Abstrakt

Den foreliggende opfindelse beskriver enCistanche-ekstrakt til forbedring af knoglemineraltæthed (BMD). I uddraget ertotalt indhold af echinacosid og acteosid (verbascoside)er>25 vægt%. Ekstraktet fremstilles ved at udføreudvinding af destilleret vandafråt pulver afCistanche tubulosa, efterfulgt affiltrering, centrifugeringaf filtratet,koncentration, væske-væske ekstraktion, koncentration med urenhedsfjernelse, fortynding, efterbehandling, og derefterslutkoncentration og tørringfor at opnå Cistanche-ekstraktet.

 

 

Cistanche-ekstraktproces

I Cistanche-ekstraktet til forbedring af knoglemineraltæthed ifølge opfindelsen ertotalt indhold af echinacosid og acteosider25-30 vægt%(eksklusive 25 vægt%), og ekstrakten er også rig påshikiminsyresamtkomponenter af phenylpropionsyre-typenogkomponenter af alkaloid-typen, hvilket gør det muligtstabilt udøve en knogletæthed-forbedrende effekt.

 

Krav

1. Fremstillingsmetode

Fremgangsmåde til fremstilling af et Cistanche-ekstrakt til forbedring af knoglemineraltæthed, kendetegnet ved, at det omfatter følgende trin:

knusendeCistanche tubulosaat opnå råt pulver afCistanche tubulosa;

tilsætning af destilleret vand til det rå pulver afCistanche tubulosatil ekstraktion, filtrering, centrifugering af filtratet og koncentrering for at opnå en koncentreret opløsning afCistanche tubulosa;

ekstrahering af den koncentrerede opløsning afCistanche tubulosakoncentrering af den nedre ekstraktionsfase for at fjerne urenheder og fortynding for at opnå en ladningsopløsning;

efterbehandling af påfyldningsopløsningen, efterfulgt af koncentrering og tørring for at opnå Cistanche-ekstrakten.

2. Forholdet mellem materiale og vand

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor masse-til-volumen-forholdet af det rå pulver afCistanche tubulosatil destilleret vand er1 : (15–25).

3. Ekstraktionstemperatur

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor ekstraktionstemperaturen for destilleret vand er60-100 grader.

4. Forhold under væske-væske-ekstraktion

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvorved volumenforholdet mellem den koncentrerede opløsning under ekstraktion af den koncentrerede opløsningCistanche tubulosatil ekstraktionsopløsningsmiddel er1 : (1–5).

5. Ekstraktionsopløsningsmiddel

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor ekstraktionsopløsningsmidlet omfatter mindst én afpetroleumsether, ethylacetat, n-hexan eller cyclohexan.

6. Efterbehandlingsproces

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor efterbehandlingen af ​​påfyldningsopløsningen omfatter: at føre påfyldningsopløsningen gennem enmakroporøs harpiks, og elueres derefter sekventielt meddestilleret vandog enethanolopløsning.

7. Elueringsvolumener

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, hvor volumenforholdet mellem destilleret vand og den makroporøse harpiks er(5–10) : 1, og volumenforholdet mellem ethanolopløsningen og den makroporøse harpiks er(3–9) : 1.

8. Uddraget

8. Cistanche-ekstrakt til forbedring af knoglemineraltæthed, kendetegnet ved, at det er fremstillet ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7.

9. Aktivt markørindhold

9. Cistancheekstrakt ifølge krav 8, hvor det totale indhold af echinacosid og acteosid er25-30 vægt%, ekskl. 25 vægt%.

10. Ansøgning

10. Anvendelse af Cistanche-ekstrakten ifølge et hvilket som helst af kravene 8-9 til fremstilling af et produkt til forbedring af knoglemineraltæthed, hvor koncentrationen af ​​Cistanche-ekstrakten i produktet er12,5-25 ug/ml.

 

Teknisk område

Den foreliggende opfindelse angår områdetmedicinske formuleringer, og vedrører specifikt enCistanche-ekstrakt til forbedring af knoglemineraltæthed, densforberedelsesmetode, ogapplikationer.

