Analyse af aromakomponenter og differentielle metabolitter i Cistanche Musalais baseret på GC-MS og metabolomics
Nov 28, 2025
Abstrakt:Denne undersøgelse forberedte Cistanche Musalais ved hjælp af traditionelle teknikker med Xinjiang Hetian røde druer og varierende tilføjelser af Cistanche. Optimale behandlingsbetingelser blev bestemt ved envejs ANOVA. GC-MS og ikke-målrettet metabolomics blev brugt til at analysere aromakomponenter og differentielle metabolitter, og aktive bestanddele såsom totale flavonoider og totale polyphenoler blev kvantificeret. De optimale forhold var: indledende sukkerindhold på 32 grader Bx, gæringstemperatur på 25 grader og 7% tilsætning af Cistanche deserticola. Under disse forhold nåede alkoholindholdet, den totale surhedsgrad, det totale antal flavonoider og det totale antal polyfenoler (12,6 ± 0,6) % vol, (3,82 ± 0,19) g/L, (0,80 ± 0,01) g/L og (0,60 ± 0,00) g/L, henholdsvis. GC-MS påviste 38 aromaforbindelser, hvor estere var den mest udbredte klasse (24 forbindelser), efterfulgt af 6 alkoholer, 2 ketoner og 2 aldehyder. Sammenlignet med Musalais fremstillet udelukkende af druejuice, udviste Cistanche deserticola Musalais betydeligt højere niveauer af nøgleestere, herunder ethylacetat (6,42 % vs.. 2.42%) og ethylpalmitat (3,75% vs.. 1.18%), mens højere alkoholer såsom isobutanol.{1}% faldt markant (28% vs.{1}%). Metabolomics identificerede 230 differentielle metabolitter (VIP større end eller lig med 1, P < 0,05), beriget i pathways relateret til ABC-transportører og aminosyrebiosyntese. Komponenter såsom trigonellin og crocin var signifikant forhøjede. Aminosyremetabolisme bidrog til dannelsen af den karakteristiske smagsprofil. Denne undersøgelse giver et teoretisk og teknisk grundlag for udvikling og kvalitetsforbedring af Cistanche Musalais. Fremtidig forskning bør inkorporere molekylære sensoriske teknikker, såsom GC-O, for bedre at identificere de vigtigste aktive forbindelser, der er ansvarlige for den overordnede smagsprofil.
Nøgleord: Cistanche;Musalais; GC-MS; metabolomik
CistancheMusalais
Oplysninger om Cistanche Musalais
Musalais (Msalais)er en traditionel fermenteret drik, der er unik for Xinjiang, fremstillet af røde Awati druer eller Hetian (Hotan) røde druer. Det er lavet ved at juice, koncentrere og spontan gæring, og er karakteriseret som primitivt, naturligt og grønt. Som en unik kinesisk naturligt fermenteret alkoholisk drik udviser Musalais distinkte regionale karakteristika i sensoriske egenskaber, ernæringsværdi og funktionelle aktiviteter. Alkoholer, estere, aldehyder, syrer, phenoler og terpener, der dannes under fermentering, giver ikke kun en unik smag, men er også forbundet med fordele som at fremme blodcirkulationen, sænke blodlipider, tonificere nyrerne og styrke kroppen, regulere kolesterol og opretholde dets kardiovaskulær sundhed [1].
I de senere år, med stigende forbrugerefterspørgsel efter sunde drikkevarer, er markedet for funktionel spiritus vokset hurtigt. På basis af traditionel brygning inkorporerer funktionelle spiritus specifikke funktionelle komponenter for at imødekomme behov for wellness, sundhedsvedligeholdelse eller specifik fysiologisk regulering. Deres kvalitet er påvirket af råmaterialer, processer, mikrobielle samfund og stabiliteten af funktionelle komponenter [2]. I det sydlige Xinjiang folkepraksis tilsættes lokale tilsætningsstoffer såsom gojibær, tidsel, cistanche og safran ofte under Musalais-tilberedning for at forbedre sundhedsmæssige fordele og berige smagsdiversiteten [3]. Blandt disse har Cistanche, der er rig på polysaccharider, aminosyrer, phenylethanoidglycosider, iridoidglycosider og alkaloider, toniske virkninger på nyre-yang, modulerer neuroendokrin funktion og bekæmper træthed, hvilket får navnet "ørkenens ginseng" [4–5].
