Kronisk nyresygdom øger cerebrale mikroblødninger hos mus og mennesker

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Wei Ling Lau1,2 & Ane CF Nunes 1 & Vitaly Vasilevko3 & David Floriolli4 & Long Lertpanit 1 & Javad Savoj 1 & Maria Bangash 1 & Zhihui Yao 1,5 & Krunal Shah6 & Sameen Naqvi 1 & Annlia Paganini-Hill6 & Nosratola D. Vaziri 1 & David H Cribbs3 & Mark Fisher6,7

Modtaget: 25. august 2018 /Revideret: 28. januar 2019 /Accepteret: 22. februar 2019 /Udgivet online: 4. maj 2019

# Forfatteren(e) 2019

Cistanchekan lindrenyre sygdom

Abstrakt

Hjernemikroblødninger øges ikronisknyresygdom(CKD) og deres tilstedeværelse øger risikoen for kognitiv tilbagegang og slagtilfælde. Vi undersøgte interaktionen mellem CKD og hjernemikroblødninger (det neuropatologiske substrat for mikroblødninger) i muse- og cellekulturmodeller og undersøgte progressionen af ​​mikroblødningsbelastning på seriel hjernebilleddannelse fra mennesker. Museundersøgelser: To CKD-modeller blev undersøgt: adenin-induceret tubulointerstitiel nefritis og kirurgisk 5/6 nefrektomi. Cellekulturstudier: Bend.3-endotelceller fra musehjerne blev dyrket til konfluens, og monolagsintegritet blev målt efter eksponering for 5-15 procent humant uremisk serum eller stigende koncentrationer af urinstof. Humane undersøgelser: Progression af hjernemikroblødninger blev evalueret på seriel MR fra kontrolpatienter, prædialyse CKD og dialysepatienter. Mikroblødninger blev øget 2-2.5- gange hos mus med CKD uafhængigt af højere blodtryk i 5/6 nefrektomimodellen. IgG-farvning var øget hos CKD-dyr, hvilket var i overensstemmelse med øget blod-hjernebarriere-permeabilitet. Inkubation af bEnd.3-celler med uremisk serum eller forhøjet urinstof producerede et dosisafhængigt fald i trans-endotelial elektrisk modstand. Forhøjet urinstof inducerede actin-cytoskeletforstyrrelser og nedsat claudin-5-ekspression. Hos mennesker var prævalensen af ​​mikroblødninger 50 procent i begge CKD-kohorter sammenlignet med 10 procent i aldersmatchede kontroller. Flere patienter i dialysekohorten havde øget mikroblødning ved opfølgende MR efter 1,5 år. CKD forstyrrer blod-hjerne-barrieren og øger hjernemikroblødninger hos mus og mikroblødninger hos mennesker. Forhøjet urinstof ændrer actin-cytoskelettet og tight junction-proteiner i dyrkede endotelceller, hvilket tyder på, at denne mekanisme forklarer (i det mindste delvist) de mikroblødninger og mikroblødninger, der er observeret i dyre- og menneskestudier.

Nøgleord Kronisk nyresygdom. Mikroblødninger. Muse model. Endotelcellekultur. Hjerne-MR

at aflastekronisknyresygdom medcistanche

Introduktion

En af de mest betydningsfulde opdagelser i slagtilfældeneurologi i de senere år er fremkomsten afkronisknyresygdomat have en påvirkning, der går langt ud over traditionelle risikofaktorer såsom hypertension og diabetes [10, 11]. I betragtning af den høje prævalens (ca. 50 procent) af cerebrale mikroblødninger og kognitiv svækkelse hos patienter med fremskreden CKD [2-4, 6, 7], fortjener dette forhold yderligere undersøgelse.

Cerebrale mikroblødninger er små foci af hæmosiderin-jern, der kan påvises på magnetisk resonansbilleddannelse (MRI), menes at afspejle underliggende cerebrale mikroblødninger [12, 13], og indikerer øget risiko for slagtilfælde, både hæmoragisk og iskæmisk [9, 14]. Specifikke MR-sekvenser (gradientekko og følsomhedsvægtet billeddannelse) viser disse fokale områder med signaltab i hjerneparenkym, der måler mindre end eller lig med 10 mm [12, 15]. Cerebrale mikroblødninger er aldersafhængige, og prævalensen nærmer sig 20 procent i alderen 65 [16]. Ud over alder er hypertension og cerebral amyloid angiopati de bedst beskrevne risikofaktorer for udvikling af mikroblødninger [13, 17]. I det sene stadium af CKD er mikroblødninger til stede i op til 50 procent af befolkningen [2-4].