Baggrund

Cistanche henviser til den tørrede kødfulde stængel med skælblade fra Orobanchaceae-planterneCistanche deserticola YC MaellerCistanche tubulosa (Schenk) Wight. Cistanche har flere aktiviteter som f.eksimmunregulering, anti-inflammatorisk, mod træthed, antioxidant, neurobeskyttende, ogstøtte til reproduktive system.

Phenylethanoid glycosider (PhGs)-medechinacosideogakteosid (verbascosid)at være de vigtigste PhG'er i Cistanche - er vigtige bestanddele.Echinacosidehar vist sig at have en effekt påforbedring af knoglemineraltætheden. Imidlertid fandt vi ud af, at den knogletæthedsforbedrende effekt af Cistanche-ekstrakter erikke udelukkende korreleret med echinacoside indhold. Simpelthen styring af echinacoside-indholdikke kan sikreat uddraget vilstabiltudøve en knogletæthed-forbedrende effekt. Derfor er det afgørende at udvikle et Cistanche-ekstrakt og en tilberedningsmetode, der kanstabiltlevere den ønskede knogletæthed-understøttende effekt.

Kinesisk opfindelse patentansøgningCN102441040Abeskriver en fremstillingsmetode for totale phenylethanoidglycosider fra Cistanche via pulverisering, ekstraktion, makroporøs harpiksadsorption, eluering, koncentration osv. Under svagt sure forhold (pH 2-4) er stabiliteten af Cistanche phenylethanoidglycosider væsentligt forbedret, og den resulterende andel af total > glycosid og echinaglycosid kombineres. 90 %. Det verificerer dog ikke, om produktet kanstabiltforbedre knoglemineraltætheden.

Kinesisk opfindelse patentansøgningCN105111255Abeskriver en fremgangsmåde til ekstraktion og separation af echinacosid og acteosid fra Cistanche, der anvender 75 % ethanol som ekstraktionsopløsningsmiddel, AB-8 makroporøs harpiks som pakningsmateriale og 55 % ethanoleluering, hvilket giver en Cistanche-ekstrakt med echinacosid > 25 %, akteosid > 10 %, og total PhGs > 8 %. Det kan dog stadig ikke garantere enstabilknogletæthed-forbedrende effekt.

 

Sammenfatning af opfindelsen

At udvikle en Cistanche-ekstrakt- og fremstillingsmetode, der kanstabiltunderstøtter forbedret knoglemineraltæthed, tilvejebringer opfindelsen:

Første aspekt: ​​Forberedelsesmetode

Fremgangsmåde til fremstilling af et Cistanche-ekstrakt til forbedring af knoglemineraltæthed, omfattende:

knusendeCistanche tubulosafor at opnå råpulver;

ekstrahering af det rå pulver med destilleret vand, filtrering, centrifugering og koncentrering for at opnå en koncentreret opløsning;

udfører udvinding; koncentrering af den nedre fase for at fjerne urenheder; fortynding for at opnå en ladningsopløsning;

efterbehandling af påfyldningsopløsningen, koncentrering og tørring for at opnå Cistanche-ekstrakten.

I en udførelsesform ledes råpulveret gennem en40 meshsigte.

I en udførelsesform er masse-til-volumen-forholdet mellem råpulver og destilleret vand1 : (15–25).

I en udførelsesform er masse-til-volumen-forholdet1 : 20.

I en udførelsesform er ekstraktionstemperaturen60-100 grader.

I en udførelsesform er ekstraktionstemperaturen80 grader.

I en udførelsesform udføres ekstraktion1-2 gange, 1 time hver gang.

I en udførelsesform udføres filtrering gennem en80 meshfilter.

I en udførelsesform er centrifugeringshastigheden3000–4000 r/minog tiden er3-9 min.

I en udførelsesform er centrifugeringshastigheden3500 r/minog tiden er5 min.

I en udførelsesform koncentreres filtratet efter centrifugering ved70 gradertil18%–28%af det oprindelige volumen.

I én udførelsesform er volumenforholdet mellem koncentreret opløsning og ekstraktionsopløsningsmiddel under ekstraktion af den koncentrerede opløsning1 : (1–5).

I en udførelsesform er forholdet1 : 3.

I én udførelsesform omfatter ekstraktionsopløsningsmidlet mindst én afpetroleumsether, ethylacetat, n-hexan eller cyclohexan.

I én udførelsesform udføres ekstraktion sekventielt vhapetroleumsetherefterfulgt afethylacetat.

