Cistanche forbedrer nyreinfektion på grund af systemisk lupus erythematosus

Nuklear antigen-reaktiv CD4^plusceller udvider sig i aktiv systemisk lupus erythematosus, producerer effektorcytokiner og inficerer nyrerne

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Dimas Abdirama , Sebastian Tesch m.fl

Systemisklupuserythematosuser en systemisk og kronisk autoimmun sygdom karakteriseret ved tab af tolerance over for nukleare antigener med autoreaktiv CD4^plusT-celler impliceret i sygdomspatogenese. Der er dog meget lidt kendt om deres receptorspecificitet siden påvisningen af ​​humant autoantigen-specifikt CD4^plusT-celler har været ekstremt udfordrende. Her præsenterer vi en analyse af CD4^plus T-celler reaktive til nukleare antigener ved hjælp af to komplementære metoder: T-cellebiblioteker og antigen-reaktiv T-celleberigelse. Hyppighederne af nuklear antigen-specifik CD4^plus T-celler korrelerede med sygdommens sværhedsgrad. Disse autoreaktive T-celler producerer effektorcytokiner såsom interferon-g, interleukin-17 og interleukin-10. Sammenlignet med blod blev disse celler beriget i urinen fra patienter med aktiv lupus nefritis, hvilket tyder på en infiltration af de inficeredenyrer. Disse tidligere uerkendte karakteristika understøtter således en rolle for nuklear antigen-specifik A CD4^plusT-celler indsystemisklupuserythematosus.

Copyright ª 2020, International Society of Nephrology. Udgivet af Elsevier Inc. Dette er en artikel med åben adgang under CC BY-NC-ND-licensen

SØGEORD: lupuserythematosus, nyre,

Systemisklupuserythematosuser en systemisk og kronisk autoimmun sygdom karakteriseret ved tab af tolerance over for nukleare antigener på grund af defekt bortskaffelse af biologisk affald såsom apoptotisk materiale indeholdende ribonukleoproteiner og nukleosomer.1 Autoantistof rettet mod nukleare antigener er karakteristisk forsystemisklupuserythematosusog opstår normalt før den åbenlyse sygdom. Derudover autoreaktiv CD4^plusT-celler er impliceret i patogenesen afsystemisklupuserythematosusved at fremme autoantistofproduktion af B-celler og direkte formere organskader i inficerede målorganer. Selvom påvisningen af ​​nukleare antigen-reaktive T-celler er blevet rapporteret tidligere, forbliver beviset for deres eksistens periferisk indtil nu, og det er i øjeblikket uklart, hvordan de spiller sammen i patogenesen. At forstå, hvordan disse celler deltager i autoimmunitet, vil være afgørende for udformningen af ​​effektiv behandling.

Påvisningen af ​​autoantigen-specifikke T-celler hindres af deres ekstraordinært lave frekvenser i cirkulerende blod. Tidligere undersøgelser af human naiv CD4^plusT-celle-repertoirer har brugt tetramer-baseret teknologi til effektivt at give præcis information om T-celle-responser på specifikke antigenepitoper; denne metode kræver imidlertid forudgående viden om donorens humane leukocytantigentyper. Alternative teknikker til samtidig påvisning og optælling af sjældne T-cellepopulationer med reaktivitet over for forskellige antigener uden forudgående kendskab til humane leukocytantigentyper blev udviklet ved at bruge biblioteker af amplificerede polyklonale T-celler og ved berigelse af CD154-udtrykkende T-celler efter stimulering med et antigen kaldet ARTE (antigen-reaktiv Tcell-berigelse).

Systemisklupuserythematosuser skadeligt fornyrer, men cistanche kan forbedresnyrefunktioner.

CD4^plus T-celler udøver hovedsageligt deres funktion gennem sekretion af cytokiner ved antigenaktivering16 og ved at udbrede vævsinflammation som f.eks.lupusnefritissom repræsenterer en af ​​de mest alvorlige komplikationer afsystemisklupuserythematosus. Analyse af T-celle repertoiret til stede inyrebiopsier fra patienter medlupusnefritisafsløret oligoklonalitet afnyre-infiltrerende CD4^plus T-celler, der indikerer ophobning af antigen-specifikke T-celler i inficeredenyrer. Vores tidligere undersøgelse afslørede urin-T-celler hos patienter med aktivlupus nefritissom en præcis biomarkør, der ligner fænotypen af ​​intrarenale celler. Selvom disse celler er beriget for CXC kemokinreceptor 3 og CC kemokinreceptor 5, der udtrykker T-celler, der indikerer en T-hjælpercelle 1 (Th1) cellepopulation og indeholder CD154^plusT-celler, der tyder på nyligt stød på antigen, forbliver deres antigenspecificitet over for nukleare antigener uklar.