Industrialiseringen af Cistanche Musalais står imidlertid i øjeblikket over for udfordringer, herunder mangel på produktionsstandarder, ufuldstændig forarbejdningsteknologi og utilstrækkelig forskning i smagsstoffer, hvilket begrænser dets markedsfremme og kvalitetsforbedringer. I denne undersøgelse blev Cistanche brugt som et supplement til at optimere Musalais-fermenteringsprocessen. GC-MS og ikke-målrettet metabolomics blev brugt til systematisk at løse aromabestanddele og differentielle metabolitter med det formål at give et teoretisk grundlag og teknisk støtte til standardiseret produktion, smagsmodulering og funktionel forbedring af Cistanche Musalais, og derved fremme moderniseringen og værdiudviklingen af denne traditionelle drik.
1 Materialer og metoder
1.1 Materialer og reagenser
Cistanche tubulosa (rørformet Cistanche): Førsteklasses kommercielle prøver hentet fra Hetian (Hotan), Xinjiang, med fyldig tekstur og fri for mug og urenheder.
Hetian røde druer: kommerciel frugt med intakt udseende og stærk aroma, hentet fra Hetian, Xinjiang.
Methanol og acetonitril: Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
Myresyre: TCI (Shanghai) Development Co., Ltd.
L-2-chlorphenylalanine: Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.
1.2 Instrumenter og udstyr
08-2T magnetisk omrører med konstant temperatur, Shanghai Meiyingpu Instrument Co., Ltd.
57330-U SPME-enhed og 57348-U 50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME-fiber, Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.
6890N-5973 GC–MS-system, Agilent Technologies (China) Co., Ltd.
5430R kølecentrifuge, Eppendorf (Shanghai) International Trading Co., Ltd.
TL-48R vævssliber med høj kapacitet, Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd.
SCIENTZ-1LS vakuumkoncentrator, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.
Vanquish Flex UHPLC, Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.
SDAJ-0.5 vinproduktionslinje i kinesisk stil, Shandong Anji Bio-Fermentation Equipment Technology Co., Ltd.
1.3 Eksperimentelle metoder
1.3.1 Procesflow
Cistanche blev dampet til senere brug. Hetian røde druer blev vasket og udvalgt, afstilket og knust. Druejuice blev ekstraheret med en presse, derefter opvarmet og koncentreret for at justere juicekoncentrationsindikatorerne. Til sidst blev det dampede Cistanche-produkt blandet med koncentreret druesaft og fermenteret under kontrollerede temperatur- og tidsparametre. Efter gæring blev produktet klaret for at opnå Cistanche Musalais.
1.3.2 Forberedelse af Cistanche
Med mindre ændringer af Gong et al. [6] højkvalitets, ikke-nedbrudt tørret Cistanche blev skrællet, skåret i skiver, pakket ind i gaze og dampet i 20 minutter til senere brug.
1.3.3 Tilberedning af druesaft
Hetian røde druer med et indledende opløseligt tørstof (sukker) på 18 grader Bx blev brugt. Rådne, forringede og ujævnt modne druer blev fjernet. Efter vask og skrælning blev druer presset. Saften blev kogt (koncentreret) ved høj temperatur, og koncentrationen blev stoppet, når sukkeret nåede 26, 29 eller 32 grader Bx. Saften blev afkølet til stuetemperatur til senere brug.
1.3.4 Fermenteringsproces for Cistanche Musalais
Dampet Cistanche blev tilsat i definerede forhold (3%, 5%, 7%) til 600 ml koncentreret druesaft i en gæringsbeholder. Restsukker blev målt hver 24. time under fermentering for at overvåge fremskridt. Da restsukker faldt til 4 g/l, blev gæringen afsluttet. Supernatanten blev opsamlet og pasteuriseret ved 85 grader i 30 minutter for at opnå Cistanche Musalais.
1.3.5 Enkeltfaktor eksperimentelt design for Cistanche Musalais
Virkningerne af Cistanche-tilsætning (3%, 5%, 7%), initialt sukkerindhold (26, 29, 32 grader Bx) og fermenteringstemperatur (22, 25, 28 grader) på fysisk-kemiske egenskaber og bioaktivitet blev undersøgt.
1.3.6 Analyser og målinger
Alkoholindhold, opløselige faste stoffer og total surhed: bestemt i henhold til GB/T 15038-2006 "Generelle analysemetoder for vin og frugtvin."
Totalt antal flavonoider: bestemt med henvisning til Xu et al. [7]. En kalibreringskurve blev fremstillet med rutinkoncentration (X) som abscisse og absorbans (Y) ved 510 nm som ordinat, hvilket gav Y=0.8043X - 0,0278, R2=0.9999, hvilket indikerer god linearitet.
