Kimærisk human papillomavirus-16 viruslignende partikler, der præsenterer P18I10- og T20-peptider fra HIV-1-kappe inducerer HPV16 og HIV-1-specifik humoral og T-celle-medieret immunitet i BALB/c-mus
Dec 07, 2023
Abstrakt:
I denne undersøgelse blev HIV-1 P18I10 CTL-peptidet afledt af V3-løkken af HIV-1 gp120 og T20-antifusionspeptidet af HIV-1 gp41 indsat i HPV16 L1-capsidproteinet at konstruere kimære HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) VLP'er ved at anvende pattedyrcelleekspressionssystemet. HPV: HIV VLP'erne blev oprenset ved kromatografi. Vi demonstrerede, at indsættelsen af P18I10- eller T20-peptider i DE-løkken af HPV16 L1-capsidproteiner ikke påvirkede in vitro-stabilitet, selvsamling og morfologi af kimæriske HPV: HIV VLP'er. Det er vigtigt, at det hverken interfererede med HIV-1-antistofreaktiviteten målrettet efter sekventielle og konformationelle P18I10- og T20-peptider præsenteret på kimære HPV: HIV VLP'er eller med induktionen af HPV16 L1-specifikke antistoffer in vivo. Vi observerede, at kimære L1:P18I10/L1:T20 VLPs-vacciner kunne inducere HPV16- men svage HIV-1-specifikke antistofresponser og fremkaldte HPV16- og HIV-1-specifik T- celleresponser i BALB/c-mus. Det kunne desuden være en potentiel booster til at øge HIV-specifikke cellulære responser i den heterologe immunisering efter priming med BCG.HIVA-vaccine. Dette forskningsarbejde vil bidrage med et skridt i retning af udviklingen af den nye kimære HPV: HIV VLP-baserede vaccineplatform til kontrol af HPV16 og HIV-1-infektion, som er et presserende behov i udviklings- og industrialiserede lande.
cistanche fordele for mænd styrker immunsystemet
Klik her for at se produkter fra Cistanche Enhance Immunity
【Spørg om mere】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
Nøgleord:
HIV-1; HPV16; vaccine; viruslignende partikler; P18I10; T20-enfuvirtid; BCG.HIVA; humoral immunitet; T-celle-medieret immunitet
1. Introduktion
Human immundefektvirus-1 (HIV-1), som forårsager erhvervet immundefektsyndrom (AIDS), blev opdaget i begyndelsen af 1980'erne, og siden da er det blevet en global epidemi [1]. Selvom højaktiv antiretroviral behandling (HAART) sammen med præ-eksponeringsprofylakse (PrEP) kan have en reel indvirkning på kontrollen af HIV-1-infektion, er vaccination stadig en grundlæggende tilgang til gavn for offentligheden og for at give en ende på den globale HIV-1-epidemi [2]. På trods af over tre årtiers grundig HIV-1-forskning og adskillige kliniske vaccineforsøg, er en licenseret HIV{10}}-vaccine indtil nu stadig uopnåelig. RV144-forsøget udført i Thailand var det første tilfælde, der afslørede en beskeden effekt på 31,2 % mod erhvervelse af HIV-1-infektion [3]. Størstedelen af andre HIV-1-vaccinekandidater, der gennemgik kliniske forsøg, var hovedsageligt baseret på DNA, rekombinante virale vektorer eller underenhedsproteinmodeller [4,5]. Ideelt set er en effektiv HIV-1-vaccine i stand til at inducere medfødte immunresponser, neutralisere antistoffer for at forhindre virusinfektion [6] samt cytotoksiske T-lymfocyt-(CTL)-responser til at eliminere inficerede celler [7]. Men at fremkalde hver respons kan kræve forskellige vaccinestrategier, hvilket berettiger separate men parallelle udviklingsindsatser. Udvælgelsen af immunogener og leveringsvektorer vil have betydelig indvirkning på funktionen og specificiteten af HIV-1-vacciner [8,9]. De gentagne fejl ved brug af standardtilgange til HIV-1-vaccineudvikling førte til en erkendelse af vigtigheden af leveringsvektorudvælgelse, prime-boost-regimer og immunogenspecificitet i både humorale og cellulære responser. Mere end 100 typer af humant papillomavirus (HPV) er allerede kendt, og HPV-genotyperne 16 og 18 anses for at være ansvarlige for cirka 70 % af livmoderhalskræft på verdensplan [10]. HPV L1-viruslignende partikler (VLP'er), klassificeret som en type underenhedsvacciner, kunne overvejende inducere sammenlignelige L1--specifikke humorale responser på vildtype-virion og også T-celle-medierede responser [11-13]. I øjeblikket er tre HPV-forebyggende vacciner blevet godkendt på markedet, og alle er baseret på VLP'er af HPV L1-capsidprotein. To af dem, Gardasil (Merck, Rahway, NJ, USA) og Gardasil-9 (Merck) produceres af gær (Saccharomyces cerevisiae) ekspressionssystemet, mens den anden, Cervarix (GSK, Brentford, UK), produceres af baculovirus ekspressionsvektor/insektcelle (BEVS/IC) systemet [14]. Indtil nu er optimale betingelser for produktion af HPV16 L1-proteiner i pattedyrsekspressionssystemet ikke blevet veletableret. Udviklingen af en kombineret vaccine, der beskytter mod HPV- og HIV-infektioner, er således en logisk indsats i kampen mod disse to store globale patogener.
I vores tidligere review-publikation vedrørende designkoncepter for virus-lignende partikel (VLP)-baserede HIV-1-vacciner nævnte vi, at ikke-indkapslede VLP'er, såsom papillomavirus-VLP'er, kunne spille en funktionel rolle som leveringsvektorer til at præsentere HIV-1 CTL eller neutraliserende antistofepitoper [15,16]. Denne hypotese er blevet bekræftet i flere kimære bovine papillomavira (BPV) L1 VLP, der præsenterer P18I10 CTL epitop fra V3 loop af gp120 HIV-1 kappeprotein (Env) og 2F5 epitop eller MPER region af gp41 HIV-1 Env [17-22]. Det strukturelle træk ved human papillomavirus type-16 (HPV16) L1-capsidproteiner ligner det for BPV og kan selv samles til enkeltlags L1-VLP'er [23]. Fem af HPV16 L1-proteinerne danner en pentamer og 72 af pentamererne samler sig selv til en HPV16 VLP [24]. Der er dog stadig ingen klare beviser for, at kimære HPV16:HIV-capsidproteiner kunne være stabile in vitro og selvsamle sig til morfologisk integrerede VLP'er. På den anden side har HPV16 L1 VLP'er vist sig at være stærkt immunogene og er i stand til at inducere antigenspecifikke T- og B-celle-immunresponser [11-13]. Det mangler stadig at se, om præsentationen af HIV-1 epitoper gennem HPV: HIV VLP'er kan være immunogene. I denne undersøgelse havde vi til formål at udvikle en kimærisk VLP-baseret HPV: HIV-vaccine ved at bruge humane 293F-celler, et veletableret pattedyrcelleekspressionssystem. HPV 16 L1-proteinet fungerede som det strukturelle vaccinestillads, og P18I10- og T20-peptiderne blev udvalgt som HIV-1-immunogener og indsat i DE-løkken af HPV 16 L1-proteinet. Den immundominante P18I10 CTL-epitop omfattende 10 aminosyrer (rest 311-320: RGP GRAFVTI) er afledt fra det tredje variable domæne (V3) af HIV-1-kappeglycoproteinet gp120. P18I10-peptidet er blevet identificeret som et H-2Dd-begrænset MHC klasse-I-molekyle for at inducere cytotoksiske T-lymfocyt-(CTL)-responser [25,26]. T20-peptidet, kendt som Enfuvirtide og designet som et antiretroviralt multimert fusionspeptid, består af en 36 aminosyresekvens (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQ ELLELDKWASLWNWF), der efterligner den C-terminale heptad helixsekvens tæt på membranen0 s proksimale eksterne region (MPER) af HIV-1-kappeglycoprotein 41 (gp41) [27]. Disse to HIV-1 T (P18I10) og B (T20) cellebaserede epitoper blev udvalgt som udgangspunkt og proof of concept-eksperiment for den kimære VLP-baserede HPV: HIV-vaccineudviklingsplatform.