Samtidig er kognitiv svækkelse både mere udbredt og mere alvorlig ved lavere niveauer afnyrefungere[18], og nåede en prævalens på 30-70 procent hos kroniske dialysepatienter [6, 7]. I en tværsnitsanalyse af 338 hæmodialysepatienter i alderen 55 år og ældre med aldersmatchede kontroller havde 34 procent af dialysepatienterne alvorlig kognitiv svækkelse sammenlignet med 12 procent af kontrollerne [6]. Yderligere 35 procent af dialysekohorten havde moderat kognitiv svækkelse [6].

Adskillige undersøgelser i ikke-CKD-kohorter har vist en stærk sammenhæng mellem cerebrale mikroblødninger og faldende kognitiv funktion [19-22]. Epidemiologiske data understøtter sameksistensen af ​​MR-mikroblødningsbelastning og kognitiv dysfunktion hos patienter med nyresygdom i slutstadiet [8, 23]. Desuden viste en nylig rapport om 28 kroniske dialysepatienter med seriel hjerne-MR en sammenhæng mellem nye mikroblødninger og et fald i score for mini-mental tilstandsundersøgelse (MMSE) [4]. Ydermere har ESRD-patienter en 3- til 4-fold højere forekomst af både iskæmiske og hæmoragiske slagtilfælde sammenlignet med den generelle befolkning [5]. I en kohorte af japanske hæmodialysepatienter, som var slagtilfælde-fri ved baseline, var tilstedeværelsen af ​​cerebrale mikroblødninger en uafhængig forudsigelse for intracerebral blødning under en 5-års opfølgningsperiode [9].

Her rapporterer vi resultater fra undersøgelser med mus og CKD-patienter. Vi fandt øgede hjernemikroblødninger i CKD-mus og beskriver svækket endotelial tight junction og aktincytoskeletafbrydelse som potentielle mekanismer for mikroblødningsdannelse i CKD-miljøet. Retrospektiv analyse af seriel hjerne-MR fra ikke-CKD, prædialyse og kroniske hæmodialysepersoner bekræftede ESRD som en signifikant risikofaktor for progression af mikroblødningsbyrde.

Metoder

Museksperimenter

Forsøgsdyr og behandlingsgrupper

To CKD-musemodeller blev undersøgt. (1) Adenin tubulointerstitiel nefritis-model: C57BL/6J-hanmus fra Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) i alderen 10-12 uger blev fodret med en diæt indeholdende 0,2 procent adenin i 18 dage for at inducere kronisk interstitiel nefropati. tilbage på almindelig mad i 2 uger og derefter genudsat for adenin-diæt i 1 uge for at opretholde CKD (fig. 1a). Kontrolmus blev holdt på regelmæssig foder. (2) 5/6 nefrektomimodel: C57BL/6J-hanmus i alderen 10 uger gennemgik to-trins operation på Jackson Laboratories, der involverede venstre partiel nefrektomi efterfulgt af højre total nefrektomi 1 uge senere. Dyrene blev leveret til laboratoriet 1 uge efter

anden operation. Disse to modeller blev brugt til at bestemme effekten af ​​hypertension; hypertension er et kendetegn for 5/6 nefrektomi-modellen, hvorimod adenin-CKD er ikke-hypertensiv [24].

CKD-dyr blev randomiseret til ingen lipopolysaccharid (LPS) eller LPS-injektioner. (I pilotundersøgelser fastslog vi, at en længere varighed af uræmi var nødvendig for at påvise en højere byrde af spontane mikroblødninger hos ikke-behandlede CKD-dyr; mus på adenin-diæt i kun 10 dage ud over de første 18 dage eksponering havde 3.0 ± 0,4 mikroblødninger pr. cm2.)

Fem uger efter initial CKD-induktion og i en tilsvarende alder i kontrollerne fik mus intraperitoneale (ip) LPS-injektioner (Salmonella enterica serotype Typhimurium, L{{0}}MG, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, MO ) for at inducere hjernemikroblødninger. LPS blev administreret i tre doser, 1 mg/kg ved 0, 6 og 24 timer [25]. LPS-behandlede mus fik hydrering med subkutane saltvandsinjektioner to til tre gange dagligt i 3 dage efter LPS-behandling. Blodtrykket (BP) blev målt 2 dage før LPS-injektioner via hale-cuff plethysmografi (CODA-S2 multi-channel, Kent Scientific). Alle eksperimenter blev godkendt af University of California, Irvine Institutional Animal Care and Use Committee.

