere metoder [14]. Referenceopløsninger: Vej nøjagtigt betain, mannitol, fructose, glucose og saccharose, opløs i vand for at fremstille en blandet standardopløsning. Prøveopløsninger: fortynd Cistanche-prøveopløsningen (tilberedt som ovenfor) med 50 % methanol til 1/5 af den oprindelige koncentration, bland godt og filtrer gennem en 0,22 μm mikroporøs membran. Kromatografiske forhold: Shodex ASHAIPAK NH2P-50 4E kolonne (250 mm × 4,6 mm, 5 μm); mobil fase: acetonitril-vand (77:23); strømningshastighed: 0,7 ml·min-1; kolonnetemperatur: 25 grader; detektion med evaporativ lysspredningsdetektor (ELSD): driftrørstemperatur 100 grader, bæregasflow 3 L·min⁻¹. Kvantificering blev udført ved at injicere 5 μL og 10 μL standardopløsninger og 5 μL prøveopløsning og beregne indholdet ved hjælp af den eksterne standard to-punkts logaritmiske ligning.

Evaluering af lighed med fingeraftryk

Prøveopløsninger blev fremstillet som beskrevet ovenfor, og HPLC-betingelser og metoder var de samme som for phenylethanoidglycosid-kvantificering. Kromatografiske data blev importeret til "Traditional Chinese Medicine Chromatographic Fingerprint Similarity Evaluation System (2012 Edition)". Kromatogrammet af prøve K1 blev brugt som reference, med fem phenylethanoid-glycosid-toppe markeret til flerpunktskorrektion, generering af overlejrings- og referencekromatogrammer og beregning af fingeraftrykslighed.

 

 

Resultater og analyse

1. Morfologisk identifikation af Cistanche

De vilde Cistanche-prøver indsamlet i Kenya udviser karakteristiske morfologiske egenskaber. Blomsterstanden er en spids med et dækblad, der er lang-ægformet-lancetformet, og to små dækblade, hvis begge sider er glatte. Bægerbægeret er rørformet med fem stumpe lapper i spidsen. Kronen er rørformet-campanuformet, måler 3-4 cm i længden, ca. 2,5 gange længden af ​​bægeret, med fem lapper i spidsen og tilbagebuede marginer. Kronen er gul i farven (figur 1A, B), bliver brun, når den tørres. Filamenterne er cirka 3 cm lange, med nogle få fine hår i bunden. Stilen er lidt længere end støvdragerne, og stigmatiseringen er næsten kugleformet, glat og glat. Der er fire støvdragere, med langægformede støvknapper, der er tæt dækket af lange uldhår; bunden af ​​støvfanget er brat spids. Denne funktion er i overensstemmelse med beskrivelserne afCistanche deserticolaogCistanche salsai "Kinas Flora"; i modsætning hertil støvfanget base afCistanche tubulosaer stump og afrundet, hvilket tydeligt adskiller den fra andre arter i samme slægt [7].

Derudover er værtsplanten,Sericocomopsis hildebrandtiiSchinz, er en meget forgrenet busk. Dens unge grene er tæt dækket af lysegule eller hvide uldhår. Bladene er bredt spatelformede-ovaleformede med en smal base (figur 1D, E). Blomsterstandene er tæt klyngede langs stilken, der sammen med blomsterstandsaksen er dækket af gråhvide eller bleggrå eller hvide uldhår.

Den saftige stængel af den vilde Cistanche er flad-cylindrisk med en bleggul eller brunlig overflade tæt dækket med nålelignende, kødfulde skæl arrangeret i rækker. Teksturen er fast, men alligevel lidt fleksibel (figur 2A). Tværsnittet af den sukkulente stilk er lysegul eller brunlig, med spredte lysebrune karbundter synlige for det blotte øje (figur 2B). Under mikroskopet fremstår de vaskulære bundter ægformede eller fusiforme, sammensat af xylem og floem, ofte til stede som solitære spredte bundter eller grupperet i par eller trioer, med floem orienteret i forskellige retninger (figur 2C, D). Ifølge 2025-udgaven af ​​den kinesiske farmakopé er tværsnittet afCistanche deserticolaer brunlig, med lysebrune priklignende karbundter arrangeret i en bølget ring, der ofte danner et indvendigt foldet ringformet bundt; i modsætning hertilCistanche tubulosaviser spredte priklignende vaskulære bundter, et vigtigt kendetegn til at identificere disse to typer Cistanche-skiver [1]. Den vilde Cistanche fra Kenya viser også spredte priklignende karbundter i tværsnittet, i overensstemmelse med egenskaberne vedCistanche tubulosa.

 

 

Figur 2 Udseende og tværsnitskarakteristika af vild Cistanche-plante (K2) i Kenya. A: Stilkens udseende; B: Tværsnittet af den kødfulde stilk; C: Paraffinsektion af den kødfulde stilk (safranin-hurtig grøn farvning); D: Forstørret billede af karbundtet i paraffinsektionen