I løbet af det sidste årti er mange forskellige prime-boost-formater af VLP-baseret HIV-1-vaccine blevet testet [15]. Selvom størstedelen af tidligere HIV-1 VLP [28] eller kimærisk BPV: HIV VLP [17-22] vaccinestrategier var fokuseret på at inducere immunresponser ved at bruge den homologe prime-boost-kur, antydede to tidligere undersøgelser, at heterolog immunisering bestående af rekombinantMycobacterium bovisBacillus Calmette-Guérin (rBCG), der udtrykker HIV-1 Gag prime og HIV-1 Gag VLP boost kan bidrage til at øge T-celleimmuniteten [29,30]. I vores forskningsgruppe har vi demonstreret priming med rBCG-udtrykkende HIVA-immunogen og boostning med rekombinant viral vektor MVA.HIVA var sikker og fremkaldte HIV-1--specifikke T-celle-immunresponser i BALB/c-mus [31-33]. HIVA-immunogenet, designet af Dr. Tomas Hanke, er sammensat af HIV-1 Gag-proteinet i fuld længde kombineret med flere CTL-epitoper inklusive P18I10-epitoper ved C-terminalen [34]. Derfor sigtede vi på at evaluere, om BCG.HIVA kunne booste T-celle immunresponser induceret af HIV: HPV (L1:P18I10) VLP'er i BALB/c mus.
I denne undersøgelse blev de kimære HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) immunogener designet og produceret ved at bruge 293F ekspressionssystemet. Den kimære L1:P18I10- og L1:T20-proteinekspression blev bekræftet ved immunfarvning. HPV: HIV VLP'erne blev efterfølgende oprenset ved en 3-trinskromatografisk metode, herunder kation- (CEC), størrelsesudelukkelse (SEC) og heparinaffinitets- (H-AC) kromatografi. Derefter blev in vitro-stabiliteten, in vitro-selvsamlingen og morfologien af oprenset HPV: HIV VLP'er bekræftet ved henholdsvis ikke-reducerende SDS-PAGE, molekylærmasseassay og transmissionselektronmikroskopi (TEM). De sekventielle og konformationelle P18I10- og T20-peptider præsenteret på kimæriske HPV: HIV VLP'er blev yderligere karakteriseret ved anti-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 monoklonale antistoffer in vitro ved anvendelse af Western blot og indirekte ELISA-assay. Endelig blev immunogeniciteten af HPV: HIV VLP'er vurderet i BALB/c-musemodellen. Vi demonstrerede, at kimære L1:P18I10 og L1:T20 VLP-baserede vacciner kunne inducere HPV16- og HIV-1-specifikke antistofresponser og kimære L1:P18I10 VLP'er kunne inducere HPV16- og HIV{ {37}}specifikke T-celle-responser i BALB/c-mus. Fordi udvikling og fremstilling af en immunogen HPV: HIV-vaccine stadig er uopnåelig, gav denne undersøgelse en baseline-strategi, der kan være værd at støtte de globale bestræbelser på at udvikle nye kimære VLP-baserede vacciner til at kontrollere HPV- og HIV-1-infektioner.
2. Materialer og metoder
2.1. Konstruktion af BCG.HIVA2auxo.int-vaccinestammen
Rekombinant BCG-udtrykkende HIVA-immunogen blev tidligere konstrueret under anvendelse af den E.coli-mycobakterielle integrative shuttle-vektor p2auxo.int. Konstruktionen af E. coli/mycobakteriel vektor, der udtrykker HIVA-antigen, er tidligere beskrevet [31-33]. BCG.HIVA2auxo.int blev fortyndet i PBS-Tween20 til 2 × 107 cfu/mL, sonikeret for at afbryde bakterieklumper og inokuleret i den bageste madpude eller BALB/c-mus (50 µL, 106 cfu/mus).
cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet
2.2. Bakteriekulturer og transformation
Celler af den auxotrofe glycin-stamme af E. coli, M151GlyA (Invitrogen, Waltham, MA, USA), leveret af Dr. Pau Ferrer, blev dyrket i minimalt M9--derivatmedium (M9-D: Na2HPO4, 6,78 g/L; KH2PO4, 3 g/L; NaCl, {{10}},5 g/L; NH4Cl, 1 g/L, glucose, 1{{20 }} g/L; MgSO4, 2 mmol/L; CaCl2, 0,1 mmol/L; thiamin, 0,1 g/L; FeCl3, 0.{{56 }}25 g/L; AlCl3·6H2O, 0,13 mg/L; ZnSO4·7H2O, 2,6 mg/L; CoCl2·6H2O, 0,47 mg/L; CuSO4·H2O, 4,6 mg/L; H3BO3, 0.03 mg/L; MnCl2·4H2O, 4,2 mg/L; NiCl2·6H2O, 0,02 mg/L; Na2MoO4·2H2O, 0,06 mg/L) suppleret med glycin (70 µg/ml). E. coli M151Gly-cellerne blev transformeret med p2auxo.HIVA-plasmiderne ved elektroporering. Til dette blev E. coli-kulturerne dyrket til en optisk tæthed på 0,9 ved 600 nm og transformeret under anvendelse af en Bio-Rad genpulserelektroporator ved 2,5 kV, 25 µF og 200 Ω. De transformerede celler blev efterfølgende dyrket på M9-D agarplader (komponenter som tidligere beskrevet, med 1,5 % bactoagar tilsat) uden glycintilskud til selektion eller med glycintilskud som kontrol. Den lysin-auxotrofe BCG-stamme, BCG∆lys, venligst leveret af WR Jacobs Jr., BR Bloom og T. Hsu blev transformeret med p2auxo.HIVAint-plasmid-DNA ved elektroporation. Mykobakterierne blev dyrket i Middlebrook 7H9 bouillonmedium eller på Middlebrook agar 7H10 medium suppleret med albumin-dextrose-catalase (ADC; Difco) indeholdende 0,05% Tween 80. L-lysinmonohydrochlorid (Sigma, Kawasaki, Japan) blev opløst i destilleret vand og anvendes som supplement i en slutkoncentration på 40 µg/ml. Til transformation blev BCG dyrket til en optisk tæthed på 1,5 ved 600 nm og transformeret under anvendelse af en Bio-Rad genpulser elektroporator ved 2,5 kV, 25 µF og 1000 Ω. Transformanterne blev derefter dyrket på ADC-suppleret Middlebrook agar 7H10 medium indeholdende 0,05% Tween 80 uden lysintilskud.
2.3. Cellelinjer og cellekultur
293F-cellerne (Tibco), afledt af humane embryonale nyre (HEK) 293-celler, blev dyrket i FreeStyle 293 ekspressionsmedium (Tibco) suppleret med 5 mL/L penicillin-streptomycin (Tibco) og inkuberet i en 37 ◦C inkubator en befugtet atmosfære på 5 % CO2 på en orbital rysteplatform, der roterer med 125 rpm.
2.4. Produktion af L1:P18I10- og L1:T20-proteiner ved hjælp af 293F-ekspressionssystemet
pCDNA3.1-konstruktionen indeholdt L1:P18I10- eller L1:T20-DNA-kodende sekvenser svarende til henholdsvis kimære L1:P18I10- og L1:T20-proteiner. HIV-1 P18I10 CTL-peptidet (RGPGRAFVTI) eller T20-peptidet (YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQE LLELD KWASLWNWF) blev indsat i DE-løkken af HPV16 L1-capsidproteinet. HPV16 L1 DE-løkkesekvensen, der koder for 130-136 aminosyrer, blev erstattet med enten P18I10I10- eller T20-peptid. L1:P18I10- eller L1:T20-DNA-kodende sekvenser blev modificeret med Kozak-sekvens, optimeret med human kodon, flankeret af restriktionsenzymstederne for HindIII og XbaI og klonet ind i pcDNA3.1(+)-vektor ved at bruge GeneArt-gensyntesetjenester ( Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). Det rekombinante plasmid DNA (pDNA) blev transformeret ind i E. coli DH5 kompetente celler (Invitrogen) til amplifikation og ekstraheret ved anvendelse af plasmid Maxi kits (QIAGEN, Hilden, Tyskland). 293F-cellerne blev dyrket med 30 ml FreeStyle 293-ekspressionsmedium i en 125 ml Erlenmeyer-kolbe (Corning, New York, NY, USA) til en densitet på 1,0 × 106/ml og transient transficeret med L1:P18I10 eller L1:T20'erne under anvendelse af forgrenede pedna'er. polyethylenimin med en MW på 25 kDa (PEI-25K) (Polysciences) ved et optimeret forhold mellem DNA og PEI 1:3 (w/w) og DNA til dyrkningsmedium 1:1 (w/v), ifølge til producentens instruktioner [35]. 293F-cellerne blev høstet 96 timer efter transfektion. 293F-cellerne kan nå en sammenflydende tæthed på 3,6 × 106 celler/ml med ca. 50% levedygtighed.
2.5. Immunfluorescensfarvning
Cellerne blev permeabiliseret på objektglasset med 100% kold acetone. Efterfølgende blev de fikserede celler probet med anti-HPV16 L1-antistoffet CAMVIR-1 (Abcam, Cambridge, UK) og fanget med anti-muse IgG-FITC (Sigma). Immunfarvede cellemonolag blev grundigt vasket med PBS og dækket med et monteringsmedium med DAPI (Abcam). Immunfluorescensbillederne blev inspiceret under et omvendt mikroskop ved 40x forstørrelse. Transfektionseffektiviteten blev bestemt af forholdet mellem FITC (grøn)-positive celler og DAPI (blå)-farvede celler.
