Cistanche Deserticola-polysaccharider afhjælper kognitiv tilbagegang og forbedrer hukommelsen hos aldrende modelmus

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yuan Gao1,*, Bing Li1,*, Hong Liu1, Yajuan Tian2, Chao Gu1, Xiaoli Du1, Ren Bu1, Jie Gao1, Yang Liu1, Gang Li1

ABSTRAKT

Nylige beviser tyder på, at ændringer i tarmmikrobiota-hjerneaksen kan føre til kognitiv svækkelse med aldring. I denne undersøgelse observerede vi, at langvarig administration af D-galactose til mus inducerede kognitiv tilbagegang, tarmmikrobiel dysbiose, perifer inflammation og oxidativt stress. I denne model for aldersrelateret kognitiv tilbagegang forbedrede Cistanche deserticola polysaccharides (CDPS) den kognitive funktion i D-galactose-behandlede mus ved at genoprette tarmens mikrobielle homeostase og derved reducere oxidativt stress og perifer inflammation. De gavnlige virkninger af CDPS i disse aldrende modelmus blev afskaffet gennem ablation af tarmmikrobiota med antibiotika eller immunsuppression med cyclophosphamid. Serummetabolomisk profilering viste, at niveauer af kreatinin, valin, L-methionin, o-toluidin, N-ethylanilin, urinsyre og prolin blev ændret i de aldrende modelmus, men blev genoprettet af CDPS. Disse resultater viste, at CDPS forbedrer kognitiv funktion i en D-galactose-induceret ældningsmodel hos mus ved at genoprette homeostase af tarmmikrobiota-hjerneaksen, som lindrede en aminosyreubalance, perifer inflammation og oxidativt stress. CDPS viser således terapeutisk potentiale for patienter med hukommelses- og indlæringsforstyrrelser, især dem, der er relateret til tarmmikrobiel dysbiose.

Cistancheurt

INTRODUKTION

Langvarig administration af D-galactose (D-gal) og berylliumsalte inducerer aldring i eksperimentelle dyremodeller og in vitro primære cellekulturer og bruges til at identificere mekanismer, der ligger til grund for den naturlige ældningsproces [1-4]. Tidligere undersøgelser viser, at kognitivt fald i D-galactose-induceret aldrende modelmus er relateret til reducerede proteinniveauer for nervevækstfaktor (NGF) og øgede reaktive oxygenarter (ROS) i hjernen, som begge forårsager degeneration af hippocampus neuroner og reducerer neurogenese [3, 4]. Nylige undersøgelser har også vist, at sammensætningen og antallet af menneskets tarmmikrobiota ændres væsentligt under ældningsprocessen[5].

Cistanche deserticola er en urt, der hovedsageligt vokser i den nordvestlige ørkenregion i Kina og bruges i traditionel kinesisk medicin. Det er almindeligvis kendt som "ørkenens ginseng." Cistanche deserticola-ekstrakter indeholder flere farmakologisk aktive forbindelser, herunder phenylethanoidglycosider, iridoider, lignose, oligosaccharider, polysaccharider og aminosyrer; disse forbindelser er forbundet med antiinflammatoriske, antioxidative, anti-ældende, neurobeskyttende og immunmodulerende egenskaber [6, 7]. For eksempel er polysaccharider udvundet fra Cistanche deserticola blevet brugt i traditionel kinesisk medicin til behandling af tyktarmskræft [8]. En bred vifte af svagt giftige polysaccharider med nyttige bioaktiviteter er blevet isoleret fra flere organismer, såsom Chuanqiong polysaccharid, Ganoderma lucidum polysaccharide og Lycium barbarum polysaccharide [9-11]. CDA 0.05 er en galactoglucan isoleret fra Cistanche deserticola, der fremmer væksten af ​​adskillige gavnlige tarmbakterier, herunder adskillige arter af Bacteroides og Lactobacillus [12].