I en udførelsesform betyder "koncentration med urenhedsfjernelse" at koncentrere den nedre ekstraktionsfase til en pasta, opløse den i300 ml 50 vægt% vandig ethanolat fjerne urenheder, og justere til1,0-1,5 g rå urt pr. mlsom læsseløsning.

I en udførelsesform er ladeopløsningskoncentrationen1,0-1,5 g rå urt/ml vand.

I en udførelsesform omfatter efterbehandlingen gennemføring af ladningsopløsningenmakroporøs harpiks, og elueres derefter sekventielt meddestilleret vandog enethanolopløsning.

I en udførelsesform er belastningsstrømningshastigheden gennem den makroporøse harpiks1-5 ml/min.

I en udførelsesform er harpiksenAB-8 makroporøs harpiksmed et harpiksvolumen på0.93 L.

I en udførelsesform er volumenforholdet mellem destilleret vand og harpiks(5–10) : 1, og volumenforholdet mellem ethanolopløsning og harpiks er(3–9) : 1.

I en udførelsesform er volumenforholdet mellem destilleret vand og harpiks7 : 1, og forholdet mellem ethanolopløsning og harpiks er6 : 1.

I en udførelsesform er ethanolopløsningen80 % (vægt/vægt) vandig ethanol.

Andet aspekt: ​​Uddraget

Opfindelsen tilvejebringer endvidere et Cistanche-ekstrakt fremstillet ved ovenstående fremgangsmåde.

I en udførelsesform er det totale indhold af echinacosid og acteosid25-30 vægt%, eksklusive 25 vægt%.

Tredje aspekt: ​​Brug

Opfindelsen tilvejebringer endvidere anvendelse af Cistanche-ekstraktet til fremstilling af produkter til forbedring af knoglemineraldensiteten, hvor ekstraktkoncentrationen i produktet er12,5-25 ug/ml.

 

Fordele / gavnlige virkninger

Sammenlignet med den kendte teknik har opfindelsen følgende gavnlige virkninger:

Cistanche-ekstraktet indeholder25-30 vægt%total echinacosid og acteosid, og er rig påshikiminsyre, komponenter af phenylpropionsyre-typen, alkaloider, ogfedtsyrer, hvilket gør det muligtstabiltstøtte forbedring af knoglemineraltæthed.

Inden for12,5-25 ug/mlkoncentrationsområde, fremmer ekstraktet spredning afMC3T3-E1celler med fremragende proliferativ virkning.

Ekstraktet viser den samme dosisrelaterede tendens til at fremme celleproliferation ogALP aktivitet, og kan stabilt fremme spredning og differentiering. Ved at fremme osteoblastmineralisering viser det en bedre effekt end den positive kontrol17 -østradiol.

Ekstraktet stimulerer osteoblast-specifikke transkriptionsfaktorerRunx2ogOsx, øger osteoblastdifferentiering og fremmer ekspression af osteogene markørerOPNogOCN, hvorved knogledannelsen fremmes. Det øges ogsåBmp2 mRNAudtryk for at forbedre osteoblastdifferentiering og ny knogledannelse ved at aktivereBMP/Smad pathway; desuden ved at regulereLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA, ogWnt3 mRNA, aktiveres denWnt/ -catenin signalering, påvirker nedstrøms transskriptionsfaktorekspression og fremmer osteoblastdifferentiering og knogledannelse.

Fremstillingsmetoden giver et ekstrakt indeholdende phenylethanoidglycosider (echinacosid og acteosid), shikiminsyre og phenylpropionsyrer, alkaloider og fedtsyrer. Disse komponenter tillader tilsammen ekstrakten at udvise konsekvent dosisafhængighed i proliferation, differentiering og mineralisering, hvilket muliggør stabile knogletæthed-understøttende effekter.