Vævshøst og blodkemi

Mus blev aflivet 1 uge efter LPS-injektioner eller i en tilsvarende alder hos ikke-behandlede dyr ved afblødning ved hjælp af hjertepunktur under inhaleret isofluran-anæstesi. En 26-gauge-nål blev brugt som en kanyle og indsat i venstre ventrikel, og iskold PBS-opløsning blev påført med en flowhastighed på 7-8 ml/min. Efter

perfusion i 5 minutter, den venstre hjernehalvdel blev lynfrosset til Western blot. Den højre hjernehalvdel og begge nyrer blev fikseret natten over i 4 procent paraformaldehyd og derefter opbevaret i kold PBS før sektionering. Serum blev aliquoteret for blodkemi. Urinstofnitrogen i blodet (BUN) blev målt under anvendelse af det kolorimetriske kit fra BioAssay Systems (Hayward, CA). Serumkreatinin blev målt ved hjælp af kapillærelektroforese ved O'Brien Kidney Research Core Center (UT Southwestern, Dallas, TX).

Påvisning af mikroblødninger

Hjernerne blev monteret i 1,5 procent agarose og sektioneret med et vibratom for at generere koronale sektioner (40 μm). Hver 5. sektion blev indsamlet til preussisk blåfarvning for at påvise mikroblødninger [26]. Preussisk blåfarvning blev udført under anvendelse af frisk fremstillet 5 procent kaliumhexacyanoferrat-trihydrat og 10 procent saltsyre. Tyve minutter senere blev sektioner skyllet i vand og modfarvet med nuklear hurtig rød, dehydreret og dækglas. Mikroblødninger blev identificeret ved × 20 forstørrelse, da lilla-blå aflejringer talt ved tre injektioner blev givet ved 0, 6 og 24 timer. Subkutan saltvandshydrering blev givet i 3 dage efter LPS-injektioner. Haleblodtryk (BP) blev målt før LPS-injektioner. Mus blev aflivet 1 uge efter LPS-injektioner. b Repræsentative H&E-farvede nyresektioner, der viser adenin-induceret tubulointerstitiel skade CKD-mus (højre panel) sammenlignet med normal nyre fra CTL-dyr (venstre panel), × 20 forstørrelse. Målestok=100 μm

uafhængige observatører, og så blev gennemsnittet beregnet. Billeder af de observerede positivt farvede snit blev optaget ved hjælp af et fotomikroskop (Nikon Eclipse, Japan) for tre dyr pr. gruppe for at beregne mikroblødningsområdet. Hele diasbilleder blev scannet, og den gratis ImageJ-software (version 10.2) fra National Institutes of Health (www.imagej.nih.gov/ij/) blev brugt til at

beregne det samlede hjerneoverfladeareal. Antallet af mikroblødninger blev normaliseret til det samlede hjerneoverfladeareal pr. dyr.

Western Blotting

Hjernehemisfærer til proteinanalyse blev lynfrosset på tidspunktet for vævsopsamling og homogeniseret i iskoldt vævsekstraktionsreagens I (Thermo Fisher Scientific) suppleret med proteaseinhibitorcocktail (Roche Applied Science, Indianapolis, IN). Proteinkoncentrationer blev målt med et BCA-proteinassay-kit (Thermo Fisher Scientific). SDS-PAGE gelelektroforese blev udført med 100 ug protein pr. prøve. Proteiner blev overført til PVDF-membraner og derefter blokeret for

1 time i 5 procent fedtfri skummetmælk tilberedt i TBS-T-buffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl og 0,1 procent Tween-20) ​​og inkuberet med primære antistoffer rettet mod claudin -5 (fortyndet 1:200, Sigma-Aldrich SAB4502981), occludin (fortyndet 1:200, Invitrogen 711500, Thermo Fisher Scientific) og normaliseret til GAPDH intern kontrol (fortyndet 1:10,000, Abcam, Cambridge, MA) i 5 procent fedtfri mælk TBS-T natten over ved 4 grader. Blottene blev derefter inkuberet med de respektive anti-kanin- eller anti-mus sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur. Efter vask med TBS-T blev bånd detekteret ved hjælp af Luminescent Image Analyzer LAS-3000 (Fujifilm Life Science, Stamford, CT).