Totalt antal polyfenoler: bestemt ved anvendelse af Folin-Ciocalteu-metoden [8]. En kalibreringskurve blev fremstillet med gallussyreindhold (X) som abscisse og absorbans (Y) ved 760 nm som ordinat, hvilket gav Y=0.4177X + 0.1048, R2=0.9975, hvilket indikerer god linearitet.
1.3.7 GC-MS-analyse
Prøver fra to grupper - eksperimentelle (32 grader Bx, 25 grader, 7% Cistanche) og kontrol uden Cistanche - blev udsat for GC-MS.
Prøveforbehandling: Prøven blev anbragt i et 20 ml ekstraktionshætteglas; 100 μL 50 ug/ml isoamylphenylacetat blev tilsat som intern standard. Hætteglasset blev forseglet og ækvilibreret i et 60 graders vandbad med magnetisk omrøring ved 250 r/min i 20 min. SPME-fiberen blev derefter indsat til 30 minutters ekstraktion. Før brug blev SPME-fiberen konditioneret ved GC-indløbet ved 250 grader i 20 minutter.
GC–MS-betingelser: HP-INNOWax-søjle (60 m × 250 μm × 0,25 μm); indløb 250 grader; overførselsledning 250 grader; bæregasstrøm 1,5 ml/min; delt 4:1. Ovnprogram: 40 grader (5 min), rampe 5 grader/min til 250 grader, hold 10 min. Ionkilde 230 grader; quadrupol 150 grader ; EI 70 eV; fuld scanning 35–550 Da.
1.3.8 Ikke-målrettet metabolomics
1.3.8.1 Prøveforberedelse
To grupper blev testet: eksperimentel (32 grader Bx, 25 grader, 7 % Cistanche) og kontrol uden Cistanche; n=3 biologiske replikater pr. gruppe, i alt 6 prøver. Efter optøning og vortexing blev 300 μL af hver prøve overført til et 1,5 mL rør og centrifugeret ved 12.000 r/min, 4 grader i 15 min. Derefter blev 100 μL supernatant flyttet til et 2 mL rør, lynfrosset i flydende nitrogen og lyofiliseret. Tilsæt 1 ml forkølet methanol:acetonitril (1:1, v/v), vortex 30 s; frys ved -20 grader i 30 minutter; centrifuger ved 12.000 r/min, 4 grader i 10 min; opsaml 850 μL supernatant og vakuumtør til fuldstændighed; rekonstituer i 150 μL 50% methanol (med 5 ppm 2-chlorphenylalanin), vortex 30 s; centrifuger 12.000 r/min, 4 grader i 10 min; filtrer gennem 0,22 μm membran og overfør filtratet til hætteglas. Kombiner 10-20 μL fra hver prøve for at skabe en QC-prøve for at evaluere instrumentets stabilitet og datapålidelighed; QC er udeladt, hvis færre end 5 prøver er inkluderet.
1.3.8.2 Analytiske forhold
Kromatografi: ACQUITY UPLC HSS T3-søjle (100 Å, 1,8 μm, 2,1 mm × 100 mm); flow 0,4 ml/min; søjle 40 grader ; autosampler 8 grader ; injektion 2 μL. Mobil fase A: vand med 0,1% (v/v) myresyre; mobil fase B: acetonitril med 0,1% (v/v) myresyre.
Massespektrometri: sprayspænding +3.5 kV/−3,0 kV; kappegas 40 arb; hjælpegas 10 arb; kapillær 320 grader; hjælpegas temp 300 grader; MS1 opløsning 60.000; scanningsområde m/z 70–1.000; AGC Target Standard; Max IT 100 ms; dataafhængig MS/MS på top 4 ioner med dynamisk udelukkelse 4 s; MS2 opløsning 15.000; HCD kollisionsenergi 30%.
1.3.8.3 Metabolitidentifikation
Metabolitidentifikation var baseret på PSNGM (PerSonalbio Next-Generation Metabolomics Database), der omfatter et internt bibliotek af standarder, mzCloud (https://www.mzcloud.org/), LIPID MAPS (https://www.lipidmaps.org/), HMDB (https://hmdb.lab./), Mouc.Fieeee/, Mouc.Feee/, Mouc.Feee/, Mouc. NIST_2020_MSMS og et AI-forudsagt MS/MS-spektralbibliotek.
