Apoptotisk virkning af cistanche-polysaccharider på leukæmi

Forfatter:

LI Yan,ZHANG Jin,ZHANG Jing-Nan,et al.

Indre Mongoliet, Kina

At undersøge den apoptotiske effekt afCistanche polysaccharider( CDP) på menneskeakut leukæmicellelinje Jurkat-celler.MetoderMTT-assay blev anvendt til at påvise effekten af ​​CDP på ​​celleproliferation, Western blotting blev brugt til at detektere aktiveringen af ​​caspase-9 og caspase-3, og de apoptotiske signalmolekyler blev også testet.Ｒ resultaterT-celleproliferation blev hæmmet af 1 mg/ml og 2 mg/ml CDP, T-celle-apoptose blev induceret af 5 mg/ml CDP, ogudtrykkene for pro-caspase-9 og pro-caspase-3 blev signifikant reduceret. Ekspressionerne af celleoverfladereceptorerne CD45 og CD71 blev signifikant hæmmet af 5 mg/ml CDP, EＲK-phosphorylering blev induceret, og JNK-phosphorylering blev hæmmet.

Konklusioner

【Nøgleord】Cistanche polysaccharider; Apoptose; Ｒeceptor; caspase-9; caspase-3

Akut lymfatisk leukæmi (ALL) er en ondartet klonal sygdom i lymfesystemet med en høj grad af immunfænotype heterogenitet. , let at få tilbagefald og så videre. På nuværende tidspunkt omfatter almindeligt anvendte behandlingsmetoder knoglemarvstransplantation, induktionsterapi, immunterapi, kombineret kemoterapi osv. På grund af de fleste kemoterapimidlers begrænsede evne til at målrette og dræbe tumorer, kan de forårsage alvorlig skade på fordøjelsessystemet, blodsystemet, kardiovaskulær og cerebrovaskulær osv. Mens den modtager behandling, er den ofte ledsaget af alvorlige bivirkninger, hvoraf nogle endda er dødelige. Efterhånden som kemoterapien skrider frem, har kroppen en tendens til at udvikle tolerance over for kemoterapimedicin, hvilket øger risikoen for tilbagefald af sygdommen.

Derfor er søgningen efter yderst effektiv, lav toksicitet og meget målrettet leukæmiterapi eller adjuverende terapi blevet fokus for den nuværende opmærksomhed.Cistanchekaldes Chagangaoya på mongolsk. Den tilhører familien Ledangaceae og slægten Cistanche. Det er snyltende på rødderne af ørkentræer og har ry som "ørkenginseng".

De vigtigste aktive ingredienser i Cistanche omfatter phenylethanoidglycosider, lignaner, betainer, steroler, aminosyrer og polysaccharider. Anti-inflammatorisk, antiviral, antioxidant, immunregulering og andre effekter.

Det har undersøgelser fundetCistanche polysaccharid (CDP),som en af ​​dens vigtigste aktive komponenter,har antitumor og immunmodulerende virkning.Forskerne fandt ud af, at CDP har en signifikant dræbende effekt på leukæmicellerne K562 og THP-1, og foreslog, at CDP har en vis rolle iforebyggelse eller behandling af leukæmi. Hertil kommer, i den traditionelle kinesiske medicin sammensatte, cistanche, til behandling af akutteleukæmi, Cistanchespiller også en rolle som en af ​​de vigtige komponenter. Men den specifikke virkningsmekanisme afCistancheer ikke kendt. I dette papir, isolering og oprensning afCistanche CDPblev undersøgt, og dræbende virkning og relaterede mekanisme af CDP på ​​den humane akutte leukæmi-cellelinje Jurkat blev undersøgt.