Immunhistokemi

For at påvise blod-hjernebarriere-lækage (BBB) ​​blev sektioner inkuberet med biotinyleret anti-muse IgG sekundært antistof ved 1:100 i 1 time ved stuetemperatur (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Efter vask med PBS blev sektioner inkuberet i 30 minutter med avidin-biotin-peroxidasekompleks (Vector Laboratories) ved en fortynding på 1:200. Farvning blev udviklet under anvendelse af 3',3'-diaminobenzidin (DAB, Vector Laboratories) som chromogen. Procent areal farvet med IgG blev analyseret ved hjælp af ImageJ software i ikke-LPS CTL og CKD hjerner. En tærskel for positiv IgG-farvning blev valgt ved manuelt at evaluere et kontroldyr for IgG-farvning, og denne tærskel blev derefter holdt ens for alle inkluderede dyr [27].

Cistanche deserticola forebygger nyresygdom

Cellekultureksperimenter

Hjerneendotelcellekultur og serumbehandling

Immortaliserede muse-bEnd.3-celler blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Endotelcellefænotype blev bekræftet via immunfarvning for von Willebrand-faktor.

Cellekulturer blev inkuberet i komplet Dulbeccos modificerede Eagles medium med højt glukoseindhold (DMEM, ATCC 30-2002) indeholdende 25 mM glucose suppleret med 10 procent føtalt bovint serum (FBS) og 1 procent penicillin-streptomycin i en befugtet inkubator ved 37 grader i en atmosfære på 5 procent CO2 og 95 procent luft. Celler blev anvendt ved passage 5 til alle eksperimenter. Cellerne blev podet ved 5 × 106 densitet på 12-brønd polyester Transwell-indsatser (0,4 μm pore, Costar), og konfluens blev opnået efter 24-48 timer. Dyrkningsmediet blev derefter ændret for at udsætte celler for forskellige koncentrationer af FBS, humant normalt serum (HNS) eller uremisk serum (CKD) fra dialysepatienter. TEER-aflæsninger blev målt ved hjælp af EVOM2 volt/Ohm Meter (World Precision Instruments, Sarasota, FL) på tre steder pr. brønd for at opnå et gennemsnit. Eksperimenter fortsatte i 21 dage, og dyrkningsmediet blev genopfrisket hver 3.-4. dag. NHS og uremisk serum var fra tidligere bankede prøver opnået efter IRB-godkendelse og informeret samtykke.

Ureacellekultureksperimenter

For at undersøge virkningerne af urinstof (det mest udbredte tilbageholdte toksin i CKD) blev bend.3-celler inkuberet i højglukose-DMEM med 10 procent FBS alene eller i medium suppleret med 42 eller 72 mg/dL (70 eller 120 μm) urinstof ( Sigma-Aldrich). Disse urinstofkoncentrationer tilnærmer sig de præ- og post-hæmodialyseværdier, der generelt findes hos ESRD-patienter, og anses for at være klinisk relevante [28]. Ved afslutningen af ​​en 24- timers inkubationsperiode blev TEER målt, og cellerne blev høstet og behandlet til Western blot-analyse. Til visualisering af actin-cytoskelettet blev bEnd.3-celler dyrket på dækglas og udsat for ovennævnte urinstofkoncentrationer i 24 timer, fikseret i 10 minutter i afkølet 4 procent formalin/PBS og derefter bearbejdet til immunfluorescensfarvning under anvendelse af actistain 488 fluorescerende phalloidin med DAPI nuklear farvning (katalog# PHDG1-A, Cytoskeleton Inc., Denver, CO). Tredobbelte dias blev udført pr. gruppe, og tre rammer blev afbildet pr. dias på ImageJ-software for at beregne arealet af phalloidin-farvning normaliseret til DAPI-området.

Western Blotting

BEnd.3-celler fra urinstofforsøgene blev pelleteret og derefter lyseret i Tissue Extraction Reagent I (Thermo Fisher Scientific) suppleret med proteaseinhibitorcocktail (Roche Applied Science). Proteinkoncentrationer blev målt med et BCA protein assay kit, og Western blotting blev udført som beskrevet ovenfor med claudin-5 (fortyndet 1:500) og occludin (fortyndet 1:500) normaliseret til GAPDH intern kontrol (fortyndet 1:20) ,000). Western blots blev gentaget mindst tre gange for hver prøve.