De underliggende mekanismer i den normale ældningsproces er også impliceret i adskillige menneskelige sygdomme, såsom neurodegenerative lidelser, koronar aterosklerose, type 2-diabetes (T2DM) og hypertension [13, 14]. Nylige undersøgelser har vist, at ændringer i tarmfloraen spiller en væsentlig rolle i menneskets aldring [15]. Adskillige undersøgelser har vist, at langvarig administration af D-galactose i eksperimentelle mus og rotter efterligner den normale ældningsproces og er en nyttig model til at studere aldringsrelaterede fænotyper såsom kognitionsfald [16]. Desuden viser D-galactose-inducerede aldrende modelmus ændringer i sammensætningen af ​​tarmmikrobiota [17]. Derfor antog vi, at ændringer i tarmmikrobiotasammensætningen kan forårsage kognitivt fald i de D-galactose-inducerede aldrende modelmus, og undersøgte, om Cistanche deserticola polysaccharides (CDPS) kan lindre kognitivt fald ved at genoprette tarmmikrobiota dysbiose.

cistanche stamme

RESULTATER

D-galactose-induceret aldrende modelmus viser kognitiv tilbagegang og tarmmikrobiel dysbiose

Vi analyserede den adfærdsmæssige ydeevne af vildtype (WT) mus og dem, der blev behandlet med 150 mg D-gal pr. kg kropsvægt i 2 måneder (model eller Mod) ved hjælp af ny objektgenkendelse og Morris water maze (MWM) test. De foretrukne indeksværdier i den nye objektgenkendelsestest blev signifikant reduceret i Mod-gruppemusene sammenlignet med WT-gruppemusene (figur 1A, 1B). MWM-testresultater viste, at escape-latenstiden efter den sjette dag var signifikant øget i Mod-gruppen sammenlignet med WT-gruppen (figur 1C, 1D). Desuden blev målplatformkrydsninger og svømmetider inden for målkvadranten signifikant reduceret i Mod-gruppen sammenlignet med WT-gruppen (Figur 1E, 1F). Disse resultater viste et betydeligt fald i indlærings- og hukommelsesevnerne hos de Legal-inducerede aldringsmodelmus.

Vi analyserede derefter forskellene i mængden og sammensætningen af ​​tarmmikrobielle phyla, slægter og arter i fækale prøver af Mod- og WT-grupperne af mus ved hjælp af 16S ribosomalt RNA (rRNA) sekventeringsdata fra fækale prøver. Den dominerende tarmflora i WT- og Mod-gruppemusene var Firmicutes og Bacteroides. Imidlertid var overfloden af ​​Bacteroides signifikant reduceret, og forekomsten af ​​Firmicutes var signifikant øget i Mod-gruppen sammenlignet med WT-gruppen (figur 2A). Dernæst udførte vi lineær diskriminantanalyse (LDA) for at bestemme LDA-effektstørrelse (LEfSe)-score efterfulgt af Kruskal-Wallis og Wilcoxon-test for at evaluere den relative overflod af forskellige taxa i WT- og Mod-gruppemusene. LDA-resultaterne er vist i figur 2B. Desuden konstruerede vi cladogrammer, der viser differentiel berigelse af forskellige slægter og arter, der tilhører Bacteriodes og Firmicutes phyla i WT og modelgrupper (figur 2C). Samlet set viste vores resultater nedsat kognitiv evne og tarmmikrobiel dysbiose i de D-galactose-inducerede aldringsmodelmus.

cistanche sundhedsmæssige fordele: anti-oxidation

CDPS-behandling forbedrer kognitive evner hos de D-gal-inducerede aldrende modelmus

Vi analyserede, om CDPS-behandling lindrer kognitivt fald i D-gal-inducerede aldrende modelmus. I løbet af administrationens 2 måneder blev kropsvægten målt hver anden dag. Kropsvægtene af modellen og CDPS-grupperne af mus var ens (figur 3A). Udfør adfærdseksperimenter efter den sidste dosis. Ny objektgenkendelse og Morris-vandlabyrint-testresultater viste, at korttidshukommelsen var signifikant højere i CDPS-grupperne af mus sammenlignet med modelgruppen af ​​mus; langtidshukommelsen i CDPS-gruppen af ​​mus var højere, men statistisk insignifikant sammenlignet med modelgruppen af ​​mus (figur 3B, 3C). Dette antydede, at CDPS-behandling ophævede tab af kortsigtet objektgenkendelseshukommelse hos D-gal-behandlede mus.

Den rumlige indlæring og hukommelse af disse mus blev evalueret ved Morris-vandlabyrint-testen, og resultaterne viste, at undslippstiden for CDPS-gruppen af ​​mus var sammenlignelig med WT-gruppen af ​​mus og signifikant kortere end Mod-gruppemusene (figur 3D) . Endvidere var escape-latenstider signifikant lavere på den sjette dag efter CDPS-administration sammenlignet med modelgruppen (figur 3E). Svømmetiden inden for målkvadranten var signifikant højere i CH- og CM-grupperne sammenlignet med modelgruppen. CL-gruppen er højere end modelgruppen, men har ingen statistisk signifikans (figur 3F). Desuden var antallet af platformkrydsninger signifikant højere i CM- og CL-grupperne sammenlignet med modelgruppen. CH-gruppen er dog højere end modelgruppen og har ingen statistisk signifikans (figur 3G). Disse resultater viste, at CDPS-behandling forbedrede rumlig indlæring og hukommelse i de D-gal-inducerede aldringsmodelmus.