I denne undersøgelse præsenterer vi en analyse af CD4^plus T-celler reaktive over for nukleare antigener hos i alt 17 raske individer, 12 forsøgspersoner med inaktivesystemisklupuserythematosus, og 20 fag med aktivsystemisklupuserythematosusved at bruge T-cellebiblioteker og ARTE-teknikker til at analysere frekvenserne af autoreaktiv CD4^plus T-celler i perifert blod og urin hos patienter medlupusnefritissamt cytokinproduktionen.

RESULTATER

Nuklear antigen-reaktiv CD4^plusT-celler er ekspanderet inaktiv systemisk lupus erythematosus som bestemt ved hjælp af T-cellebiblioteket og ARTE

med aktivsystemisklupuserythematosus. Disse celler kunne også påvises i 5 ud af 6 patienter med inaktivesystemisklupuserythematosus, mens kun 3 af 6 raske kontroller præsenterede cirkulerendeautoreaktivT celler. Interessant, patienter med aktivsystemisklupuserythematosusviste også en bredere række af autoreaktive T-celle-responser, hvor hver patient havde reaktive T-celler mod mindst 3 nukleare antigener. Til sammenligning var målporteføljen mindre variabel hos patienter med inaktivesystemisklupuserythematosusog sunde kontroller. Tilsammen er cirkulerende nukleare antigen-reaktive T-celler ikke eksklusive forsystemisklupuserythematosus, men alligevel inaktivsystemisklupuserythematosus, deres antal er større, og deres målstrukturer er mere variable.

Fordi autoreaktive T-celler spiller en rolle i udbredelsen af ​​autoimmune reaktioner, sammenlignede vi antallet af autoreaktive T-celler med sygdommens sværhedsgrad, vurderet afsystemisklupuserythematosussygdomsaktivitetsindeks (systemisklupuserythematosusDAI) score. Kun frekvenserne på CD4^plusT-celler reaktive over for RNP70, Ro og La korrelerede positivt medsystemisklupuserythematosusDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ 0.4865; Ro: P ¼ 0.005 r ¼ 0,6299; La: P ¼ 0,01, r ¼ 0,5651) (figur Id). I modsætning hertil blev frekvensen af ​​T-celler, der var reaktive for transthyretin, fundet på et nogenlunde ens niveau på tværs af alle 3 grupper (figur 1e), hvilket afviste en mulig eksperimentel skævhed på grund af generel ikke-antigen-specifik T-celle hyperreaktivitet inaktivsystemisklupuserythematosus.

T-cellebiblioteker tilbyder en række fordele, herunder høj følsomhed til at detektere meget sjældne celler inden for et lavt antal inputceller. Denne teknik er imidlertid afhængig af udvidelsen af ​​celler, hvilket kan ændre cellesammensætningen og kun giver en begrænset mulighed for fænotypisk at karakterisere de reaktive celler. Derfor validerede vi vores observationer med ARTE-metoden. ARTE-protokollen kræver større mængder inputceller, hvilket er særligt udfordrende hos patienter medsystemisklupuserythematosussom ofte præsenterer sig selv for lymfopeni og anæmi. På grund af denne begrænsning og også for at øge den forventede udlæsning af reaktive celler, samlede vi alle 5 kanoniske nukleare antigener og brugte denne pulje til at stimulere perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) før berigelse af CD154-udtrykkende celler (n ¼ 15 patienter medsystemisklupuserythematosus; n ¼ 6 sunde kontroller). Ved at bruge en kombination af overflademarkørerne CD154 og CD69, reagerer T-celler påsystemisklupuserythematosus-associerede nukleare antigener kunne identificeres i en baggrundspopulation (figur 1f). Selvom baggrundsekspression af CD154 og CD69 blev observeret rigeligt hos alle individer, var patienter med aktivsystemisklupuserythematosushavde signifikant øgede frekvenser af CD154 plus CD69 plus T-celler, når de blev stimuleret med nukleare antigener sammenlignet med baggrundsstimulering (P ¼ 0.008), mens raske individer og patienter med inaktivesystemisklupuserythematosushavde lignende frekvenser mellem antigen-stimulerede og ikke-stimulerede celler (raske personer: P ¼ 0.44; patienter med inaktivesystemisklupuserythematosus: P ¼ {{0}}.56) (Figur 1g). Ved at trække baggrundsfrekvenserne fra var frekvenserne af nukleare antigen-reaktive T-celler desuden højere hos patienter med aktiv sygdom end hos raske individer og patienter med inaktiv sygdom (P ¼ 0).02 og P henholdsvis ¼ 0.11) (Figur 1h). Hyppigheden af ​​baggrundssubtraherede nukleare antigen-reaktive T-celler korrelerede derved positivt med sygdomsaktivitet (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), hvilket tyder på deres potentielle rolle isystemisklupuserythematosus.