Menneskestudier

Retrospektiv hjerne-MR-diagramgennemgang

Elektroniske lægejournaler mellem 1. januar 2008 og 31. december 2014 på University of California-Irvine Medical Center blev screenet ved hjælp af Honest Broker-systemet og UCReX (University of California Research Exchange) efter IRB-godkendelse. Pre-dialyse CKD (n =8) og kroniske hæmodialysepatienter (n =9), som havde mindst to hjerne-MR-scanninger på forskellige tidspunkter, blev identificeret (af 10 hæmodialysepatienter, der oprindeligt blev identificeret, blev 1 fjernet fra den endelige analyse på grund af manglende billeder i radiologi PACS-systemet). Kontroller med normal nyrefunktion (n=10) blev manuelt matchet til hæmodialyse-CKD-patienterne efter køn og alder ± 5 år.

Gennemgang af MR for cerebrale mikroblødninger

Mikroblødninger blev talt af en behandlende neuroradiolog (DF) og analyseret for progression over tid. Hjerne-MR med T2*-vægtet og følsomhedsvægtet billeddannelse (SWI) og FLAIR (væske-attenueret inversion recovery) billeder blev udført på 1,5T og 3T MR-scannere. Lagtykkelse for SWI-sekvenser blev udført ved 2 mm med et mellemlagsinterval på 0. Mikroblødninger blev talt baseret på 2-mm aksial SWI. FLAIR var pr-

dannet til at detektere hvide stoflæsioner ved 3 mm skivetykkelse, også med et mellemlagsinterval på 0.

Statistisk analyse

Der var ingen dataudlignere ved screening med Grubbs' test (ekstrem studentiseret afvigende metode, http://graphpad. com/quick calls/grubbs1/). Forskelle mellem grupper i mus og i mennesker blev sammenlignet med chi-square (Fishers eksakte) test for kategoriske variable og t-test og ANOVA for kontinuerte variable. Kontinuerlige data rapporteres som middel ± SEM. For musedata udførte vi både en Kruskal-Wallis ikke-parametrisk og en envejs ANOVA med Tukey HSD-tests. Tovejs ANOVA (CKD-ja/nej og LPS-ja/nej) blev brugt til at teste CKD-interaktion. Forskelle mellem grupper blev betragtet som signifikante, hvis P < 0.05.="" figurer="" blev="" genereret="" ved="" hjælp="" af="" graphpad="" prism="" 4-software="" (graphpad="" software,="" san="" diego="">

Resultater

Overlevelse med LPS-behandling

CKD-mus behandlet med LPS havde en overlevelsesrate på 80 procent. Kun mus, der overlevede til 1 uge efter LPS-behandling var

indgår i de endelige analyser. Alle mus i andre grupper overlevede indtil slutningen af ​​eksperimentet.

CKD Signifikant øget hjernemikroblødninger

Byrde efter LPS-behandling

Dyr med adenin-induceret og 5/6 nefrektomi CKD viste signifikant forhøjede blodurinstofnitrogen (BUN) og serumkreatininværdier sammenlignet med CTL-dyr (tabel 1). Hale-BP var signifikant højere i nefrektomi-CKD-dyr sammenlignet med CTL- og adenin-CKD-dyr (tabel 1); dog var antallet af mikroblødninger i de to CKD-grupper ens. H&E-farvning bekræftede adenin-induceret tubulointerstitiel skade i nyrerne fra CKD-mus (fig. 1b).

Den gennemsnitlige hjernemikroblødningsbyrde var 2,0 ± 0,5 pr. cm2 i ikke-LPS CTL-mus og var øget 2-2.5-fold hos ikke-LPS CKD-dyr (adenin- CKD-mus 4,5 ± 0,9 pr. cm2;

nefrektomi-CKD mus 4,2 ± 1,1 pr. cm2) (tabel 1; fig. 2a). For ikke-LPS-grupperne var en stigning i mikroblødninger signifikant for adenin-CKD sammenlignet med CTL, men ikke for nefrektomi-CKD. LPS-behandling øgede mikroblødningsdannelsen i samme grad hos CTL- og CKD-dyr ved