Figur 1. Forlænget administration af D-galactose inducerer indlærings- og hukommelsessvækkelse hos mus.

Figur 2. Forlænget administration af D-galactose inducerer tarmmikrobiel dysbiose hos mus.

CDPS-behandling genopretter homeostase af tarmmikrobiotasammensætningen i D-galactose-aldrende modelmus

Monosaccharider og polysaccharider er de essentielle næringsstoffer, der er nødvendige for væksten af ​​bakterier [18-21]. Det er også rapporteret, at CDPS regulerer sammensætningen af ​​tarmmikrobiota [22]. Derfor analyserede vi, om CDPS-behandlinger lindrede tarmmikrobielle dysbiose i modelgruppemusene ved at evaluere16S rRNA-sekventeringsdata af afføringsprøver fra WT-, model- og CDPS-grupper af mus.

Først beregnede vi alfa-diversitetsindekser for at evaluere den samlede fækale mikrobiota-rigdom og strukturelle forskel mellem disse grupper. Vi analyserede alfa-diversitetsindekser (-diversitet) såsom observerede arter, Shannon, Chao 1, ACE og Simpson indeksværdier for at bestemme ændringer i sammensætningen af ​​forskellige bakteriearter i fæcesprøverne fra forskellige murine grupper. Indekserne for -diversitet (observerede arter, Shannon, Chao 1, ACE og Simpson indekser) var højere i WT- og CDPS-grupperne af mus sammenlignet med modelgruppen, men statistisk signifikans blev kun observeret for Chao 1-indeksværdierne mellem CM gruppe og Mod gruppe. Det indikerede, at administration med CDPS øger mikrobiom rigdom (figur 4A-4E). Dernæst analyserede vi -diversitetsindekser for at identificere forskelle i tarmmikrobielle arter mellem WT-, model- og CDPS-grupperne af mus ved hjælp af ikke-metrisk multidimensionel skalering (NMDS), Principal Coordinates Analysis (PCoA) og Principal Component Analysis (PCA) . PCA viste variationer i den tarmmikrobielle sammensætning af modelgruppemusene under ældningsprocessen, herunder dimensionsreduktion og vedligeholdelse af mønstre og tendenser (figur 4F). Forskellene i den fækale mikrobiota mellem WT-, model- og CDPS-grupperne blev identificeret baseret på PCoA af de uvægtede UniFrac-afstande for 16S rRNA-generne (figur 4G). Klyngeanalyse viste signifikante forskelle i NMDS mellem modelgruppen og WT- og CDPS-grupperne (figur 4H).

Vi evaluerede top 10 phyla af tarmmikrobiotaen og fandt ud af, at overfloden af ​​Bacteroides phyla var signifikant højere i CH-, CM- og CL-grupperne sammenlignet med modelgruppen (figur 4I). Dette antydede, at CDPS genoprettede homeostasen af ​​tarmmikrobiotaen i D-gal-behandlede mus. Kladogrammerne viste differentiel berigelse af forskellige slægter og arter, der tilhører Bacteriodes og Firmicutes phyla i WT-modellen og CDPS-grupperne (figur 4J). Som vist i varmekortene reducerede CDPS-behandlinger den relative forekomst af Thermoplasmata, Baciller, uidentificerede Actinobacteria, Fusobacteriia og uidentificerede Elusimicrobia og øgede den relative forekomst af Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, uidentificerede_Anatrosiferias, Nitro- , Erysipelotrichia og uidentificerede_cyanobakterier sammenlignet med modelgruppen (figur 4K). Disse resultater viste, at CDPS-behandling signifikant genoprettede homeostase af tarmmikrobiotaen i de D-gal-inducerede aldringsmodelmus.

Figur 3. CDPS-behandling forbedrer indlæring og hukommelse hos D-gal-aldringsmodelmusene.

CDPS-behandling lindrer neurodegeneration i de D-gal-inducerede aldringsmodelmus ved at reducere oxidativt stress

Vi analyserede derefter virkningerne af CDPS på inflammation ved at analysere serumniveauerne af pro-inflammatoriske cytokiner (IL-2 og TNF-) og antiinflammatoriske cytokiner (IL-4 og IL-10 ) i forskellige grupper af mus. Serumniveauerne af IL-2 og TNF- var signifikant lavere, og serumniveauerne af IL-4 og IL-10 var signifikant højere i CH-, CM- og CL-grupperne sammenlignet med modellen gruppe. Det er vist, at CDPS har antiinflammatoriske virkninger (figur 5A-5D).