T-cellebiblioteker tilbyder en række fordele, herunder høj følsomhed til at detektere meget sjældne celler inden for et lavt antal inputceller. Denne teknik er imidlertid afhængig af udvidelsen af ​​celler, hvilket kan ændre cellesammensætningen og kun giver en begrænset mulighed for fænotypisk at karakterisere de reaktive celler. Derfor validerede vi vores observationer med ARTE-metoden. ARTE-protokollen kræver større mængder inputceller, hvilket er særligt udfordrende hos patienter med systemisklupuserythematosussom ofte præsenterer sig selv for lymfopeni og anæmi. På grund af denne begrænsning og også for at øge den forventede udlæsning af reaktive celler, samlede vi alle 5 kanoniske nukleare antigener og brugte denne pulje til at stimulere perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) før berigelse af CD154-udtrykkende celler (n ¼ 15 patienter medsystemisklupuserythematosus; n ¼ 6 sunde kontroller). Ved at bruge en kombination af overflademarkørerne CD154 og CD69, reagerer T-celler påsystemisklupuserythematosus-associerede nukleare antigener kunne identificeres i en baggrundspopulation (figur 1f). Selvom baggrundsekspression af CD154 og CD69 blev observeret rigeligt hos alle individer, var patienter med aktivsystemisklupuserythematosushavde signifikant øgede frekvenser af CD154^plusCD69^plusT-celler, når de stimuleres med nukleare antigener sammenlignet med baggrundsstimulering (P ¼ 0.008), mens raske individer og patienter med inaktivesystemisklupuserythematosushavde lignende frekvenser mellem antigen-stimulerede og ikke-stimulerede celler (raske personer: P ¼ 0.44; patienter med inaktivesystemisklupuserythematosus: P ¼ {{0}}.56) (Figur 1g). Ved at trække baggrundsfrekvenserne fra var frekvenserne af nukleare antigen-reaktive T-celler desuden højere hos patienter med aktiv sygdom end hos raske individer og patienter med inaktiv sygdom (P ¼ 0).02 og P henholdsvis ¼ 0.11) (Figur 1h). Hyppigheden af ​​baggrundssubtraherede nukleare antigen-reaktive T-celler korrelerede derved positivt med sygdomsaktivitet (P ¼ 0,004, r ¼ 0,5978), hvilket tyder på deres potentielle rolle isystemisklupuserythematosuspatogenese (figur 1i). Desuden CD4^plusT-celler, der var reaktive over for et tilbagekaldelsesantigen Candida albicans MP65 viste lignende frekvenser på tværs af donorerne (figur 1j), med undtagelse af muligheden for en generel skævhed mod højere frekvenser af antigen-reaktive T-celler hos patienter med aktivesystemisklupuserythematosus.

Samlet viser vores data genereret ved hjælp af T-cellebiblioteket og ARTE-metoder udvidelse af autoantigen-specifik CD4^plusT-celler hos patienter med aktivsystemisklupuserythematosus. Begge teknikker er sammenlignelige som angivet af lignende medianstimuleringsindeksværdier mellem antigenstimulerede og ikke-stimulerede T-celleresponser (medianstimuleringsindeks-T-cellebibliotek: 1,857; ARTE: 1,614; P ¼ 0.33), selvom ARTE-teknikken afslørede højere frekvenser af nuklear antigen-reaktiv CD4^plus T-celler end gjorde T-cellebiblioteksteknikken (figur 1k).