1.1 Vigtigste reagenser og instrumenter

Cistanche-pulver blev købt fra Sichuan WecistancheGroup Co, Ltd., human akut leukæmi-cellelinje Jurkat blev købt fra cellebanken i Shanghai Institute of Cell Biology, thiazolblåt (MTT) og natriumdodecylsulfat (SDS) blev købt fra Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co., Ltd., føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra Hangzhou Sijiqing Bioengineering Materials Co., Ltd., cysteinholdig caspase-3, caspase-9, CD71, CD45, Phosphoryleret c-Jun aminoterminal kinase (p. -JNK) og phosphorylerede ekstracellulære signalregulerede kinase (p-ERK) antistoffer blev købt fra Cell Signaling Technology, USA, og actin antistoffer blev købt fra Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd. Elektrokemisk. Scientific Company i USA, og andre reagenser var af indenlandsk analytisk kvalitet. Gel-View 6000 plus intelligent billedarbejdsstation (produkt fra Guangzhou Boluteng Biotechnology Co., Ltd.), Revolve FL op og ned fluorescensmikroskop (produkt fra Echo Laboratories, USA), EPOCH mikropladelæser (produkt fra Beijing Bo Teng Instrument Co., Ltd.).

1.2 Adskillelse og oprensning af CDP Tag 500 g afCistanche ekstrakt pulver, læg det i blød i 95 procent ethanol natten over, filtrer det med gaze, opsaml filterresten, kog det med varmt vand ved 60 grader i 2 timer/gang, i alt 3 gange. Efter afslutningen blev filtraterne kombineret tre gange, koncentreret under reduceret tryk til 2/3 af det oprindelige volumen, tilsat 3 gange volumenet af 95 procent ethanol og tilladt at stå ved 4 grader natten over. Den næste dag centrifugeres ved 4 000 r/min i 10 minutter, opsaml bundfaldet, fjern protein ved hjælp af Sevag-metoden, bundfæld med absolut ethanol, frysetør for at opnå CDP.

1.3 Cellekultur Den humane akutte leukæmi-cellelinje blev opbevaret i flydende nitrogen i Jurkat-laboratoriet. Når de blev brugt, blev cellerne hurtigt udvundet i et 37 graders vandbad og dyrket i RPMI1640-medium (indeholdende 100 U/ml penicillin og 100 U/ml streptomyciner) med 10 procent FBS. Cellerne blev dyrket i en 37 graders, 5 procent CO2 celleinkubator, passeret hver 2. til 3. dag, og eksperimenterne blev udført, når cellerne gik ind i den logaritmiske vækstfase.

1.4 MTT-eksperiment Jurkat-celler i den logaritmiske vækstfase blev taget, centrifugeret for at opnå cellepellet og talt ved 5 x 105 celler/ml. Tag en cellekulturplade med 96-brønd, inokuler 100 ul celler i hver brønd, og tilsæt derefter 100 ul RP-MI1640 komplet medium som kontrolgruppe; forsøgsgruppen blev opdelt i 3 grupper, først ved at bruge RPMI1640-medium til at fremstille forskellige koncentrationer af CDP og derefter tilsætte 100 ul RP-MI1640-medium til hver brønd. ul Jurkat-celler og 100 ul CDP-opløsning blev anvendt til at fremstille den endelige koncentration af CDP på ​​henholdsvis 1, 2 og 5 mg/ml. Hver gruppe blev sat op med 5 duplikatbrønde og inkuberet i en 37 graders celleinkubator i 48 timer. Efter inkubationen tilsættes 20 ul MTT (koncentrationen af ​​stamopløsningen er 5 mg/ml) i hver brønd, sættes den tilbage i celleinkubatoren, og fortsætte med at inkubere i 4 timer, og til sidst tilsættes 100 ul af 20 procent. SDS til at opløse formazan ved 37 grader natten over, og bruge det næste dag. Absorbansen ved 570 nm af hver gruppe blev detekteret af en mikropladelæser, og inhiberingshastigheden af ​​forskellige koncentrationer af CDP på ​​Jurkat-celleproliferation blev beregnet ved formel.