2.6. Oprensning af HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) VLP'er
I alt 108 transficerede 293F-celler i en 125 ml Erlenmeyer-kolbe (30 ml dyrkningsmedium/kolbe) blev opsamlet ved centrifugering ved 1500 rpm i 5 minutter og vasket to gange med PBS. Cellepelleter blev resuspenderet i lyseringsbuffer formuleret med 1 % Triton X-100, en proteaseinhibitor (1:100) (Millipore) og Benzonase (25 U/ml) (Millipore). Cellelysater blev klaret med et 0,45 µm PVDF-sprøjtefilter (Millipore). HPV: HIV (L1:P18I10 og L1:T20) VLP-prøverne blev serieoprenset ved anvendelse af kationbytning (Capto SP ImpRes, GE, Boston, MA, USA), størrelsesudelukkelse (Capto Core 700, GE) og affinitet (HiTrap Heparin HP , GE) kromatografi. De kromatografiske protokoller blev beskrevet i vores tidligere undersøgelser [36,37] og fulgte producentens protokol [38]. L1-proteinsignalet i hvert oprensningstrin blev karakteriseret ved Western blot-analyse og probet med anti-HPV16 L1-antistof CAMVIR-1 [39].
2.7. Ikke-reducerende SDS-SIDE
HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLP'erne blev blandet med 2 x Laemmli prøvebuffer (BIO-RAD) i fravær eller tilstedeværelse af 5 % (v/v) 2-mercaptoethanol ({{11} }ME) og omsatte ved stuetemperatur (RT) i 24 timer. Prøver blev adskilt af 8-16% TGX pletfri proteingeler (BIO-RAD). Derefter blev gelerne overført til PVDF-membraner. Membranerne blev probet med anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb i en fortynding på 1:4000. Derefter blev membranerne inkuberet med anti-muse IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i en fortynding på 1:4000. Signalet blev udviklet og visualiseret ved kemiluminescens under anvendelse af Western Blot ECL substratkit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Blotbillederne blev erhvervet ved at bruge Odyssey Fc-billeddannelsessystemet.
2.8. Molekylær masseanalyse
HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLP'erne uden 2-ME-behandling blev filtreret ud gennem 1000 kDa molekylvægt cutoff (MWCO) ultrafiltreringsanordninger (SARTORIUS). HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLP'erne med 2-ME-behandling blev ført gennem 100 kDa MWCO ultrafiltreringsenheder (Amicon). Retentaterne blev rekonstitueret til det oprindelige volumen og opsamlet fra filteranordningens prøvereservoir, mens filtraterne blev opsamlet i bunden af centrifugerøret. L1-signalet blev målt ved anvendelse af et dot-blot probet med anti-HPV16 L1-mAb og detekteret ved anti-muse IgG-peroxidasekonjugat (Sigma-Aldrich). Billeder blev erhvervet ved hjælp af Odyssey Fc Imaging System ved en kemiluminescenskanal.
Fordele ved cistanche tubulosa-styrke immunsystemet
2.9. Negativ farvning og transmissionselektronmikroskopi
Efter opladning af de kulstofbelagte kobbergitre (Sigma-Aldrich) under ultraviolet lys i 5 minutter, blev kommerciel HPV16 L1 (Abcam), oprenset L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er ækvilibreret med 20 mM Tris-HCl (pH 7,4, 137 mM NaCl) ) blev absorberet på gitre i 1 min og skyllet tre gange med miliQ vand. HPV: HIV VLP'erne blev negativt farvet med 2% uranylacetat ved pH 4,5 (Sigma-Aldrich) i 1 min. Overskydende farvningsmidler blev fjernet med Whatman kvalitativt filterpapir (Sigma-Aldrich). Gitre blev placeret i et affugterkammer mindst 2 timer før observation. Billeder blev optaget ved hjælp af et transmissionselektronmikroskop (Tecnai Spirit 120 kV) ved henholdsvis forstørrelse SA135K (100 nm) og SA59000 (200 nm).
2.10. Natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgelelektroforese og Western Blotting-analyse
Lige store mængder (500 ng) HPV16 L1-protein (Abcam), oprenset L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er blev blandet med 2 x Laemmli prøvebuffer indeholdende 5 % 2-ME og kogt ved 95 ◦C i 5 min. . Prøver blev adskilt af 8-16% TGX-farvefri proteingeler og derefter overført til en PVDF-membran (Millipore, Burlington, MA, USA) ved hjælp af en Semi-Dry-overførselsenhed (Bio-Rad). Membranen blev blokeret med 5 % skummetmælk i TBST. Derefter blev membranerne probet med anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb i en fortynding på 1:4000, anti-HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) ved en fortynding på 1: 40 og HIV1 gp41 (2F5) mAb (NIBSC, ARP3063) ved en fortynding på henholdsvis 1:4000. Derefter blev membranerne inkuberet med anti-muse IgG Peroxidase Conjugate (Sigma-Aldrich) i en fortynding på 1:4000. Western ECL substrat kit (BIO-RAD) blev brugt til signaludvikling. Blotbillederne blev erhvervet ved at bruge Odyssey Fc-billeddannelsessystemet ved en kemiluminescenskanal.
2.11. Immunisering af mus, indsamling af sera og isolering af splenocytter
Dette er en foreløbig proof-of-concept-undersøgelse for at påvise immunogeniciteten af HPV: HIV VLP'er (L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er). Dosis, administrationsvej og prime-boost-interval for vores HPV: HIV VLP'er henviste til tidligere undersøgelser, der immuniserede mus med bovint papillomavirus (BPV): HIV VLP'er til at inducere antistofresponser [20,21]. Oprenset HPV: HIV VLP'er blev emulgeret med et lige så stort volumen (225 µg pr. hver 0,5 ml dosis) aluminiumhydroxyphosphatsulfat (Thermo Fisher), for at sikre en lignende formulering som den licenserede Gardasil-9 HPV-vaccine [40]. Alle musegrupper havde lige kønsfordeling (mandlige n=4 og kvindelige n=4 pr. gruppe). I gruppe A og B blev BALB/c-mus immuniseret intramuskulært (im) med 10 µg af henholdsvis L1:P18I10 eller L1:T20 VLP'er ved at følge et homologt prime-boost-regime. I gruppe C blev mus inokuleret med 106 cfu BCG.HIVA2auxo.int intradermalt (id, ved foderpuden) og boostet med 10 µg L1:P18I10 VLP'er intramuskulært. I gruppe D blev positive kontrolmus inokuleret med Gardasil- 9 prime efterfulgt af Gardasil-9 boost intramuskulært med 10 µg HPV16 L1 VLP'er. I gruppe E blev negative kontrolmus immuniseret to gange med PBS-buffer. Prime-boost-intervallet var 2 uger. Mus blev aflivet på dag 28. Blodprøver blev opsamlet fra musenes hjerter. Sera blev udvundet ved centrifugering og opbevaret ved -20 ◦C til ELISA-assay. Murine milte blev fjernet og presset individuelt gennem en cellefilter (Falcon) med et 5 ml sprøjtegummistempel. Efter fjernelse af røde blodlegemer med ACK lyseringsbuffer (Lonza) blev splenocytter vasket og resuspenderet i lymfocytmedium R10 (RPMI 1640 suppleret med 10 % føtalt kalveserum (FCS), penicillin-streptomycin, 20 mM HEPES og 15 mM {{ 46}}ME) ved en koncentration på 2 × 107 celler/ml.
2.12. Enzym-Linked Immunosorbent Assay
For at teste de HPV16 L1-- og HIV-1-specifikke antistoffer, der binder til kimærisk HPV: HIV VLP-konstruktioner in vitro, 50 µL af ens koncentration (200 ng/mL) af rekombinant HPV16 L1-protein (Abcam, ab119880) ), oprensede L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er i 50 mM carbonatbicarbonatbuffer (pH=9.6) (Sigma) blev 2-fold seriefortyndet og coatet på Maxisorb-pladerne (Nunc). Pladerne blev inkuberet ved 4 ◦C natten over. Pladerne blev blokeret med blokeringsbufferen (5 % skummetmælk i TBST) ved 37 ◦C i mindst 2 timer. Efter vask to gange med TBST blev de VLP-coatede plader inkuberet med anti-HPV16 L1 CAMVIR-1 mAb i en fortynding på 1:8000, 2F5 mAb (NIBSC, ARP3063) ved en fortynding på 1:8000 og anti- HIV-1 gp120 V3 loop mAb (NIBSC, EVA3012) ved en fortynding på 1:40 i henholdsvis blokerende buffer ved 37 ◦C i 2 timer. Efter vask tre gange med TBST blev pladerne inkuberet med rekombinant protein G peroxidasekonjugat (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) i en fortynding på 1:4000 i blokeringsbuffer ved 37 ◦C i 1 time. TMB blev brugt til at udvikle det enzym-linkede immunosorbent assay (ELISA) signal og stoppet med 50 µL 2M H2SO4. Den optiske densitet (OD) af hver brønd blev målt og registreret ved en bølgelængde på 450 nm ved anvendelse af en EL × 800 absorbans mikropladelæser.