 

Kort beskrivelse af tegningerne

[0035] Fig . 1: Effekt af ekstrakt (eksempel 1) på MC3T3-E1 celleproliferation
Fig. 2: Effekt af ekstrakt (eksempel 2) på MC3T3-E1 celleproliferation
Fig. 3: Effekt af ekstrakt (eksempel 3) på MC3T3-E1 celleproliferation
Fig. 4: Effekt af ekstrakt (eksempel 1) på ALP-aktivitet
Fig. 5: Effekt af ekstrakt (eksempel 2) på ALP-aktivitet
Fig. 6: Effekt af ekstrakt (eksempel 3) på ALP-aktivitet
Fig. 7: Billeder af Alizarin Red-farvning af osteoblastmineralisering (eksempel 2)
Fig. 8: Kvantitative resultater af osteoblastmineralisering (eksempel 2)
Fig. 9–12: Effekter af eksempel 2 på Runx2, Osx, Opn, Ocn mRNA-ekspression
Fig. 13: Effekt af eksempel 2 på Bmp2-mRNA-ekspression (BMP/Smad)
Fig
Fig. 17–18: Effekter af eksempel 2 på Osx- og RUNX2-proteinekspression

 

Detaljeret beskrivelse / udførelsesformer

Eksempel 1

En fremstillingsmetode omfatter:

knusendeCistanche tubulosa, der passerer gennem en 40-mesh sigte for at opnå200 grå pulver;

udvinding meddestilleret vand ved 5× masse(som beskrevet), udtræk kl75 graderfor2 gange, 1 time hver, koncentrerer sig kl70 gradertil et koncentrationsforhold på1 : 2.2for at opnå en koncentreret opløsning;

tilsætning af absolut ethanol til den koncentrerede opløsning for graderet ethanolfældning med endelige ethanolmassekoncentrationer på20%, 40%, 60%, 80%, udfald kl5 grader i 24 timeropsamling af supernatanten efter80 vægt%ethanoludfældning;

koncentrering og tørring kl70 graderfor at opnå Cistanche-ekstraktet, med et udbytte på20.75%.

Eksempel 2

En fremstillingsmetode omfatter:

knusendeCistanche tubulosaat opnå240 grå pulver;

ekstrahering med destilleret vand, filtrering, centrifugering og koncentrering for at opnå en koncentreret opløsning;

ekstrahering af den koncentrerede opløsning; koncentrering af den nedre fase for at fjerne urenheder; fortynding for at opnå en ladningsopløsning;

efterbehandling af ladeopløsningen; koncentrering og tørring kl70 graderfor at opnå ekstraktet, med et udbytte på19.69%.

Råpulveret passerer gennem en 40 mesh sigte.
Masse/volumenforholdet mellem råpulver og destilleret vand er1 : 20.
Ekstraktionstemperaturen er80 grader.
Ekstraktion udføres1-2 gange, 1 time hver.
Filtrering sker gennem en80 meshfilter.
Centrifugering er3500 r/min i 5 min.
Koncentration efter centrifugering: koncentrer kl70 gradertil20%af det oprindelige volumen.
Under ekstraktion er volumenforholdet mellem koncentreret opløsning og opløsningsmiddel1 : 3.
Ekstraktion udføres sekventielt medpetroleumsetherogethylacetat.
Den nederste fase koncentreres til en pasta og opløses i300 ml 50 vægt% vandig ethanolat fjerne urenheder.
Koncentration af ladeopløsning:1,0 g rå urt/ml vand.
Efterbehandling: Passer gennem makroporøs harpiks, eluer med destilleret vand og derefter ethanolopløsning.
Flowhastighed gennem harpiks:3 ml/min.
[0051] Harpiks:AB-8, harpiksvolumen0.93 L.
Volumenforhold mellem destilleret vand og harpiks:7 : 1. Ethanol-opløsning-til-harpiks-forhold:6 : 1.
Ethanolopløsning:80% (w/w)vandig ethanol.

 

Klik for at få flere detaljer om cistanche fabrik

Eksempel 3

En fremstillingsmetode omfatter:

knusendeCistanche tubulosa, der passerer gennem en 40-mesh sigte for at opnå120 grå pulver;

udvinding med12× masseaf50 vægt% vandig ethanol, udvinding kl70 grader, 2 gange, 1 time hver, koncentrerer sig kl70℃til et forhold på1 : 2.5for at opnå en koncentreret opløsning;

tilsætning af vand for at justere koncentrationen til0,2 g rå urt/ml vand, centrifugering kl3500 r/min i 5 mintage supernatanten som påfyldningsopløsningen;

passerer gennem makroporøs harpiks; sekventiel eluering med destilleret vand og ethanolopløsning; opsamling af ethanolelueringen og koncentrering/tørring kl70 graderfor at opnå ekstraktet med et udbytte på24.30%.