Oxidativ stress er forårsaget af den øgede produktion af reaktive oxygenarter (ROS) og er en af ​​de vigtigste faktorer, der fremmer aldring [23]. Derfor analyserede vi virkningerne af CDPS på oxidativ stress i den D-gal-inducerede aldrende musemodel ved at evaluere serumniveauer af antioxidantenzymet, SOD, og ​​lipidperoxidationsproduktet, malondialdehyd (MDA). Serumniveauerne af MDA var signifikant højere, og serumniveauerne af SOD var signifikant reduceret i Mod-gruppen sammenlignet med WT-gruppen, men CDPS-behandling vendte disse virkninger (figur 5E, 5F). Disse resultater viste, at oxidativ stress var forhøjet i de D-gal-inducerede aldringsmodelmus, men blev reduceret ved CDPS-behandling.

Desuden vurderede vi niveauet af oxidativt stress i hjernevævet ved at analysere niveauerne af det avancerede oxiderede proteinprodukt (AOPP), direkte lipidperoxidation (LPO) og MDA samt aktiviteter af antioxidantenzymer såsom glutathionperoxidase (GSH-Px) ) og superoxiddismutase (SOD) i hjernevævshomogenater. Hjernerne fra Mod-gruppemus viste signifikant reducerede aktiviteter af SOD og GSH-PX og signifikant øgede niveauer af AOPP, LPO og MDA sammenlignet med WT-gruppen, men disse effekter blev vendt i CH-, CM- og CL-gruppen (Figur 6A- 6E).

Desuden udførte vi histologisk farvning af hjernesektioner med H&E- og Nissl-farvninger for at vurdere de beskyttende virkninger af CDPS på hjernerne af D-gal-inducerede aldrende modelmus. Mod-gruppens mus viste en signifikant reduktion i det neuronale antal og volumen, øget kløft mellem neuroner, uregelmæssig arrangement af neuroner og nuklear pyknose i hippocampus CA1-regionen sammenlignet med WT-gruppen, men disse patologiske ændringer blev signifikant reduceret ved CDPS-behandlinger ( figur 6F). Disse resultater viste, at CDPS-behandlinger signifikant reducerede oxidativt stress og hjernepatologi i de Dgal-inducerede aldringsmodelmus.

Figur 4. CDPS-behandling genopretter tarmens mikrobielle sammensætning i de D-galactose-inducerede ældningsmodelmus.

CDPS-behandling reducerer perifer inflammation og oxidativt stress ved at opretholde tarmmikrobiel homeostase i D-gal-inducerede modelmus

Dernæst analyserede vi, om ændringerne i sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen var forbundet med øget perifer inflammation og oxidativt stress under aldring. Til dette brugte vi en triple-antibiotisk cocktail (ABX-gruppe) eller cyclophosphamid (Cy-gruppe; se også Materialer og metoder) til at fjerne tarmmikrobiotaen eller inducere immunsuppression i de CDPS-behandlede aldrende modelmus. Antibiotikabehandlingen ophævede de gavnlige virkninger af CDPS-behandling i de aldrende modelmus. Vi observerede svækket indlæring og hukommelse (figur 7A) og ændringer i sammensætningen af ​​tarmmikrobiota (figur 7B, 7C) i ABX-gruppemusene sammenlignet med den CDPS-behandlede gruppe. Ovenstående resultater indikerer, at selv administrationen af ​​CDPS ikke kan øge indlærings- og hukommelsesevnen hos mus efter ændring af tarmfloraen. Desuden observerede vi øgede niveauer af pro-inflammatoriske cytokiner i hjernen og serum fra ABX-gruppemus sammenlignet med CDPS-gruppen (figur 7D-7N). Resultaterne af ABX-gruppen og CY-gruppen viste, at efter at tarmfloraen og immunfunktionen var blevet ødelagt, kunne selv administration af CDPS ikke forbedre indlærings- og hukommelsesevnen hos mus. Disse resultater antydede, at CDPS-behandling mindskede perifer inflammation, oxidativt stress og kognitivt fald i de juridisk-inducerede aldringsmodelmus ved at forhindre tarmdysbiose.