For at måle de VLP-inducerede antistoffer i BALB/c-mus blev mikrotiterpladerne coatet med 50 µL 2 µg/mL rekombinant HPV16 L1-protein (Abcam, ab119880), HIV-1 P18I10-peptid (NIBSC, ARP734), T20-peptid (NIBSC, ARP984) henholdsvis med 50 mM carbonat-bicarbonat-buffer (pH=9.6). Pladerne blev inkuberet ved 4 ◦C natten over. Pladerne blev blokeret med blokeringsbufferen (5 % skummetmælk i TBST) ved 37 ◦C i mindst 2 timer. På samme tid blev sera opsamlet fra gruppe AE-immuniserede mus fortyndet med 5 % skummetmælk i TBST i et forhold på 1:50. Efter vask to gange med TBST blev pladerne inkuberet med de fortyndede sera ved 37 ◦C i 2 timer. Efter vask tre gange med TBST blev pladerne tilsat rekombinant protein G HRP-konjugat i en fortynding på 1:4000 i blokeringsbuffer og inkuberet ved 37 ◦C i 1 time. TMB blev brugt til at udvikle ELISA-signalet og stoppet med 50 µL 2M H2SO4. OD af hver brønd blev målt ved en bølgelængde på 450 nm ved anvendelse af en EL × 800 absorbans mikropladelæser (Biotek).
2.13. IFN-ELISpot-assay
Den enzymbundne immunabsorberende plet-analyse (ELISpot) blev udført under anvendelse af det kommercielle murine IFN-ELISpot-kit (Mabtech, Nacka Strand, Sverige) i henhold til producentens instruktioner. ELISpot-pladerne (MSISP4510, 96-brøndsplader med polyvinylidendifluorid-membraner, Millipore, Middlesex County, MA, USA) blev 70 % EtOH-behandlet og coatet med oprenset anti-muse-interferon- (IFN- )-indfangende monoklonalt antistof fortyndet i fosfatbufret saltvand (PBS) til en slutkoncentration på 5 µg/ml ved 4 ◦C natten over. Derefter blev 2,5 x 105 friske splenocytter tilsat til hver brønd. Efterfølgende blev cellerne fra gruppe A og B stimuleret med henholdsvis 2 µg/mL HPV16 L1 VLP'er og HIV-1 P18I10 peptider. Alle prøverne og kontrollerne blev udpladet i duplikatbrønde. ELISpot-assays blev inkuberet i 16 timer ved 37 ◦C, 5 % CO2. Pladerne blev efterfølgende vasket 5 x med PBS, inkuberet i 2 timer med et biotinyleret anti-IFN-monoklonalt antistof (mAb) fortyndet i PBS 2 % føtalt kalveserum (FCS) til en slutkoncentration på 2 µg/ml, vasket 5 gange i PBS og inkuberet med streptavidin-alkalisk phosphatase-konjugatet i PBS 2% FCS. Derefter blev pladerne vasket 5 gange med PBS før inkubering med 100 µL 5-brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP)/nitroblåt tetrazolium (NBT) substratopløsning (Sigma-Aldrich) , St. Louis, MO, USA). Efter 5-10 minutter blev pladerne vasket med postevand, tørret, og de resulterende pletter blev talt med en ELISPOT-læser (AID, Autoimmun Diagnostika GmbH, Strasberg, Tyskland). For hvert dyr blev gennemsnittet af baggrundsreaktioner trukket individuelt fra alle brøndene for at muliggøre en sammenligning af de IFN-pletdannende celler (SFC)/106 mellem grupper. For at definere positive reaktioner blev en tærskel defineret som mindst fem pletter pr. brønd, og svar, der oversteg det gennemsnitlige antal pletter i negative kontrolbrønde plus tre standardafvigelser af de negative kontrolbrønde.
2.14. Statistisk analyse
Al statistisk analyse blev udført ved hjælp af Prism 6 GraphPad-software (CA, USA). Vi brugte data fra eksperimenter udført over 5 forskellige ELISA-pladecoatingkoncentrationer (0, 50, 100, 150, 200 ng/mL) af rekombinant HPV16 L1-protein (Abcam, ab119880) og HPV: HIV VLP'er. Vi indsamlede data fra 2 grupper (HPV16 L1 og HPV: HIV VLP'er) og indsamlede tre replikater for hver belægningskoncentration. Grafen i Prism viste dataene som et scatterplot, der viser belægningskoncentration (ng/ml) på X-aksen og OD450 på Y-aksen. Da vi antog, at vores in vitro ELISA-data er relateret i et lineært mønster, udførte vi den lineære regressionsanalyse og sammenlignede hældningerne af de to linjer for at bekræfte det datasæt-1 og datasættet-2 (antistof) reaktivitet mellem HPV16 L1 og HPV: HIV VLP'er) er forskellige i deres handlinger. Vi valgte 95 % konfidensintervaller sammen med den bedst passende linje. Prisme overlejrede automatisk en lineær regressionslinje på begge vores datasæt, og den har plottet en stiplet linje, der repræsenterer 95 % konfidensintervaller. Under den lineære regressionsanalyse beregnede softwaren kun middelværdien af Y-værdien af vores datasæt, som viste god tilpasning. Derudover gav Prism os en kommentar, så vi kan konkludere, at forskellene mellem de to pister er ekstremt betydelige.
Vi havde 5 sæt (ELISA) og 4 sæt (ELISPOT) data indsamlet fra museimmuniseringsforsøg. Disse datasæt havde et lige antal (mandlige n=4 og kvindelige n=4) i hver gruppe. Vi brugte Gardasil-9-immuniserede mus som en positiv kontrolgruppe og PBS-immuniserede mus som en negativ kontrolgruppe. Dataene fra vores designet eksperimenter var ikke matchende eller parring. Vi foretog en envejs variansanalyse (ANOVA) for at se, om disse midler var forskellige. Vi kontrollerede først, at vores data passede til den gaussiske normalfordeling. Vi fandt, at nogle grupper af data i ELISA-analysen ikke bestod Gaussisk normalfordelingstesten. Derfor udførte vi en ikke-parametrisk statistisk analyse af disse data. I modsætning hertil var alle grupper af data i ELISPOT-analysen forbi Gaussisk normalfordelingstesten. Derfor udførte vi en parametrisk statistisk analyse af disse data. Signifikansgrænsen og konfidensniveauet blev sat til 0.05 (svarende til et 95 % konfidensinterval). p-værdi, der generelt viser sandsynligheden for, at der er forskelle mellem grupper. Da vores største bekymring for dette eksperiment er, hvad der er forskellene mellem vores grupper, gav de mange sammenligninger i Prism os resultatet af sammenligningen i alle grupper med hver anden gruppe.
2.15. Etiske erklæringer
Seks til otte uger gamle BALB/c-mus blev købt fra Envigo (en Inotiv Company, Chicago, IL, USA) og godkendt af lokale myndigheder (Generalitat de Catalunya, projektnummer 11157) og Universitat Autònoma de Barcelona Ethics Commitee. Dyreforsøgene var strengt i overensstemmelse med dyrevelfærdslovgivningen i Generalitat de Catalunya. Alle forsøgene blev godkendt af den lokale forskningsetiske komité (Procedure 43.19, Hospital de la Vall d'Hebron, Universitat Autònoma de Barcelona).
3. Resultater
3.1. Design af L1:P18I10 og L1:T20 immunogener og evaluering af HPV: HIV-proteinekspression ved brug af 293F ekspressionssystem
P18I10 peptidet fra HIV-1 Env tredje variable domæne (V3) loop og T20 peptid fra HIV-1 Env membranens proksimale eksterne region (MPER) blev indsat i HPV16 L1 DE loop protein for at generere kimærisk L1 :P18I10 og L1:T20 immunogener. De kimære L1:P18I10 og L1:T20 DNA kodende sekvenser blev klonet ind i pcDNA3.1 (+) plasmid DNA ekspressionsvektor til forbigående transfektion i 293F celler (figur 1A). Monomerstrukturerne af HPV16 L1, kimære L1:P18I10 og L1:T20 capsidproteiner blev foreløbigt forudsagt ved hjælp af SWISS-modelserveren (figur 1B). HPV16-hovedcapsidprotein L1 (7cn2.1.R) blev udvalgt som den strukturelle skabelon til at bygge HPV16 L1-, L1:P18I10- og L1:T20-capsidproteinhomologimodelleringen. Sammenlignet med konformationen af det bundne P18I10-peptid i den tidligere undersøgelse [41], løber den N til C-terminale hovedkæderetning af P18I10-peptidet på vores kimære L1:P18I10-protein fra højre mod venstre (Figur 1B, midterste og øverste panel), og de eksponerende P18I10-sidekæder kunne potentielt interagere med T-cellereceptorer (figur 1B, midterste og nederste panel). Sammenlignet med strukturen af HIV-1-fusionsinhibitorpeptidet i det tidligere reviewpapir [42], er det indsatte T20-peptid på HPV16 L1-capsidprotein præsenteret som en -helix-lignende formation (Figur 1B, højre og øverste panel) ), og de eksponerende T20-sidekæder kunne potentielt genkendes af B-cellereceptorer (figur 1B, højre og nederste panel). Da HPV16 L1 capsidproteiner homogent kunne samles til en T=7 icosahedral partikel med 72 pentameriske capsomerer [43], er højdensitetsvisningen af P18I10 eller T20 peptider på den ydre overflade af kimæriske HPV'er: HIV VLP'er er potentielt stærkt immunstimulerende at inducere epitopspecifikke immunresponser.