1.5 Western blotting Jurkat-celler i den logaritmiske vækstfase blev taget og podet i en 6-brøndplade ved en tæthed på 2 × 105 celler/ml, 500 ul/brønd, og 500 ul RPMI1640 komplet medium blev tilsat til kontrollen gruppe. Opstil 3 forsøgsgrupper, 1, 2 og 5 mg/ml polysaccharidbehandlingsgrupper, CDP

Opløst i RPMI1640 komplet medium på forhånd blev 500 ul af celler og 500 ul CDP-opløsninger med forskellige koncentrationer tilsat til 6-brøndpladen og inkuberet ved 37 grader i 48 timer. Efter kulturen blev cellesuspensionerne fra hver gruppe opsamlet, centrifugeret ved 1 500 r/min i 5 minutter for at opnå cellepelleter og vasket to gange med forafkølet phosphatbufret saltvand (PBS). Efter vask blev 20 µl cellelysebuffer tilsat til hver gruppe, og cellerne blev lyseret på is i 30 minutter. Totalt protein blev ekstraheret, og cellekoncentrationen blev justeret ved anvendelse af Bradfords metode. 20 ug protein blev taget fra hver gruppe til SDS-polyacrylamidgelelektroforese (PAGE), og proteinet blev overført til polyvinylidenfluorid (PVDF)-membran ved elektroporering. Blokeret med fedtfrit mælkepulver ved stuetemperatur i 1 time, tilsat kanin-anti-human caspase-3 og caspase-9 antistoffer i et fortyndingsforhold på 1:1 000, inkuberet ved stuetemperatur i 1 h, skyllet 3 gange med en phosphat Tween buffer (PBST) shaker (10 min/tid), tilsæt peberrodsperoxidase (HRP)-mærket sekundært antistof (1:1 000), inkuber i 1 time ved stuetemperatur, skyl 3 gange med PBST, skyl 1 gang med PBS, tilsæt ECL-substrat og brug Den intelligente billedarbejdsstation blev brugt til billeddannelse, og båndændringerne for hver gruppe blev sammenlignet for at studere apoptose af Jurkat-celler induceret af CDP. Til påvisning af apoptose-pathway-relaterede proteiner var cellekulturen og CDP-behandlingsbetingelserne de samme som ovenfor. Efter reaktionen blev cellerne lyseret til proteinkvantificering. Proteinet blev overført til PVDF-membran ved SDS-PAGE og elektroporering. Efter blokering med skummetmælkspulver i 1 time blev anti-CD71, CD45, p-JNK og p-ERK antistoffer (1:1 000) tilsat og inkuberet ved stuetemperatur i 1 time. Det HRP-mærkede sekundære antistof (1:1 000) blev inkuberet i 1 time, og til sidst blev den intelligente billeddannelsesarbejdsstation brugt til billeddannelse for at studere de relaterede signalmolekyler af CDP-induceret Jurkat-celleapoptose. De resulterende eksperimentelle bånd blev gråskaleret med Image J (1.8.0).

Klik her for at kende Cistanche-effekten på anti-tumor og anti-cancer-effekt

1.6 Statistisk analyse SPSS21.0 software blev brugt til t-test og variansanalyse

2 resultater af Cistanche funktion påleukæmi

2.1 Celleproliferationsniveau

CDP'en blev isoleret med succes med mere end 9{{20}} procent sukkerindhold og mindre end 5 procent proteinindhold. Hæmningshastigheden af ​​celleproliferation i 1 mg/ml CDP-gruppen var (19,1 ± 2,1) procent, mens den i 2 mg/ml og 5 mg/ml CDP-grupperne var (44,2 ± 5,2) ) ) procent og (47, 8 ± 4, 4) procent, hvilket indikerer, at CDP signifikant kan hæmme proliferationen af ​​Jurkat-celler på en dosisafhængig måde. 2.2 Sammenlignet med kontrolgruppen (0.62±0.04, 0.56±{{40}}.{{49 }}7), resulterede niveauet af apoptose i Jurkat-celler behandlet med 5 mg/ml CDP i enzymerne af caspase-9 og caspase{{30}}. Pro-form pro-caspase-9 ( 0. 09 ± 0. 02) og pro-caspase-3 ( {{ 63}}. 12 ± 0. 01) blev signifikant reduceret, og 1 mg/ml og 2 mg/ml CDP-grupperne var signifikant mindre effektive for pro-caspase-3 i celler. Caspase-9 (0,58±0,04, 0,51±0,01) og pro-caspase-3 indhold (0,48±0,04, 0,44±0,05) havde ingen signifikant effekt, dvs. lav. Koncentrationen af ​​CDP inducerede ikke apoptose af Jurkat-celler, men inhiberede hovedsageligt celleproliferation, som vist i figur 1.