Vi brugte derefter det immunsuppressive lægemiddel, cyclophosphamid [24] til at bestemme inflammationens rolle i de gavnlige virkninger af CDPS. Cyclophosphamid-behandlede CDPS-mus (Cy-gruppe) viste svækket indlærings- og hukommelsesevne, ændringer i tarmmikrobiotasammensætningen og afvigende niveauer af pro- og antiinflammatoriske cytokiner i hjernen og serum sammenlignet med vildtype- og CDPS-gruppemusene. Der er dog ingen betydning sammenlignet med modellen og ABX-gruppen. (Figur 7A–7N). Disse data viser, at ændringer i sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen øger perifer inflammation hos de D-gal-inducerede aldringsmodelmus.

Figur 5. CDPS-behandling modulerer cirkulerende niveauer af pro- og anti-inflammatoriske cytokiner og oxidativ stress-relaterede faktorer i de D-galactose-inducerede aldringsmodelmus.

CDPS forhindrer D-gal-induceret aldring ved at regulere aminosyremetabolismen

Værtens immunsystem er påvirket af metabolitter genereret af tarmmikrobiotaen [25]. De fækale metabolitter repræsenterer en funktionel aflæsning af tarmens mikrobielle metabolisme og tarmens mikrobielle sammensætning[26]. Desuden kommer metabolitter af tarmmikrobiotaen ind i blodcirkulationen og påvirker værtens metabolisme og sundhed [26, 27]. I alt 1058 metabolitter blev identificeret i serumprøver fra FWT-, Mod- og CDPS-mus. Derefter analyserede vi disse metabolitter ved hjælp af BioCyc, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) og Human Metabolome Database (HMDB) og fandt ud af, at 65 metabolitter blev differentielt udtrykt i Mod-gruppen sammenlignet med WT-gruppen. Desuden fandt vi, at niveauerne af 8 metabolitter (kreatinin, valin, L-(-)-Methionin, o-Toluidin, N Ethylanilin, urinsyre, prolin og phenylalanin) var signifikant forskellige blandt WT-, Mod- og CDPS-grupperne. Pathway berigelse analyse af disse 8 metabolitter ved hjælp af MetaboAnalyst [28, 29] viste, at disse metabolitter var relateret til arginin, histidin, arginin, prolin og purin metabolisme (figur 8A, 8B). 7 forskellige metabolitter af MOD-gruppen og CDPS-gruppen i WT-gruppen.

Vi analyserede derefter, om ændringer i aminosyremetabolismen var relateret til ændringer i sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen. Vi observerede, at 7 forskellige metabolitter af WT-, Mod- og CDPS-grupper (kreatinin, valin, L-(-)-Methionin, o-Toluidin, N-Ethylanilin, urinsyre og prolin) var signifikant reduceret i ABX, Cy, og Mod-grupper sammenlignet med WT- og CDPS-grupperne. Desuden er der ingen betydning mellem ABX- og Cy-grupper (figur 8C). Endelig, for at udforske, er der en sammenhæng mellem differentiel metabolisme og andre aldringsrelaterede sygdomme. Vi analyserede korrelationen mellem disse syv differentielt udtrykte metabolitter og humane sygdomme ved hjælp af MetaboAnalyst-databasen og fandt ud af, at disse metabolitter var forbundet med Alzheimers sygdom (p=0.00173; figur 8D, 8E). Samlet set tydede disse data på, at CDPS beskytter mod D-gal-induceret aldring ved at regulere aminosyremetabolismen.

Figur 6. CDPS-behandling reducerer oxidativ stress i hjernen hos D-galactose-inducerede ældningsmodelmus

DISKUSSION

Et progressivt fald i kognitiv funktion er et karakteristisk træk ved aldring. Tidligere undersøgelser viste, at CDPS-behandling signifikant forbedrede indlæring og hukommelse hos de aldrende modelmus [30-33]. I denne undersøgelse viste vi, at CDPS-behandling forbedrede kognitiv funktion ved at hæmme perifer inflammation og oxidativ stress gennem genoprettelse af tarmmikrobiel homeostase i de D-gal-inducerede aldringsmodelmus (figur 9). Sprague-Dawley-rotter fodret med Cistanche-polysaccharider viste øget vækst af gavnlige tarmbakterier og forbedret tarmmikrobiel diversitet [34]. CDA-0.05, et Cistanche-neutralt polysaccharid, forbedrede væksten af ​​probiotiske Lactobaciller [22]. Disse data antydede, at Cistanche-polysaccharider forbedrede homeostasen af ​​tarmbakterier.