Figur 1. L1:P18I10 og L1:T20 immunogen design og konstruktion af kimære HPV: HIV VLP'er ved at bruge 293F ekspressionssystem. (A) De kimære L1:P18I10- og L1:T20-DNA-kodende sekvenser blev klonet ind i henholdsvis pcDNA3.1+-ekspressionsvektorer til forbigående transfektion i 293F-celler. (B) Forudsigelse af monomerstrukturer af HPV16 L1 og kimærisk HPV: HIV-capsidproteiner ved at bruge SWISS-modelserveren. HPV16 hovedkapsidprotein L1 (7cn2.1.R) blev udvalgt som den strukturelle skabelon til at bygge HPV16 L1 (venstre panel), L1:P18I10 (midterste panel) og L1:T20 (højre panel) capsidproteinhomologimodellering. Sekundære strukturelle elementer af HPV16 L1 capsidprotein er mærket med bogstaverne h1-h5 for 5 -helixerne. Sløjfer af HPV16 L1 capsidprotein mellem strenge er mærket BC, CD, DE, EF, FG og HI. Sekundære strukturelle elementer af HIV-1 P18I10- og T20-peptiderne L1 er mærket med pilene (øverste panel). Den del af P18I10- og T20-peptidet, der rager ud over overfladen af HPV16 L1-capsidproteinet, er angivet med pilene (nederste panel). (C) Immunfluorescensfarvning af L1-protein i 293F-celler. Følgende pDNA.L1:P18I10 (venstre), pDNA.L1:T20 (midten) og pDNA uden insertion (højre) blev transficeret i 293F-celler. De transficerede celler blev probet med anti-HPV16 L1 mAb og detekteret med anti-muse IgG-FITC (grøn kanal). Cellekerner blev farvet med DAPI (blå kanal). Immunfluorescensbilleder blev slået sammen ved hjælp af Adobe Photoshop
Da HPV16 L1 protein C terminal sekvens medierer cellulært nuklear import maskineri under infektion [44], er nukleare lokaliseringssignaler (NLS) af HPV16 L1 protein blevet identificeret i tidligere undersøgelser [45]. Det monoklonale CAMVIR-1-antistof blev udvalgt til at genkende HPV16 L1-epitop (GFGAMDF, 230-236 aa) [39], og fluorescein-baseret farvestof FITC blev brugt som reporter til at overvåge ekspressionen af L1:P18I10 og L1: T20 proteiner. Immunfluo rtilstedeværelsesbilleder viste tydeligt, at HPV16 L1 (i grøn) hovedsageligt var lokaliseret i kernerne (i blåt) af 293F-celler. Intet L1-signal blev observeret i kontrol plasmid-transsektionerede 293F-celler (pcDNA3.1-plasmid uden insert) (figur 1C). Resultaterne antydede, at både kimære L1:P18I10- og L1:T20-capsidproteiner kunne udtrykkes ved at bruge polyethylenimin (PEI)-medieret transfektion og genkendes af HPV16 L1 CAMVIR-1 monoklonalt antistof.
3.2. Oprensning af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er ved hjælp af kromatografiske metoder
The chimeric L1:P18I10 and L1:T20 proteins were produced by using the 293F expression system. The capture, intermediate purification, and polishing (CiPP) strategy to develop our chromatographic purification protocol is shown in Figure 2A. Flowthrough (FT) in each purification step was collected and the level of L1 protein expression was detected by Western blot analysis using anti-L1 mAb to trace intermediate HPV: HIV VLPs (Figure 2B, C). A cation exchange (CEC) column was selected as a capturing step to isolate HPV: HIV VLPs from host cell proteins (HCPs). The result of CEC FT revealed that most of the L1:P18I10 and L1T20 VLPs were lost in the FT over the CEC column (Figure 2B, C, lane 2). Traditional CEC matrices we used heavily rely on diffusion-limited mass transfer [46]. Large macromolecular complexes, such as our HPV: HIV VLP samples, might be inefficient for the VLP binding to CEC matrices. In order to reach the maximum binding capacities of the CEC column (~50 mg protein/mL resin), we loaded a double amount of soluble cell lysate containing approximately 2% of HPV: HIV VLPs into the CEC column. In the intermediate purification step, HPV: HIV VLPs were purified using a layered-bead size exclusion chromatography (SEC) resin [38]. Large HPV: HIV particles (>700 kDa) were eluted while most of the small impurities were trapped in the beads (Figure 2B, C, lane 5). Due to heparin having a similar structure as DNA and possibly binding to positively charged peptides of conformational HPV16 L1 VLPs, we selected a heparin affinity chromatography (H-AC) as a polishing step to remove heterogeneous or closely related particles [47]. Analysis of densitometry from Western blot analysis and bovine serum albumin (BCA) assay confirmed that purity of L1:P18I10 and L1:T20 VLPs after diafiltration step was high, over 76% (Figure 2B, C, lane 10). The purified L1:P18I10 and L1:T20 VLPs were detected as a band in size of approximately 56 kDa and 58 kDa, respectively. We found that the commercial HPV16 L1 protein and our purified chimeric HPV: HIV VLPs (L1:P18I10 and L1:T20) share a similar protein pattern (a target band >50 kDa og et heterologt nedre bånd<50 kDa). These heterologous lower bands could be detected, especially, when we loaded SDS-PAGE gel with a high amount of chimeric HPV: HIV VLP samples (Figure 2B, C, lane 1 to 10). It is probably caused by proteolytic degradation or heterogeneous formation of L1 proteins. A similar pattern (2 bands) was also found in many previous HPV16 L1 purification studies [23,48–51]. These data demonstrated that the 293F expression system and chromatographic purification methods are feasible approaches to engineer chimeric HPV: HIV VLPs.
Figur 2. Oprensning og karakterisering af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. (A) Skematisk procesflowdiagram af L1:P18I10 og L1:T20 VLP-oprensning ved kromatografi. (B, C) Western blot-analyse af L1:P18I10- og L1:T20-VLP-prøver fra hvert oprensningstrin. Signalet fra L1 i hvert oprensningstrin blev karakteriseret ved Western blot-analyse probet med anti-HPV16 L1 mAb. Pilen angiver molekylvægten af ~56 kDa af L1:P18I10 og ~58 kDa af L1:T20-proteiner. Bane 1: klaret cellelysat (CCL); Bane 2: gennemstrømning (FT) fra kationbytterkromatografi (CEC) prøvebelastning; Bane 3: CEC-eluat; Bane 4: FT fra CEC 2M NaCl-regenereringstrin; Bane 5: størrelsesudelukkelseskromatografi (SEC) FT-1; Bane 6: SEC FT-2; Bane 7: FT fra heparinaffinitetschromatografi (H-AC) prøveladning; bane 8: H-AC-eluat; Bane 9: FT fra H-AC 2M NaCl-regenereringstrin; Bane 10: 10-fold diafiltrering.
3.3. In vitro stabilitet og selvsamling af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er
For at bekræfte, at oprenset HPV: HIV-VLP'er udviste lignende in vitro-stabilitet som HPV16 L1-VLP'er, udførte vi ikke-reducerende SDS-PAGE for at evaluere disulfid-tværbinding af HPV: HIV-capsidproteiner (figur 3A). Det er kendt, at pH, ionstyrke, temperatur [52] og redoxmiljø alle korrelerer med disulfidbindinger af HPV16 L1 capsidproteiner [53]. HPV L1 VLP'er har tendens til at samle sig selv ved lav pH og høj ionstyrke. Maksimal adskillelse af VLP'er kræver typisk eksponering for en høj koncentration af reduktionsmiddel, såsom 5 % 2-mercaptoethanol (2-ME) i en relativt lang varighed [54]. I fravær af reduktionsmidler 2-ME migrerede kun en lille del af HPV-16 L1-, L1:P18I10- og L1:T20-proteinet til monomerer med en tilsyneladende molekylvægt (MW) på 55 kDa . Ca. 70 % af L1-proteinerne var disulfidbundet til større dimerer eller pentamerer med en forudsagt MW på 110 kDa og 280 kDa (figur 3A, bane 2, 4 og 6). I modsætning hertil forekom næsten alle HPV-16 L1-, L1:P18I10- og L1:T20-proteiner i adskillelsesbufferen monomere strukturer i ikke-reducerende SDS-PAGE (figur 3A, bane 3, 5 og 7). Disse resultater indikerede, at in vitro-stabilitet af oprensede L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er udviste lignende disulfid-tværbindingsmønstre som HPV16 L1 VLP'er under samme pH, ionstyrke og termiske betingelser. De oprensede VLP'er ser ud til at blive nedbrudt til niveauet af pentamerer, trimerer og dimerer efter langvarig eksponering for høje koncentrationer af reduktionsmidler. Disse data er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser [53,54] Imidlertid var adskillelsen af HPV: HIV VLP'er stadig langt fra fuldstændig (monomerer).