Bemærk om eksterne databaser brugt i annotering:
HMDB: En omfattende human metabolomdatabase (version 5.0) indeholdende detaljeret kemisk, klinisk og biokemisk information for 220.945 metabolitter, med omfattende krydslinks til KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, UniProt og GenBank og understøtter avanceret tekst/sekvens/spektralsøgning og MS/NMR-spektralsøgning. Også forbundet med DrugBank, T3DB, SMPDB og FooDB.
LIPID MAPS: An open-access lipidomics resource providing databases (e.g., LMSD with >50.000 kuraterede lipidstrukturer), spektre, pathways, værktøjer til MS-analyse, strukturtegning og nomenklatur/klassificeringsressourcer.
mzCloud: Et avanceret massespektralbibliotek, der understøtter spektrum-, struktur-, understruktur-, træ- og m/z-baserede søgninger med 32.330 forbindelser, 51.002 spektraltræer og 16.531.567 spektre (med betydelige tilføjelser i 2024), optimeret til Firefox/Chrome desktop-adgang.
1.3.8.4 Multivariat statistisk analyse
Multivariate analyser blev anvendt på metabolitdata fra de 6 prøver for at udføre PCA, hvilket belyser metaboliske forskelle mellem Cistanche Musalais og Musalais. Differentielle metabolitter på tværs af grupper blev screenet ved hjælp af OPLS-DA variabel betydning i projektion (VIP), foldændring og P-værdier (VIP-tærskel og signifikans som ovenfor), efterfulgt af biologisk fortolkning, herunder KEGG-vejberigelse [9].
Referencer
[1] Zhu LX, Wang LL, Song HZ, et al. Kvalitativ analyse af de vigtigste aromaforbindelser forbundet med traditionel Musalais-behandling i Xinjiang Kina. Journal of the Institute of Brewing. 2012;118(2):236–242.
[2] Zhao B, Li DD, Yuan Y, et al. Moderne forskningsfremskridt på fermenteret funktionel spiritus. Liquor Making. 2025;52(2):43–49.
[3] Zhu LX, Hou XJ, Xu Q. Diskussion om udviklingsstrategier for Xinjiang Msalais-druevin. Spiritusfremstillingsvidenskab og teknologi. 2008(7):111–113.
[4] Sang ZH, Lei L, Tu PF. Fremskridt inden for forskning af farmakologisk aktivitet i planter af Cistanche Hoffing. et Link. Traditionelle kinesiske lægemidler og urtemedicin. 2003;34(9):U018.
[5] Shi TT, Ge WH. Forskningsudviklingen af Cistanche Hoffmg. Et Link. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy. 2009;18(9):7–9.
[6] Gong X, Zhong T, Zhou JY, et al. Undersøgelse af teknologien i en ny gæret Cistanche-vin. Moderne mad. 2019(5):64–68;79.
[7] Xu HT, Li H, Zhao YZ, et al. Antioxidante og antibakterielle aktiviteter af totale flavonoider fra Nervilia fordii. Northern Horticulture. 2017(16):161-165.
[8] Yu H, Xu X, Hao JX, et al. Blandet gæring af rester af citrusskaller med Trichoderma koningii, Aspergillus oryzae og Lactobacillus casei: procesoptimering, antioxidantaktiviteter og ikke-målrettet metabolomisk analyse. Fødevarebiovidenskab. 2025;66:106180.
[9] Zhou JN, Hou DH, Zou WQ, et al. Sammenligning af bredt målrettet metabolomics og ikke-målrettet metabolomics af vilde Ophiocordyceps sinensis. Molecules. 2022;27(11):3645.
[10] Li XH. Forskning i teknologien fra Rosa kwangsiensis var. sterilis fermenteret vin [Kandidatafhandling]. Chongqing: Southwest University; 2017.
[11] Li ZJ, Zhang XD, Long BX, et al. Forskning i produktudvikling og responsoverfladeoptimering af Msalais pære. Forarbejdning af landbrugsprodukter. 2025;3:1-10.
[12] Zhang L, Jiang XF. Verifikation af tilpasningsevnen af bestemmelsesmetoden for kobber i GB/T15038-2006 generel analysemetode for vin og frugtvin. Fremstilling af spiritus. 2020;47(5):104–107.
[13] Zhong DL, Yang H, Wang Z, et al. Effekt af malolaktisk gæringstemperatur på kvaliteten af Cabernet Sauvignon vin. Zhejiang Agricultural Sciences. 2025;66(7):1724-1732.