I denne undersøgelse viste vi, at CDPS har anti-inflammatoriske virkninger og forbedrer den kognitive evne hos de aldrende modelmus ved at modulere overfloden af ​​tarmbakterieslægter såsom Bacteroidetes, Firmicutes og Proteobacteria. Derfor kan CDP'er være terapeutisk gavnlige for aldringsrelaterede sygdomme ved at omforme sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen [35,36]. Desuden har tidligere undersøgelser vist, at niveauerne af inflammatoriske cytokiner i serum og tyktarm er forbundet med den relative overflod af bakterieslægter såsom Bacteroidetes, Firmicutes og Proteobacteria [37, 38]. Ydermere regulerer tarmens mikrobielle sammensætning hjernens funktion ved at modulere cirkulerende niveauer af flere cytokiner [39-43]. Vores resultater viste, at CDPS-behandling reducerede den relative forekomst af Thermoplasmata, Baciller, uidentificerede Actinobacteria, Fusobacteriia og uidentificerede Elusimicrobia, og øgede den relative overflod af Methanobacteria, Spirochaetia, Deltaproteobacteria, uidentificerede_Deferipharibactereria, Nieroliline, Nieroscuteria, Erysipelotrichia og uidentificerede_cyanobakterier.

Tarmmikrobielle metabolitter frigives til blodbanen og regulerer værtens sundhed og metabolisme [26, 27]. De mikrobielle tarmmetabolitter kan estimeres ved at evaluere fækal metabolitsammensætning, som ændres med ændringer i sammensætningen af ​​tarmmikroberne [44]. Nylige undersøgelser har vist, at plasmaniveauer af citrullin, prolin, arginin, asparagin, phenylalanin og threonin er forbundet med neurodegenerative lidelser, herunder Alzheimers sygdom [45, 46]. Vores undersøgelse viste, at serumniveauer af kreatinin, valin, L-methionin, o-toluidin, N-ethylanilin, urinsyre og prolin var forbundet med D-gal-induceret aldring hos mus.

Cistanche-ekstrakt: anti-Alzheimers sygdom

De medfødte og adaptive arme af immunsystemet spiller en væsentlig rolle i opretholdelsen af ​​værtsmikrobiel homeostase i den intestinale luminale overflade [47]. Den intestinale mikrobiota spiller også en væsentlig rolle i reguleringen af ​​centralnervesystemet (CNS) og immunitet ved at frigive cytokiner og metabolitter til blodbanen [48, 49]. De pro-inflammatoriske cytokiner spiller en nøglerolle i flere neurodegenerative sygdomme [50-52]. For eksempel er aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og glaukom forbundet med ekstracellulær akkumulering af amyloid (A ) og intracellulær aflejring af hyperfosforyleret tau (p tau) og jern i retinale ganglieceller (RGC) [44]. Desuden spiller betændelse en væsentlig rolle i patogenese forbundet med glaukom [53]. Synsforstyrrelser er et tidligt symptom på Alzheimers sygdom (AD) og manifesteres før begyndelsen af ​​kognitiv tilbagegang [54]. Vores undersøgelse viste, at CDPS beskytter mod kognitiv tilbagegang og perifer inflammation ved at opretholde homeostasen af ​​tarmmikrobiotaen.

Der er flere begrænsninger for denne undersøgelse. For det første er forholdet mellem aminosyremetabolisme og sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen ikke velkendt. For det andet kendes CDPS's sammensætning og molekylære struktur ikke. Derfor er fremtidige undersøgelser nødvendige for yderligere at udforske CDPS's regulerende rolle i at lindre AD gennem tarmmikrobiota-hjernesignaleringsaksen.

Som konklusion viste vores undersøgelse, at CDPS forbedrede kognitive evner hos D-gal-inducerede aldringsmodelmus ved at genoprette homeostasen af ​​tarmmikrobiota og derved genoprette aminosyreubalance, perifer inflammation og oxidativt stress. Disse resultater tyder på, at CDPS er et potentielt terapeutisk middel til patienter med indlærings- og hukommelsesforstyrrelser, især dem, der er forbundet med tarmdysbiose.