Figur 3. In vitro stabilitet af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. (A) Disulfid-tværbinding af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er i ikke-reducerende SDS-PAGE. HPV16 L1 VLP'erne, oprensede L1:P18I10 og L1:T20 VLP'erne blev blandet med Laemmli prøvebuffer i fravær eller tilstedeværelse af henholdsvis 2-mercaptoethanol (2-ME) og analyseret ved ikke-reducerende SDS-SIDE. Positionen af L1-monomeren (55 kDa), L1-dimeren (110 kDa) og L1-pentameren (280 kDa) er angivet med pilen. Bane 1: proteinmolekylvægtmarkør; bane 2: HPV16 L1 VLP; Bane 3: HPV16 L1 VLP behandlet med 2-ME; bane 4: L1:P18I10 VLP; Bane 5: L1:P18I10 VLP behandlet med 2-ME; Bane 6: L1:T20 VLP; Bane 7: L1:T20 VLP behandlet med 2-ME. (B) Molekylmasseanalyse af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. Samlede VLP'er ubehandlet med 2-ME (bane 2, 4 og 6) blev filtreret ud gennem 1000 kDa molekylvægt cutoff (MWCO) diafiltreringsanordninger (øverste panel). Adskilte VLP'er behandlet med 2-ME (bane 3, 5 og 7) blev filtreret ud gennem 100 kDa MWCO centrifugalfilterenheder (nederste panel). Retentater (R) blev opsamlet fra filteranordningsprøvereservoirer, mens filtraterne (F) blev opsamlet i bunden af centrifugerør. L1-proteinsignalet blev detekteret ved at anvende et dot blot probet med anti-HPV16 L1 mAb.
To demonstrate that purified HPV: HIV proteins by chromatography are able to self-assemble to icosahedral particles, we further performed molecular mass analysis under the same reducing condition (5% 2-ME). The commercial HPV16 L1, purified L1:P18I10, and L1T20 proteins without reducing agent treatment were filtered out through 1000 kDa molecular weight cut-off (MWCO) diafiltration devices individually (Figure 3B, top panel). The L1 monomers (55 kDa), oligomers (110~200 kDa), or pentameric capsomers (280 kDa) were expected to pass through an ultrafiltration membrane retaining the integral VLPs (MW~20,000 kDa). The L1 signal of commercial HPV16 L1 proteins was detected in both retentates and filtrates. Most of the purified L1:P18I10 and L1T20 proteins formed large particles (>1000 kDa) og blev konserveret i retentater. Mønsteret var sammenfaldende med de data, der blev observeret i ikke-reducerende SDS-PAGE. Selvom alle VLP-grupperne behandlet med 2-ME blev vist i et monomert bånd (~55 kDa) i den ikke-reducerende SDS-PAGE (figur 3A, bane 3, 5 og 7). Imidlertid blev de tilsvarende reducerede VLP'er ikke filtreret ud gennem 100 kDa ultrafiltreringsmembraner (figur 3B, nederste panel). Disse resultater antydede, at kimære HPV: HIV-proteiner var i stand til selv at samle sig til større partikler, men maksimal adskillelse af VLP'er til monomerer krævede ikke kun reduktion af disulfidbindinger, men også andre denaturerende faktorer, såsom pH eller ionstyrke.
3.4. Morfologisk karakterisering af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er
Transmissionselektronmikroskopi (TEM) blev brugt til at undersøge den morfologiske konformation af HPV16 L1 og HPV: HIV VLP'er. HIV-1 P18I10- og T20-peptiderne blev indsat i henholdsvis DE-løkker af HPV16 L1-protein. Disse kommercielle HPV16 L1 og kimære HPV: HIV capsidproteiner kan spontant selv samles in vitro til integrerede VLP'er i en diameter på ca. 50-60 nm (figur 4A-C, højre panel). Sammenlignet med elektronmikrofotografier af HPV16 L1 VLP'er offentliggjort i tidligere undersøgelser [55,56], var den icosaedriske struktur af HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er her mindre kontrast og vag. Det kunne tilskrives det negative farvereagens, som vi brugte i denne undersøgelse. I vores nylige undersøgelse offentliggjort i en tidligere undersøgelse [37] og et andet igangværende papir under peer review (data ikke vist), har vi fået god kvalitet og opløsning af elektronmikrofotografier, når gær- og baculovirus-afledte L1:P18I10 VLP'er (den samme kimære konstruktion) blev ækvilibreret i PBS og negativt farvet med phosphowolframsyre (PTA). Fordi vi brugte de forskellige VLP-produktions- og oprensningssystemer i denne undersøgelse, blev pattedyrcelle-afledte L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er ækvilibreret med Tris-HCl og negativt farvet med uranylacetat. Selvom elektronmikrograferne kunne forbedres, kunne vi stadig observere et klart mønster, at det meste af HPV16 L1-, L1:P18I10- og L1:T20-capsidproteinet kunne samle sig selv til morfologiske VLP'er under TEM-skærm (Figur 4A-C, venstre panel ). Dybest set er HPV VLP'er beskyttet mod aggregering under høje saltforhold [57]. Noget af den påviselige aggregering af HPV16 L1 og HPV: HIV VLP'er i tris-HCl-buffer med lavt saltindhold kunne ses under den nedre forstørrelse (figur 4A-C, venstre panel). Ud fra disse resultater konkluderede vi, at modifikation af delvis L1 DE-løkkesekvens ved indsættelse af HIV-1 P18I10- eller T20-peptider ikke signifikant påvirkede morfologien af HPV: HIV VLP'er.
Figur 4. Elektronmikrofotografier af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. (A) Morfologi af HPV16 VLP'er. (B) Morfologi af L1:P18I10 VLP'er. (C) Morfologi af L1:T20 VLP'er. Oprensede VLP'er blev absorberet på UV-ladede kulstofbelagte kobbergitre og negativt farvet med 2% uranylacetat. Billeder blev erhvervet under transmissionselektronmikroskopi. Søjlen repræsenterer henholdsvis 200 nm ved forstørrelse 59,000 (venstre panel) og 100 nm ved forstørrelse 135K (højre paneler)
3.5. Præsentation og reaktivitet af HPV-16 og HIV-1 epitoperne
For at bekræfte, at sekventielle HIV-1 P18I10- eller 2F5-epitoper blev præsenteret i kromatografioprensede L1:P18I10- eller L1:T20-VLP'er, blev Western blot-analyse og indirekte ELISA udført under anvendelse af epitopspecifikke mAbs. Vi valgte et velkendt monoklonalt antistof (mAb), betegnet CAMVIR-1, for at genkende den højt konserverede epitop (GFGAMDF, aa 230-236) af HPV16 L1-protein [39,58]. En tidligere publiceret mAb rettet mod HIV-1 gp120 V3 loop-epitop (RIQRGPGRAFVTIGK, aa308-322) blev valgt til at påvise sekventielle P18I10-epitoper (RGPGRAFVTI, aa311-320) [59]. På den anden side blev det brede neutraliserende antistof (bnAb), der genkender HIV-1 gp41 2F5-epitop (ELDKWA) mod en bred vifte af laboratorie-HIV-1-stammer valgt til T20-peptidkarakterisering [ 60,61]. Western blot-assay undersøgt med HPV16 L1 mAb viste bånd 55, 56 og 58 kDa svarende til henholdsvis HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 protein (figur 5A, B, venstre). Molekylvægten (MW) af L1:P18I10-protein svarede til HPV16 L1-protein (figur 5A, venstre). Båndet svarende til L1:T20-protein blev observeret lidt højere end HPV16 L1-protein, som forudsagt fra den yderligere aminosyresekvens (figur 5B, venstre). Båndene på ca. 56 og 58 kDa, svarende til L1:P18I10- og L1:T20-protein, blev påvist i Western blot-assay probet med henholdsvis anti-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 mAb (figur 5A, B, højre ). Vi troede, at molekylvægten (MW) af anti-2F5-farvet L1:T20-protein var korrekt og passede til de forventede 58 kDa (figur 5B, til højre). MW for anti-HIV-1 gp120 V3-farvet L1:P18I10-protein er dog en smule lavere (figur 5A, til højre). Dette kunne tilskrives den heterogene struktur af kimære L1:P18I10-proteiner. Da den sekventielle epitopkonformation kan gå tabt under denatureringsbetingelserne i SDS-PAGE. Derfor udførte vi yderligere indirekte ELISA for at demonstrere det konformationelle P18I10-peptid korrekt præsenteret på vores kimære L1:P18I10 VLP'er (figur 5E). På den anden side genkendte anti-HIV-1 gp120 V3 loop-antistoffet, som vi brugte, hele HIV{103}} V3-løkken i stedet for P18I10-epitopen. Som følge heraf var det samlede anti-V3-signal lavere (figur 5A, B, højre paneler). Alligevel indikerede disse resultater, at de sekventielle HIV-1 P18I10- og T20-peptider er præsenteret i HPV: HIV VLP'er.