[0054] Harpiks:HPD750, harpiksvolumen0.93 L.
Forholdet mellem destilleret vand og harpiks:3 : 1. Ethanol-opløsning-til-harpiks-forhold:4 : 1.
Ethanolopløsning:30% (w/w)vandig ethanol.

 

Præstationstest

1.1 Celleproliferationsassay

Osteoblaster er de vigtigste funktionelle celler, der er ansvarlige for knogledannelse, hvilket involverer proliferation af præ-osteoblaster, produktion af knoglematrix og endelig differentiering. DeMC3T3-E1cellelinje bruges almindeligvis til at studere osteogen aktivitet. Osteoblastdifferentiering involverer proliferation, differentiering og mineralisering, manifesteret som øget præ-osteoblastantal, modning til osteoblaster og dannelse af ny knoglematrix.

Alkalisk fosfatase (ALP)er et osteoblastfænotyperelateret protein, der kan påvises under celleproliferation og matrixmodning og er en almindeligt anvendt tidlig markør for osteoblastdifferentiering.

Ved at evaluere MC3T3-E1-proliferation og ALP-aktivitet blev den osteogenese-fremmende aktivitet af ekstrakterne fremstillet i eksempel 1-3 derfor sammenlignet.

MC3T3-E1-celler blev genoplivet og passeret. Efter stabilisering blev cellerne fordøjet, centrifugeret og opsamlet. Celletætheden blev justeret, så hver 100 μL indeholdt 5x1035 x 10^35x103 celler og blev podet i en 96-brønds plade. Efter kultur natten over blev mediet erstattet med komplet medium indeholdende eksempel 1-3 ekstrakter i koncentrationer på6,25, 12,5, 25 og 50 ug/mleller indeholdende0,1 M østradiol(positiv kontrol), eller medium alene (blindkontrol), og dyrket til48 h. Under lysbeskyttede forhold blev MTT-stamopløsning (10%-20% af brøndvolumenet) tilsat, inkuberet i4 hi en CO2-inkubator, medium fjernet, og200 μL DMSOtilsat for at opløse formazan. OD-værdier blev målt til490 nm.

Resultater: Fig. 1 (Eksempel 1), Fig. 2 (Eksempel 2), Fig. 3 (Eksempel 3).

Celleproliferationshastighed (%)=OD(Eksempel 1-3)-OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\tekst{Eksempel 1-3}) - OD(\\tekst{Blank})}{OD(\\tekst{Blank})} \\gange 100)\\%OD(Blanke 1–3)−OD(Blank)​×100 %

[0059] Som vist i fig. . 1-3 fremmede den positive kontrol MC3T3-E1-proliferation. Eksempel 1 fremmede proliferation ved 6,25, 12,5 og 25 ug/ml; proliferationshastigheden ved 12,5 ug/ml var 1,4 x den for den positive kontrol, men uden signifikant forskel (P > 0,05). Eksempel 2 fremmede proliferation ved 6,25, 12,5, 25 og 50 ug/ml; ved 12,5, 25 og 50 ug/ml var dens virkninger overlegen i forhold til den positive kontrol (P < 0,01 eller P < 0,001), med proliferationshastigheder 2,55x, 3,46x og 2,59x af den positive kontrol. Eksempel 3 fremmede proliferation ved 6,25, 12,5, 25 og 50 ug/ml; ved 12,5, 25 og 50 ug/ml var den overlegen i forhold til den positive kontrol (P < 0,01 eller P < 0,001), med proliferationshastigheder 1,40x, 1,76x og 0,93x af den positive kontrol. Dette indikerer, at eksempel 2 havde den bedste virkning på at fremme MC3T3-E1-proliferation.

1.2 ALP-aktivitetsanalyse

ALP-aktivitet blev målt under anvendelse af et ALP-assay-kit. Stamkoncentrationen af ​​p-nitrophenol var 10 mM, og standardkurvekoncentrationerne var 0, 0,02, 0,04, 0,08, 0,12, 0,16, 0,2 og 0,25 mM, fremstillet ved gradientfortynding med detektionsbuffer.