Cistanchekan forbedre infektionen afnyre.

Nukleare antigen-reaktive T-celler hos raske individer er bona fife autoreaktive CD4^plusT-celler

Både T-cellebibliotek og ARTE-teknikker demonstrerede påvisning afautoreaktivT cellerhos raske individer, som repræsenterer en mulig oprindelse for udviklingen af ​​menneskelig autoimmunitet. Deres antal var dog ikke signifikant forskellig fra baggrundsfrekvenserne, hvilket efterlod det usikkert, om raske forsøgspersoner faktisk skal cirkulere nuklear antigen-reaktiv CD4^plusT-celler. For at afsløre antigenspecificiteten af ​​autoreaktive T-celler i raske forsøgspersoner, genererede vi enkelt T-celle kloner fra CD154^plusCD69^plusCD4^plusTcell-prækursorer isoleret fra raske individer efter stimulering af PBMC'er med individuelle nukleare antigener og et kontrolantigen afledt af Aspergillus fumigatus-lysat. Et betydeligt antalsystemisklupuserythematosus-associerede autoantigen-specifikke T-celle kloner reagerede på deres tilsvarende antigener efter antigen restimulering som fremhævet ved co-ekspression af IFN-g med CD154 (antal specifikke kloner - Aspergillus fumigatus: 5 af 5; SmD1: 4 af 8; RNP70: 3 af 11; histon: 5 af 5; Ro: 4 af 9; La: 5 af 7) (Supplerende figur S2A og B). Desuden var antigenresponset (repræsentativt vist for SmD1) dosisafhængig, hvilket understregede, at nukleare antigen-reaktive T-celler hos raske individer er bona fife autoreaktiv CD4^plusT-celler (Supplerende figur S2C). Således bekræftede vi eksistensen af ​​nukleare antigen-reaktive T-celler i raske forsøgspersoner inden for baggrundssignalet for de anvendte detektionsmetoder.

Cytokinproduktion af nuklear antigen-reaktive CD4 plus T-celler

Vi undersøgte derefter cytokinproduktionen af ​​nuklear antigen-reaktiv CD4^plusT-celler. CD154-udtrykkende celler blev farvet intracellulært for effektorcytokiner såsom IFN-g, interleukin (IL)-17, IL-4 og IL-10 efter stimulering med en pulje afsystemisklupuserythematosus-associerede nukleare antigener (figur 2a). Frekvenser af IFN-g–, IL-17– og IL-10–producerende CD154^plusCD4^plusT-celler var signifikant forøget hos patienter med aktivsystemisklupuserythematosus(alle cytokiner: P ¼ {0}}.004), hvorimod frekvensen af ​​IL-4-producerende autoreaktive T-celler forblev ude af skel fra baggrundsfrekvensen (P ¼ 0,125) (figur 2b). Desuden var det absolutte antal af IFN-g- og IL-10-producerende autoreaktive T-celler højere hos patienter med aktivesystemisklupuserythematosusend hos raske personer og patienter med inaktivesystemisklupuserythematosus(Figur 2b). Ved at trække baggrundsfrekvenserne fra kan patienter med aktivsystemisklupus erythematosushavde signifikant højere frekvenser af IFN-g- og IL-10-producerende autoreaktive T-celler end raske individer (IFN-g: P ¼ 0.003; IL{{5} }: P ¼ 0,004) såvel som af IFN-g–, IL-17– og IL-10–producerende autoreaktive T-celler end patienter med inaktivesystemisklupuserythematosus(IFN-g: P ¼ 0.002; IL-17: P ¼ 0.00 2; IL-10: P ¼ 0.005) (Figur 2c). Derudover korrelerede hyppigheden af ​​IFN-g- og IL-10- men ikke af IL-17- og IL-4-producerende nukleart antigen-reaktive T-celler med sygdomsaktivitet. Det var dog kun frekvensen af ​​IL-4-producerende celler, der viste mindre korrelation med sygdomsaktivitet (IFN-g: P < 0.0001,="" r="" ¼="" 0,7574;="" il{{20}="" }:="" p="" ¼="" 0,005,="" r="" ¼="" 0,5889;="" il-4:="" p="" ¼="" 0,14,="" r="" ¼="" 0,3717;="" il-="" 10:="" p="" ¼="" 0,0004,="" r="" ¼="" 0,6977)="" (figur).="" bedømt="" efter="" hyppigheden="" af="" ​​ifn-g-producenter,="" antigen-reaktiv="">^plusT-celler var hovedsageligt af Th1-linjen. I modsætning hertil blev IL-17 såvel som IL-10-producenter kun påvist ved lavere frekvenser.26 Sammenlignet med autoantistofniveauer var frekvenserne af cytokinproducerende CD4^plusT-celler korrelerede ikke med koncentrationen af ​​anti-dobbeltstrenget DNA og med serumtiteren for antinukleære antistoffer (Supplerende figur S3A og B). Ingen anden korrelation mellem nuklear antigen-reaktiv CD4^plusT-celler og autoantistoffer blev observeret bortset fra La-reaktiv CD4^plusT-celler mod La-autoantistoffer (Supplerende figur S3C).