1-4: referencegruppe,

1 mg/ml CDP-gruppe, 2 mg/ml CDP-gruppe, 5 mg/ml CDP-gruppe; det samme som følgende figur

Figur 1 Effekten af ​​CDP på ​​caspase-9 og caspase-3 i Jurkat-celler

Indflydelse af Cistanche polysaccharider Effekt på leukæmi

2.3 De relative ekspressionsniveauer af CD71 og CD45 i apoptosereceptorkontrolgruppen var 1.00±0.04, {{10}}.54± 0.{{20}}2. 5 mg/ml CDP-gruppen kunne signifikant hæmme CD71 (0.05±0.02). 01) og CD45 ( 0. 13 ± {{40}}. 03); 1 mg/ml og 2 mg/ml CDP-grupper kunne hæmme ekspressionen af ​​CD71 (0,52 ± 0,06, 0,43 ± 0,07) til en vis grad. Der var ingen signifikant effekt på ekspressionen af ​​CD45 (0,51) ±0,01, 0,48±0,02). Se figur 2.

Figur 2 Effekten af ​​CDP på ​​ekspressionen af ​​receptorer på cellemembranoverfladen

2.4 Apoptose-relaterede veje

De relative udtryksniveauer af p-JNK og p-ERK i referencegruppen var 1,20±0.08 og 0.21±0 .03, hhv. 5 mg/ml CDP-gruppen inducerede apoptose og reducerede signifikant phosphoryleringsniveauet af JNK. ( 0. 32 ± 0. 04), øgede phosphoryleringsniveauet af ERK signifikant (1. 13 ± 0. 05); 1 mg/ml, 2 mg/ml CDP øgede phosphoryleringsniveauet af JNK (1. 12 ± 0. 06, 1. 06 ± 0. 06) havde ingen signifikant effekt, men øgede stadig phosphoryleringsniveauet af ERK (0, 54 ± 0, 04, 0, 63 ± 0, 02). Se figur 3.

Figur 3 Effekten af ​​CDP på ​​phosphoryleringen af ​​JNK og ERK

3 Diskussion

I de senere år har undersøgelser fundet, at CDP har en vis hæmmende effekt på leukæmicellelinjer, men den specifikke virkningsmekanisme er endnu ikke kendt.