For hver prøvebrønd i en 96-brønds plade blev der tilsat 49 μL detektionsbuffer, 1 μL protein ekstraheret fra de behandlede MC3T3-E1-celler (fra afsnit 1.1) og 50 μL kromogent substrat (tilsat sidst). Reaktionen fortsatte i 30 minutter i inkubatoren beskyttet mod lys, afsluttet ved tilsætning af 100 μL stopopløsning, og absorbans målt kl.405 nm. ALP-aktivitet blev beregnet ud fra standardkurven.

Resultater: Fig. 4 (Eksempel 1), Fig. 5 (Eksempel 2), Fig. 6 (Eksempel 3).

[0061] ALP-aktivitet (U/L)=(relativ molær koncentration af protein) × 1000 × 100 / 30
(1000 for molær enhedsomdannelse; 100 for totalt reaktionsvolumen; 30 for 30 minutters reaktionstid)

ALP er en tidlig markør for MC3T3-E1 differentiering. Fig. 4–6 viser, at den positive kontrol øgede ALP-aktiviteten. Eksempel 1 fremmede ikke ALP-aktivitet. Eksempel 2 øgede ALP-aktivitet ved 12,5, 25 og 50 ug/ml; ved 25 og 50 ug/ml var forskelle i forhold til blanke signifikante (P < 0,01). Eksempel 3 øgede ALP-aktivitet ved 12,5 og 25 ug/ml (P < 0,001), men med stigende koncentration faldt forstærkningen. Dette indikerer, at kun eksempel 2 og 3 øgede ALP-aktivitet og understøttede differentiering.

Samlet set viste kun eksempel 2 dosis-positiv korrelation i både MC3T3-E1-proliferation og ALP-aktivitet ved 12,5 og 25 ug/ml. Eksempel 3 viste dosis-positiv korrelation for proliferation, men dosis-negativ korrelation for ALP. Til sammenligning er eksempel 2 mere egnet til at forbedre knoglemineraltætheden.

1.3 Mineralisering (Alizarin rød farvning) af eksempel 2

Da eksempel 2 viste den bedste aktivitets- og dosiskorrelation sammenlignet med eksempel 1 og 3, blev der udført mineraliseringsforsøg for yderligere at vurdere dets virkning.

MC3T3-E1-celler blev behandlet efter 72 timers dyrkning med eksempel 2-ekstrakt kl.12,5, 25 og 50 ug/ml, inkuberet ved 37 grader for14 days(baseret på calciumknudedannelse), med medium ændringer hver 2. dag. Alizarin Red-farvning blev udført: medium fjernet, celler fikseret med 10 % neutral formalin (300 μL/brønd) i 30 minutter, skyllet, farvet med 0,1 % Alizarin Red (300 μL/brønd) i 30 minutter (stuetemperatur, beskyttet mod lys), og vasket, indtil der ikke var nogen rød farve tilbage. Der blev taget billeder. Derefter blev 10% cetylpyridiniumchloridopløsning (400 μL/brønd) tilsat og rystet i 1 time for at opløse forkalkede knuder. Den opløste opløsning blev overført til en 96-brønds plade (100 μL/brønd) og OD målt kl.562 nmat beregne mineraliseringshastigheden. Fotos: Fig. 7; kvantitative resultater: Fig. 8.

[0065] Mineraliseringshastighed (%)=OD(Eksempel 2)−OD(Blank)OD(Blank)×100%\\frac{OD(\\tekst{Eksempel 2}) - OD(\\tekst{Blank})}{OD(\\tekst{Blank})} \\ gange 100\\%OD(Blank) OD(Eksempel(Blank)

[0066] Fig . 7 viser, at antallet af calciumknuder steg sekventielt med koncentration i forhold til blank. Fig . 8 indikerer, at eksempel 2 fremmede mineralisering på en koncentrationsafhængig måde ved 12,5, 25 og 50 ug/mL, med den stærkeste effekt ved 50 ug/mL, signifikant bedre end den positive kontrol (P < 0,001). Fordi mineraliserede knuder repræsenterer det sidste trin af osteoblastdifferentiering, bekræfter disse resultater yderligere den knogletæthed-understøttende virkning af eksempel 2 og viser dens stabile aktivitet. Eksempel 2 var overlegen i forhold til østradiol, hvilket indikerer potentiel værdi for knoglesundhedsprodukter.