MATERIALER OG METODER

Udarbejdelse af CDPS

Ca. 1.0 kg renset Cistanche deserticola blev lufttørret i ovnen ved 40 grader C og pulveriseret til råt pulver. Pulveret blev ekstraheret i varm ethanol i 3 timer. Remanensen blev filtreret gennem gaze for at fjerne filtratet og derefter fortyndet med vand (8X) og tilbagesvalet sekventielt i 2 timer, 1,5 timer og 1 time ved 90 grader C. På hvert tidspunkt blev opløsningen centrifugeret for at udskille supernatanten og kombineret med det brun-røde filtrat. Derefter blev filtratet koncentreret under reduceret tryk, afkølet til stuetemperatur, langsomt tilsat til 95 procent ethanol (3X) og fik lov til at stå ved 4 grader C i 24 timer. Derefter blev opløsningen centrifugeret ved 6000 r/min i 20 minutter ved 4 grader C. Bundfaldet blev opsamlet efter gentagelse af vandekstraktion og alkoholudfældning tre gange. Bundfaldet blev rekonstitueret i vand, deproteiniseret, dialyseret og frysetørret for at få råt Cistanche deserticola polysaccharid (CDP'er). Polysaccharidindholdet var mere end 90 procent som vurderet ved ultraviolet spektrofotometri.

cistanche ekstrakt

Dyregruppering og behandlinger

Otte uger gamle Kunming-hanmus (SCXK-licensnr. 2019-0010) blev købt fra SPF Biotechnology Co. Ltd (Beijing, Kina), anbragt i et lys- og temperaturkontrolleret rum og fodret med mad og vand. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Inner Mongolia Medical University. Forsøgene blev udført i henhold til National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.

Efter 1 uges tilpasning til de nye omgivelser blev 120 mus opdelt i følgende 7 grupper: (1) vildtypekontrol (WT); modelgruppe (150 mg/kg/dag D-gal; Mod); (3) CH: D-gal plus 100 mg/kg CDPS; (4) CM: D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (5) CL: D-gal plus 25 mg/kg CDPS; (6) ABX-gruppe: antibiotika plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS; (7) Cy-gruppe: cyclophosphamid plus D-gal plus 50 mg/kg CDPS.

Musene fra model-, ABX-, Cy- og CDPS-grupperne modtog subkutane injektioner af saltvandsopløst 15 0 mg/kg D-gal hver dag i 2 måneder. WT-gruppen blev subkutant injiceret med et tilsvarende volumen saltvand i 2 måneder. CDPS-gruppemusene blev også administreret dagligt med intragastriske injektioner indeholdende 100 mg/kg, 50 mg/kg eller 25 mg/kg CDPS i 2 måneder. ABX-gruppens mus modtog drikkevand med 0,1 mg/ml ampicillin og 0,5 mg/ml streptomycin i 2 måneder foruden D-gal- og CDPS-injektioner. Før indgivelse af D-gal modtog musene injektioner indeholdende 0,1 mg/ml ampicillin, 0,5 mg/ml streptomycin og 0,1 mg/ml colistin i 7 dage i ABX-gruppen. Cy-gruppemusene modtog intraperitoneale injektioner af 20 mg/kg cyclophosphamid hver anden dag (qod) i 2 måneder foruden daglige injektioner af D-gal og CDPS.

Ny objektgenkendelsestest

Udfør adfærdseksperimenter efter den sidste dosis. Objektgenkendelsestesten involverede familiarisering, træning og teststadier. Under familiariseringsstadiet blev mus tilvænnet i et tomt testkammer i 10 minutter i to dage. Derefter, på den tredje dag (træningsdag), blev to genstande af samme størrelse, form og farve (A1 og A2) placeret på modsatte ender af kammeret. Hver mus fik derefter 10 minutter til at udforske de to lignende objekter. Efter 1-time (på den tredje dag) og 24-time (på den fjerde dag) træning-til-test-intervaller, blev et af de lignende objekter (A1 eller A2) erstattet med et B eller C objekt, der er forskellig i størrelse, farve og form på testdagen. Under teststadiet blev hver mus testet i 5 minutter, og det foretrukne indeks blev beregnet for at bestemme hukommelsen af ​​et nyt objekt (B eller C) genkendelse ved hjælp af følgende formel: Præferenceindeks=Tid på objekt B eller C/ (Tid på objekt B eller C plus Tid på objekt A)×100 procent .

Morris vandlabyrint test

Morris vandlabyrint-test blev udført i en rund pool, der var 45 cm i dybden og 90 cm i diameter. Protokollen beskrevet af Ruediger S, et al. (2011) [55] og Wood RA, et al. (2018) [56] var ansat her. Vanddybden i bassinet var 30 cm, og vandets temperatur var 20±1 grad C. Platformen var 6 cm i diameter og 1 cm under vandet. Tiden til træning og test var 60 s hver. Til træning gennemførte vi fire forsøg på hver 60 s med en skjult platform hver dag i fem sammenhængende dage. Hvis platformen ikke blev opdaget af musene i 60 s, blev de ført til platformen og placeret på platformen i 5 s. Under teststadiet blev forsinkelsen til at nå den skjulte platform i trænings- og sondeforsøgssessioner, antallet af krydsninger over den fjernede platformsplacering og den tid, der blev brugt i mål(platform)kvadranten, registreret og analyseret.