I apoptoseprocessen er caspase-9 et af de opstrømssignalerende molekyler i den caspaseafhængige apoptoseproces. Efter signalstimulering hydrolyseres pro-caspase-9 massivt for at producere en aktiveret form af spaltet-caspase-9, som fortsætter med at transmittere apoptotiske signaler nedad for at fremme processen med apoptose. Caspase-3 er et caspasemolekyle af effektortypen og er et nøglesignalmolekyle i processen med cellulær caspaseafhængig apoptose. Det findes også i form af pro-enzym (pro-caspase-3) under normale forhold. Når først aktiveret ved hydrolyse, produceres en stor mængde spaltet caspase. -3, vil det lysere en række nøgleproteinmolekyler i celler og til sidst inducere apoptose. CDP tilhører de aktive polysaccharider af biologiske makromolekyler og kan ikke frit trænge ind i celler gennem cellemembranen. Derfor inducerer CDP apoptose ved at påvirke ekspressionen og fordelingen af ​​receptorer på overfladen af ​​Jurkat-cellemembraner, hvorved signaler overføres til det indre af celler og til sidst aktiveres caspase-familien. protein, hvilket fører til celleapoptose. Denne undersøgelse viser, at lav koncentration af CDP ikke inducerer apoptose af Jurkat-celler, men primært hæmmer celleproliferation. CD71, også kendt som transferrinreceptor, er en type II transmembran glycoproteinreceptor involveret i jernabsorption og regulering af cellevækst og udvikling. CD71 er stærkt udtrykt hos patienter med akut leukæmi og er forbundet med primær lægemiddelresistens, det vil sige ekspressionen af ​​CD71. Jo højere værdi, jo dårligere effekt af den første kemoterapi. Derfor er CD71 en af ​​markørerne for hjælpediagnose. CD45 udtrykkes på overfladen af ​​alle typer leukocytter, også kendt som leukocytt almindeligt antigen. Det tilhører type I transmembrant glycoprotein og er tæt forbundet med udvikling og differentiering af T-celler. CD45 har forskellige ekspressionsniveauer og allosteriske typer i forskellige typer leukæmi, så det kan bruges som en af ​​markørerne for differentialdiagnose og immunfænotyping af leukæmi. CD45 monoklonalt antistof er blevet brugt i vid udstrækning til behandling af leukæmi, især lægemiddelresistent leukæmi. Friesen et al. fandt, at radionuklider

Mærket CD45 mAb kan inducere apoptose i lægemiddelresistente leukæmi-cellelinjer ved at aktivere caspasefamilieproteiner (herunder caspase-3, caspase-8 og caspase-9). CDP inducerer apoptose af Jurkat-celler, først ved at virke på cellemembranoverfladereceptorerne CD45 og CD71, påvirke ekspressionen og fordelingen af ​​de to, transmittere apoptosesignaler ind i cellerne og til sidst aktivere caspase-9 og caspase{{8 }}, der udløser apoptose. Imidlertid er både caspase-9 og caspase-3 placeret nedstrøms for den apoptotiske vej, og opstrøms signalmolekyler skal udforskes yderligere. I denne undersøgelse inducerede CDP i en koncentration på 5 mg/ml apoptose af Jurkat-celler, mens det inhiberede ekspressionen af ​​CD45, hvilket svarede til det for det monoklonale CD45-antistof beskrevet ovenfor. Derfor, fra perspektivet af apoptose-relaterede receptorer CD45 og CD71,Cistanchehar et vist potentiale til behandling eller adjuverende behandling af leukæmi.Mitogen-aktiverede proteinkinasesystemer (MAPK'er) udtrykkes i alle eukaryote celler.

Cistanche-tabletter til forbedring af immunitetssystem for leukæmibehandling

Det er en meget vigtig informationstransmissionsvej, der udfører ekstracellulær stimuleringssignaltransduktion til den intracellulære og er sammensat af serin/threonin-proteinkinaser, herunder ERK, JNK og p38MAPK. Dets phosphorylering og dephosphorylering er omskiftere af cellelivsaktiviteter og er involveret i Og regulerer processen med cellevækst, -proliferation, differentiering, aktivering og apoptose. Denne undersøgelse tyder på, at JNK-dephosphorylering er involveret i CDP-induceret T-celleapoptose, mens ERK-phosphorylering er involveret i de to processer, idet CDP hæmmer celleproliferation og inducerer apoptose.

Afslutningsvis,Cistanche CDPhar en cytotoksisk effekt på T-lymfocytisk leukæmi-cellelinje Jurkat, hvilket viser, at lave koncentrationer (under 2 mg/ml) hæmmer celleproliferation, mens høje koncentrationer (5 mg/ml) inducerer apoptose.Cistanche CDPinducerer apoptose i Jurkat-celler hovedsageligt ved at påvirke og ændre celler.

Ekspressionen af ​​apoptose-relaterede receptorer CD71 og CD45 på membranoverfladen transmitterer signaler til det indre af celler, hvilket yderligere forårsager ERK-phosphorylering og JNK-dephosphorylering og endelig aktivering af caspase-9, som igen aktiverer caspase{{4} } for at inducere apoptose.