Genekspression og pathway-mekanisme (eksempel 2)

Eksempel 2-ekstrakt (12,5, 25, 50 ug/ml) blev påført MC3T3-E1-celler i 3 dage. RNA-ekstraktion, kvantificering, omvendt transkription (20 μL system; 800 ng RNA-input) og qRT-PCR blev udført for at kvantificere relative ekspressionsniveauer afRunx2 mRNA, Osx mRNA, Opn mRNA og Ocn mRNA. Resultater: Fig. 9–12.

Runx2 og Osx er vigtige downstream-regulatorer i BMP-signalering, hvilket inducerer osteoblastdifferentiering. Runx2 er vigtig i den tidlige forpligtelsesfase, mens Osx fungerer i terminal differentiering. OPN og OCN er vigtige indikatorer for osteoblastaktivitet og vævsmineralisering. Fig. 9-12 viser, at eksempel 2 øgede den relative ekspression af disse markører, hvilket understøtter forbedret osteoblastdifferentiering og knogledannelse.

Eksempel 2 opreguleretBmp2 mRNA(Fig. 13), der angiver aktivering afBMP/Smad pathway, som understøtter osteoblastdifferentiering og ny knogledannelse.

Eksempel 2 øget relativ ekspression afLrp5 mRNA, Lrp6 mRNA og Wnt3 mRNA(Fig.. 14–16), understøtter aktivering afWnt/ -catenin signalering, som er tæt forbundet med osteoblastproliferation, differentiering og knogledannelse.

Proteinekspression (eksempel 2)

Western blot-analyse viste, at eksempel 2 stegOsxogRUNX2proteinekspression (Fig. 17–18), hvilket indikerer regulering på både transkriptionelle og translationelle niveauer for at fremme osteoblastdifferentiering.

Disse aktivitetsforsøg viser, at eksempel 2 gav den bedste proliferationsfremmende virkning og var det eneste med ensartet dosiskorrelation for både proliferation og ALP. Eksempel 2 var også overlegen i forhold til østradiol med hensyn til at fremme MC3T3-E1-proliferation og mineralisering med sammenlignelige differentieringseffekter, hvilket tyder på optimalt knogletæthed-understøttende potentiale.

 

Test af kemisk sammensætning

6.1 Phenylethanoid Glycosider Indhold

Med henvisning til "Cistanche"-analysemetoden i den kinesiske farmakopé blev echinacosid- og acteosidindholdet i eksemplerne 1-3 målt (resultaterne vist i tabel 1). Baseret på echinacosid, acteosid og totale PhG'er var tendensen konsistent: Eksempel 3 > Eksempel 1 > Eksempel 2, og acteosid i eksempel 3 var henholdsvis 3,85× og 4,27× af eksempel 1 og 2. Kombination af aktivitets- og indholdsresultater indikerer, at echinacosid og acteosid alene ikke direkte bestemmer de osteogene virkninger.

 

Tabel 1. Indhold af Echinacosid og Acteosid i Cistanche-ekstrakter (%)

Eksempel (eksempel)	Echinacoside (%)	Acteosid / Verbascoside (%)	I alt (%)
Eksempel 1	28.68	1.63	30.31
Eksempel 2	26.27	1.47	27.74
Eksempel 3	30.39	6.27	36.66

 

6.2 Andre komponenter (UPLC/Q-TOF/MS)

UPLC/Q-TOF/MS blev anvendt til at sammenligne kemiske komponenter blandt eksemplerne 1-3. Svarværdierne er vist i tabel 2.

Foruden echinacosid og acteosid indeholdt eksempel 2 yderligerekomponenter af shikiminsyre- og phenylpropionsyre-typen, og ogsåalkaloider. Sammenlignet med eksempel 1 og 3 havde eksempel 2 11 phenylpropionsyre/shikiminsyre-relaterede komponenter med de højeste responser, herunder:

Tabel 2. UPLC/Q-TOF/MS responsværdier for nøglekomponenter i cistancheekstrakter (eksempel 1–3)

注:原表为"响应值(responsværdi)";我保留为纯数值,不加单位(与图表一致).表内刄为2绾Shikiminsyre og phenylpropionsyrederivater(莽草酸及苯丙酸类)与 Alkaloider(生物碱).