Påvisning af nuklear antigen-reaktive CD4 plus T-celler i urinen hos patienter med aktiv systemisk lupus erythematosus og lupus nefritis

Populationen af ​​nukleare antigen-reaktive Th1-celler er mistænkt for at invaderenyrevæv, hvor de kan støde på deres næsten allestedsnærværende beslægtede antigen. Ved at undersøge T-celle receptor (TCR)-b repertoiret af CD4^plusT-celler isoleret fra perifert blod sammenlignet med dem, der er isoleret fra urinen fra 5 patienter medsystemisklupuserythematosusog aktivlupusnefritis, observerede vi et oligoklonalt skævt TCR-repertoire af urinafledte celler (figur 3a). Den kumulative frekvens af de 20 mest udbredte T-cellekloner var signifikant højere i urin svarende til et lavere diversitetsindeks (Supplerende figur S4A). For at teste om disse celler også viser reaktivitet til et sæt afsystemisklupuserythematosus-associerede nukleare antigener, genererede vi biblioteker bestående af urin CD4^plusT-celler isoleret fra 3 patienter medsystemisklupuserythematosusog aktivlupusnefritis(Supplerende figur S4B). Urin CD4^plus T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 blev inkluderet til optælling af urin CD4^plusT-celler, der er specifikke for det individuelle nukleare antigen. Parallelt med urin CD4^plusT-celler, frekvensen af ​​nuklear antigen-reaktiv CD4^plusT-celler i perifert blod blev bestemt, hvilket muliggjorde en direkte sammenligning af de respektive frekvenser inden for de samme individer (figur 3b). Vi fandt det inaktivtlupusnefritis, frekvenserne af urin-nuklear antigen-reaktiv CD4^plusT-celler var højere end i perifert blod. For at bekræfte denne observation mærkede vi urinceller isoleret fra 4 aktivelupusnefritisdonorer med carboxyfluoresceinsuccinimidylester og blandede de mærkede celler med donor-matchede PBMC'er for at muliggøre en direkte sammenligning af antigen-reaktive celler i 1 assay ved hjælp af ARTE-teknikken. Frekvensen af ​​CD154^plusCD69^plusT-celler i stimulerede og ikke-stimulerede prøver af donor-matchede urin- og perifere blodceller blev brugt til at vurdere, om nukleare antigen-reaktive T-celler er beriget i urin som en proxy fornyreved at beregne stimulationsindekset (figur 3c). Selvom T-cellebiblioteket i urin og ARTE-metoderne adskilte sig i deres medianstimuleringsindeks til de nukleare antigener (stimuleringsindeks - urin T-cellebibliotek: 17; ARTE: 2,79; P ¼ 0.4) (Figur 3d) , analyse af autoreaktivitet i perifer og urin CD4^plus T-celler fra begge metoder (i alt n ¼ 7) viste et øget nuklear antigen-specifikt stimuleringsindeks i urin (P ¼ 0.0156) (figur 3e). Disse observationer tyder på, at nuklear antigen-reaktiv CD4^plusT-celler invaderer og akkumuleres iinficeretnyrer. Således lokal vævsbetændelse isystemisklupuserythematosuskan være et antigen-specifikt fænomen og direkte moduleret af det infiltrerendeautoreaktivT celler.

For at fortsætte, for del 2, klik venligst her.