ELISA-assays

Serumniveauerne af pro-inflammatoriske cytokiner såsom IL-2(), IL-4, IL-10 og TNF- blev analyseret for hver gruppe mus ved hjælp af ELISA-sæt købt fra Shanghai Yi Li Biological Technology Co., Ltd.(Shanghai, Kina) i henhold til producentens instruktioner. Aktiviteten af ​​antioxidantenzymet, superoxiddismutase (SOD) og niveauer af lipidperoxidationsprodukt, malondialdehyd (MDA), i serumet fra hver gruppe af mus blev analyseret med assaysæt købt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina) . Niveauerne af avancerede oxidationsproteinprodukter (AOPP) i de murine hippocampusprøver blev estimeret ved hjælp af et ELISA-kit fra Shanghai Yi Li Biological Technology Co. Ltd. (Shanghai, Kina) i henhold til producentens instruktioner.

Estimering af oxidativ stress i murine hjerner

Vi homogeniserede 100 mg hippocampusvæv med 0,9 ml iskold saltvand, og homogenatet blev centrifugeret ved 12000 rpm i 30 minutter ved 4 grader C. Proteinindholdet i supernatanten blev analyseret ved hjælp af BCA Protein Assay Kit ( Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kina). Niveauerne af lipidperoxidation (LPO) og malondialdehyd (MDA) og aktiviteterne af GSH-Px og SOD i hippocampusprøverne blev analyseret ved kolorimetri ved hjælp af kits fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina) i henhold til producentens instruktioner.

Cistanche supplement: forbedrer hukommelsen

Tarmmikrobiotasammensætning

Fækale prøver blev indsamlet fra alle mus og øjeblikkeligt opbevaret ved -80 grad C. V3 plus V4-regionen af ​​16S rRNA-genet blev sekventeret ved hjælp af Illumina MiSeq (Beijing Novogene Co. Ltd., Beijing, Kina) og analyseret ved hjælp af QIIME åben platform for at bestemme tarmmikrobiotaprofilerne.

LC/MS analyse af serummetabolitter

Serumprøver blev inkuberet i 10 minutter med forkølet methanol i et forhold på 1:3 for at præcipitere proteinerne. Prøverne blev centrifugeret ved 12000 r/min i 15 minutter ved 4 grader C. Supernatanterne blev analyseret ved Thermo Scientific Dionex UltiMate3000 Rapid Resolution Liquid Chromatography og QExactive massespektrum. De kromatografiske betingelser er vist i tabel 1. Analytterne blev separeret i en XBridge BEH Amide kromatografisøjle (2,1 x 100 mm; Waters Co., Milford, MA, USA) under anvendelse af 0,1 procent myresyre og acetonitril som mobile faser A og B , henholdsvis. Strømningshastigheden blev indstillet til 0,4 ml/min., injektionsvolumenet var 5 µl, og søjletemperaturen blev sat til 25 grader C (tabel 1). Massespektrumsignalerne blev opnået under anvendelse af positive og negative ion-scanningstilstande. Ionsprayspændingen og andre specifikke MS-parametre er vist i tabel 2.

Statistisk analyse

Statistical analysis was performed using the SPSS 13.0 software (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA). The data plots were generated using GraphPad Prism 8.0.1 (GraphPad Software, La Jolla, California, USA). Partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) of SIMCA-P+13.0 (Umetrics, AB, Umeå, Sweden) and Principal Components Analysis (PCA) were used to assess normalized GC-MS spectral data. Variable Influence on Projection (VIP) values were used to identify significant variables with VIP values >1.0 og s< 0.05.="" these="" significant="" variables="" were="" used="" to="" identify="" the="" spectral="" peaks.="" the="" student's="" t-test="" was="" used="" to="" analyze="" the="" differences="" between="" two="" groups="" of="" data.="" the="" taxonomic="" rank="" differential="" between="" groups="" was="" determined="" using="" student's="" test="" (v3.1.2;="" r="" programming="" language).="" the="" correlation="" between="" genera="" abundance="" and="" mouse="" behavior="" was="" calculated="" using="" spearman="" correlation="" coefficients="" (r="" language).="" p="" <="" 0.05="" was="" considered="" statistically="" significant.="" the="" data="" are="" presented="" as="">