A. Shikiminsyre og phenylpropionsyrederivater

Forbindelse	Eksempel 1	Eksempel 2	Eksempel 3
Isodanphenolsyre B (异丹酚酸B)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
p-Hydroxyphenylpropionsyre (对羟基苯丙酸)	2,897,237.374	6,144,507.902	1,139,582.918
Shikiminsyre (莽草酸)	6,539,932.014	8,883,034.928	7,442,038.152
(2R)-2-[(E)-3-[3-[(lR)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyphenyl)	1,514,590.932	5,985,000.378	5,279,315.212
Benzoylacetone (苯甲酰丙酮)	4,235,952.540	4,526,539.189	4,297,281.060
Epipinoresinol 4′-O- -D-glucosid (表丁香树脂酚 4'-O- -D-葡萄糖苷)	2,758,386.748	4,338,477.068	1,182,637.856
Yangmei Changshan glycosid* (杨梅常山苷)	713,259.014	9,202,359.822	841,791.016
Jionoside A1 (焦地黄苯乙醇苷A1)	2,184,856.679	3,736,929.302	3,098,713.743
3,4-dimethylbenzoesyre (3,4-2甲基苯甲酸)	585,269.7562	1,386,349.28	1,400,433.204
Robustaside D	1,693,753.421	3,272,248.064	4,236,657.164
7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytetrahydropyran-2-yl]oxymethyl]tetrahydropyran-2-yl]oxychromen-2-on	4,489,728.765	1,167,879.841	824,633.4

 

---

B. Alkaloider

Forbindelse	Eksempel 1	Eksempel 2	Eksempel 3
Verticine (野百合碱)	1,306,481.28	524,919.97	4,057,704.757
Dihydrocoptisin (氢化可他宁碱)	6,406,217.365	9,533,850.521	4,649,410.535
Thymin (胸腺嘧啶)	2,658,397.084	2,715,160.269	554,956.4602
Gelsemin (钩吻碱)	3,698,263.919	1,554,195.385	5,144,366.562
Yohimbine (育亨宾)	3,929,806.438	1,286,932.427	9,431,924.132

isodanphenolsyre B,

p-hydroxyphenylpropionsyre,

(2R)-2-[(E)-3-[3-[(1R)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydrobenzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyphenyl)

benzoylacetone,

epipinoresinol 4'-O- -D-glucosid,

myricetin-relateret glycosid (som anført),

jonoside A1,

3,4-dimethylbenzoesyre,

robustaside D,

7-[(2S,3R,4S,5S,6R)-3,4,5-trihydroxy-6-[[(2S,3R,4S,5R)-3,4,5-trihydroxytetrahydropyran-2-yl]oxymethyl]tetrahydropyran-2-yl]oxychromen-2-on.

Det indeholdt også 5 alkaloider, herunder:

verticine,

dihydrocoptisin (som anført),

thymin,

gelsemin-relateret alkaloid (som anført),

yohimbine.

Baseret på sammenlignende resultater af proliferation/ALP-aktivitet, phenylethanoid-glycosid-assays og kemisk profilering kan det konkluderes, at phenylethanoid-glycosider (echinacosid og acteosid), shikimic/phenylpropionsyrer, alkaloider og terpenoid-ekstrakter i fællesskab udgør den specifikke dosis-sammensætning, der udgør den afhængige sammensætning af terpenoider. (12,5-25 ug/mL) på tværs af proliferation, differentiering og mineralisering, hvilket muliggør stabile knogletæthedsunderstøttende effekter.

Tabel 2: reaktionsværdier for komponenter.
Opfindelsen tilvejebringer ved fremgangsmåden i eksempel 2 et Cistanche-ekstrakt med total echinacosid + acteosid > 25% og berigede shikimin-/phenylpropionsyrer og alkaloider, hvilket muliggør stabile knogletæthedsunderstøttende virkninger. Inden for 12,5-25 ug/mL fremmer det MC3T3-E1-proliferation, -differentiering og -mineralisering på en dosisforøgende måde med ensartet dosiskorrelation, hvilket understøtter bedre og mere stabile knoglesundhedsresultater og muliggør brug i produkter relateret til forbedring af knoglemineraltæthed.