Figur 5. Præsentation af HPV-16 og HIV-1 epitoper. (A, B) Sekventiel epitopdetektion af kimære L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. De oprensede L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er blev analyseret ved Western blot under anvendelse af anti-HPV16 L1, anti-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 mAb. HPV16 L1 VLP'erne blev anvendt som kontrol. Molekylvægten af L1 (55 kDa), L1:P18I10 (56 kDa) og L1:T20 (58 kDa) proteiner er angivet med pilen. Bane 1: proteinmolekylvægtmarkør; bane 2: HPV16 L1-protein; bane 3: L1:P18I10 protein; Bane 4: L1:T20-protein. (C, D) Binding af HPV16 L1 mAb til kimære L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. (E) Binding af anti-HIV-1 gp120 V3 mAb til kimære L1:P18I10 VLP'er. (F) Binding af HIV-1 2F5 mAb til kimære L1:T20 VLP'er. Linjegrafen af indirekte ELISA'er blev udført for at detektere de konformationelle epitoper af rekombinante HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er bundet til henholdsvis anti-L1, anti-HIV-1 gp120 V3 eller 2F5 mAbs. Data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter. En simpel lineær regressionstest blev udført for at sammenligne linjeforskellen for oprensede L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er med standardkurven for kommercielle L1 VLP'er; ns: ikke signifikant; ** p < 0,01.
For at bestemme, om HIV{{{{50}}}} konformationelle epitoper præsenteret på HPV: HIV VLP'er kunne identificeres af de gp120 V3 og 2F5 neutraliserende antistoffer in vitro, udførte vi desuden en indirekte ELISA-analyse for at kontrollere den epitopbindingsspecificitet og reaktivitet. Som vist i figur 5C blev D, HPV16 L1, L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er genkendt af anti-L1 mAb. Vi udførte lineær regressionsanalyse for at sammenligne hældningen af hver fortyndingslinje. Resultaterne afslørede, at L1-epitopbindingsspecificiteten af enten L1:P18I10 eller L1:T20 VLP'er ikke var forskellig fra HPV16 L1 VLP'er. Desuden var anti-HIV-1 gp120 V3 mAb i stand til at binde L1:P18I10 VLP'er, men ikke HPV16 L1 VLP'er (figur 5E). Derudover kunne 2F5 mAb'erne genkende L1:T20 VLP'er, men ikke HPV16 L1 VLP'er (figur 5F). Efter lineær regressionsanalyse var forskellen i gp120 V3 epitopbindingsspecificitet mellem L1:P18I10 og HPV16 L1 ekstremt signifikant (p < 0,01%). 2F5-epitopbindingsspecificiteten af L1:T20 VLP'er var signifikant forskellig fra HPV16 L1 VLP'er (p < 0,01%). Dette mønster afslørede, at hydrofobe cellulære lipider ikke var nødvendige for bindingen af 2F5-neutraliserende antistoffer til HPV: HIV VLP'er in vitro. Selvom reaktiviteten af anti-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 neutraliserende antistoffer mod HPV: HIV VLP'er er relativt mild, var bindingen af anti-HIV-1 gp120 V3 og 2F5 mAb til HPV: HIV VLP'er signifikant epitopspecifik.
3.6. Immunogenicitet af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er efter BALB/c museimmunisering
Vi evaluerede de HPV16- og HIV-1-specifikke immunreaktioner efter BALB/c museimmunisering med L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. Immuniseringsskemaet er vist i figur 6A. Da VLP-induceret immunogenicitet efter mucosal administration generelt var svagere end efter systemisk administration, blev mus immuniseret intramuskulært med en sjettedel af Gardasil-9 HPV16 L1-dosis [22,62]. Aluminiumhydroxyphosphatsulfatadjuvansen til en dosis (10 µg/100 µL) kimærisk HPV: HIV VLP'er blev justeret til den samme koncentration (1 mg/1 ml) som Gardasil-9. For at vurdere kønsforskellen i resultaterne af vaccination blev en sammenligning af antistofresponser mellem hanmus (n=4) og hunmus (n=4) evalueret. I gruppen af L1:P18I10 VLP, L1:T20 VLP og Gardasil-9 var anti-HPV16 L1-antistofresponser fra hunmus i gennemsnit højere end disse hanmus (figur 6B). 2 ud af 4 (50%) L1:P18I10 VLP-immuniserede hunner, 3 ud af 4 (75%) L1:T20 VLP-immuniserede hunner og alle (100%) Gardasil-immuniserede hunmus fremkaldte højere titer af anti-L1-antistoffer end hanmus. Anti-L1-responser induceret af hunmus i Gardasil-9-gruppen var signifikant højere end hanmus (p=0.0041) (figur 6B). Et meget lavt niveau af anti-L1-antistofresponser blev påvist i gruppen af BCG.HIVA-priming og L1:P18I10 VLP-boosting. Dette mønster svarer til tidligere resultater, der beskriver, at BCG overvejende inducerer T-celle-responser snarere end IgG-produktion [63].
Figur 6. Induktion af humorale immunresponser med L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er i BALB/c-mus. Immuniseringsskemaet er afbildet i (A) Alle musegrupper havde lige kønsfordeling (han n=4 og hun n=4). Gruppe A og B: homolog prime-boost immunisering med 10 µg L1:P18I10 eller L1:T20 VLP'er intramuskulært (im); Gruppe C: priming med 106 cfu rBCG.HIVA intradermalt (id) og boostning med 10 µg L1:P18I10 VLP'er im; Gruppe D: homolog prime-boost-vaccination med Gardasil-9 indeholdende 10 µg HPV16 L1 VLP'er im; Gruppe E: immunisering to gange med PBS-buffer. Prime-boost-intervallet var 2 uger. Slutpunktet for dette forsøg var på dag 28. Sera blev opsamlet og fortyndet ved en titer på 1:50 til ELISA-assay. (B) HPV L1-specifik IgG i han- og hunmus. (C–E) Epitopspecifik IgG induceret af L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er. ELISA blev udført for at analysere anti-L1, anti-P18I10 og anti-T20 IgG induceret af BALB/c mus efter forskellige prime-boost kombinationer som beskrevet ovenfor. Data er vist som middel ± SD Envejs ANOVA (ikke-parametrisk) test blev udført for at sammenligne forskelle mellem grupper. OD: optisk tæthed. Ns ikke signifikant; ** p < 0,01
Vi vurderede, om mus immuniseret med L1: P18110 og L1: T20 VLP'er kunne inducere HPV-16 L1-specifikke og HIV-1 epitopspecifikke antistoffer i BALB/c mus. VLP-inducerede IgG-antistoffer i murine sera blev målt ved ELISA coatet med henholdsvis rekombinant HPV16 L1-protein, P18I10 eller T20-peptider. En statistisk forskel i L1-specifik IgG ved en serumtiter på 1:50 blev påvist i Gardasil-9-gruppen sammenlignet med PBS-kontrolgruppen (p=0.0039). Anti-L1-reaktionerne blandt Gardasil-9, L1:P18I10 og L1:T20 VLP-immuniserede mus var ens og afveg ikke signifikant (figur 6C). BCG.HIVA2auxo.int prime- og L1:P18I10 VLP-boost-musene fremkaldte et meget lavt niveau af anti-L1 IgG. Disse resultater antydede, at HPV: HIV VLP-immuniserede mus producerede det samme niveau af anti-L1 IgG som Gardasil-9-immuniserede mus (figur 6C). Selvom L1:P18I10 VLP-gruppen numerisk ser ud til at have en tendens til et højere niveau af P18I10-epitopspecifikt IgG end andre immuniseringsgrupper, var disse forskelle ikke statistisk signifikante (figur 6D). I nogle af L1:P18I10 VLP-immuniserede mus (4 ud af 8, 50%) blev der observeret højere anti-P18I10-bindende antistoffer sammenlignet med Gardasil-9-immuniserede mus. Alternativt afslørede en T-testanalyse, at forskellen mellem L1:P18I10 VLP- og Gardasil-9-gruppen var signifikant (p=0.005) (data ikke vist). I L1:T20 VLP-gruppen blev der påvist et signifikant højere antistofrespons mod T20-peptidet sammenlignet med Gardasil-9-gruppen (p=0.0083). Som forventet var anti-T20-titere upåviselige i Gardasil-9, PBS, L1:P18I10 VLP og BCG.HIVA prime kombineret med L1:P18I10 VLP-boost-grupper (figur 6E). Titeren af det T20-peptidspecifikke antistof var relativt lav. Dette skyldes sandsynligvis: (1) T20 er et subdominant peptid; (2) fremkaldelse af MPER- eller 2F5-neutraliserende antistoffer kræver peptid-lipid-konjugater (figur 6E). Samlet set viste vores resultater, at L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er kunne inducere HPV16- men svage HIV-1-specifikke antistofresponser hos mus.
cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet
For at evaluere de HPV- og HIV-specifikke T-celle-immunresponser i mus fulgte vi immuniseringsskemaet vist i figur 7A. Derudover blev heterolog BCG.HIVA2auxo.int priming og L1:P18I10 VLPs boosting sammenlignet med homolog L1:P18I10 VLP prime og boost immunisering for at evaluere frekvensen af specifikke HPV16 og HIV-1 T-celle immunresponser. Der var ingen forskelle mellem Gardasil-9- og PBS-grupper med hensyn til IFN-sekretion efter splenocytstimulering med HPV16 L1 VLP'er. Forskelle i L1--specifik IFN-sekretion var heller ikke signifikante mellem L1:P18I10 VLP- og Gardasil-9-grupper. Vi udledte, at den svage L1--specifikke IFN-sekretion kan tilskrives den lave koncentration (2 µg/ml) af HPV16 L1-VLP'er brugt som stimuli. Gruppen af BCG.HIVA2auxo.int prime og L1:P18I10 VLP boost inducerede højere frekvens af IFN-udskillende splenocytter, og signifikante forskelle i IFN-sekretion blev observeret sammenlignet med mus vaccineret med Gardasil-9 gruppe (p {{36 }}.0103). 3 ud af 8 mus (~38%) fremkaldte de højeste L1--specifikke IFN-reaktioner (figur 7B). Dette kan tilskrives den uspecifikke adjuvansitet af BCG ifølge vores tidligere undersøgelser [64-66]. Den tydelige priming-effekt, selv af vildtype-BCG, er på linje med rBCG-derivaternes evne til at fungere som potente adjuvanser til efterfølgende boosting-vacciner [64,65]. Med hensyn til HIV-1-specifikke T-celle-responser blev den højeste samlede størrelse af IFN-pletdannende celler (SFC)/106 splenocytter observeret i BCG.HIVA2auxo.int-primede mus sammenlignet med mus, der fik Gardasil{{54} } vacciner eller L1:P18I10 VLP'er. Mus primet med BCG.HIVA og boostet med L1:P18I10 VLP'er fremkaldte signifikant højere IFN-sekretion sammenlignet med mus vaccineret med L1:P18I10 VLP homolog prime-boost (p=0.0268). Derudover blev der observeret en signifikant højere IFN-sekretion hos mus vaccineret med L1:P18I10 VLP'er sammenlignet med mus, der modtog Gardasil-9-vacciner (p=0.0157) (figur 7C). Som forventet var IFN-sekretionen ikke påviselig i Gardasil-9- og PBS-grupper. Disse resultater viste, at (1) L1:P18I10 VLP'er fremkaldte HIV-1-specifikke T-celle immunresponser; (2) L1:P18I10 VLP'er fremkaldte HPV-specifikke T-celle-immunresponser, og (3) BCG.HIVA2auxo.int kunne booste de HIV-1-specifikke T-celle-immunresponser fremkaldt af L1:P18I10 VLP.
Figur 7. Induktion af HPV16- og HIV-1-specifikke T-celleresponser ved hjælp af kimære L1:P8I10-VLP'er og BCG.HIVA i BALB/c-mus. Immuniseringsskemaet er afbildet i (A). Alle musegrupper havde lige kønsfordeling (han n=4 og kvindelig n=4). Gruppe A: homolog prime-boost immunisering med 10 µg L1:P18I10 VLP'er intramuskulært (im); Gruppe B: priming med 106 cfu rBCG.HIVA intradermalt (id) og boostning med 10 µg L1:P18I10 VLP'er im; Gruppe C: homolog prime-boost-vaccination med Gardasil-9 indeholdende 10 µg HPV16 L1 VLP'er im; Gruppe D: immunisering to gange med PBS-buffer. Prime-boost-intervallet var 2 uger. Slutpunktet for dette forsøg var på dag 28. Splenocytter blev isoleret til IFN-ELISpot assay. T-celleimmunresponser på HPV16 og HIV-1 blev vurderet ex vivo af IFN-ELISpot efter splenocytstimulering med HPV16 L1 VLP og P18I10 peptid. (B, C) HPV16 L1- og HIV-1 P8I10-specifikke T-celleresponser fremkaldt af L1:P8I10 VLP'er og BCG.HIVA prime kombineret med L1:P18I10 VLP boost. Data er vist som median ± SD En envejs ANOVA-test blev udført for at sammenligne forskelle mellem grupper. Ns ikke signifikant; *p < 0,05.
4. Discussion
Både HPV16 og HIV-1 er seksuelt overførte sygdomme og er i øjeblikket i fokus for mange vaccineundersøgelser. Selvom HPV-profylaktiske vacciner er blevet kommercialiseret, og HIV-1-overførsel er blevet stærkt kontrolleret af antiretroviral behandling (ART) og PrEP, er en effektiv, sikker og overkommelig kimær HPV: HIV-vaccine mod begge vira et presserende behov. I denne undersøgelse (1) viste vi, at 293F-ekspressionssystemet og den kromatografiske oprensningsmetode kunne være mulige fremgangsmåder til at producere og oprense kimære L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er; (2) vi bekræftede, at insertionen af P18I10- eller T20-peptider i DE-løkken af HPV16 L1-capsidproteiner ikke påvirkede in vitro-stabilitet, selvsamling og morfologi af kimæriske HPV: HIV VLP'er; (3) De sekventielle og konformationelle P18I10- eller T20-peptider udsat for DE-løkker af kimærisk HPV: HIV-VLP'er kunne påvises af anti-HIV-1 gp120 V3- og 2F5-neutraliserende antistoffer in vitro; (4) De kimære L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er kunne fremkalde HPV, men svage HIV-1-specifikke bindingsantistoffer i BALB/c mus. Endvidere påvirkede insertionen af HIV-1 P18I10- eller T20-peptider i HPV16 L1-protein ikke HPV16 L1--specifik antistofinduktion in vivo; (5) L1:P18I10 VLP'er kunne inducere både HPV16- og HIV-1-specifikke T-celle-responser; (6) BCG.HIVA prime og L1:P18I10 VLP boost fremkaldte den højeste størrelse af IFN-producerende splenocytter i sammenligning med L1:P18I10 VLPs homologe prime boost i BALB/c mus. Disse resultater understøttede yderligere udvikling af HIV-1-vacciner baseret på rBCG og kimære HPV: HIV VLP'er. Alt i alt giver denne undersøgelse en baseline-strategi, der kan være værdig til at understøtte den globale indsats for at udvikle nye kimære VLP-baserede vacciner til at kontrollere HPV- og HIV-infektioner.
I denne undersøgelse kunne L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er inducere det samme niveau af anti-HPV16 L1-bindende antistoffer som HPV Gardasil-9-vaccinen. Imidlertid fremkalder L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er kun lave niveauer af P18I10 og T20 epitopspecifikke HIV-bindende antistofresponser. Vi antog, at det kunne skyldes, at ELISA-assayplader var belagt med henholdsvis rekombinant HPV16 L1-protein, HIV-1 P18I10-peptid og HIV-1 T20-peptid. De murine anti-L1-antistoffer induceret af vores L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er kan målrette mod flere bindingsepitoper af L1-protein. Derimod målretter murine anti-HIV-1-antistoffer fremkaldt af vores L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er kun et enkelt HIV-peptid (P18I10 eller T20) på HPV: HIV VLP'er. Som følge heraf var de samlede maksimale OD450-værdier for anti-HIV-1-bindende antistoffer meget lavere end anti-HPV16 L1-antistoffer.
Grunden til, at vi valgte HPV16 L1 capsidprotein DE-løkke som den foreløbige indsættelsesregion af HIV-1-immunogen henviste til en tidligere undersøgelse, der immuniserede mus med bovint papillomavirus (BPV): HIV-VLP'er til at inducere antistofresponser [20]. Det er kendt, at epitoperne lokaliseret i overfladeeksponerede DE- og FG-løkker af HPV L1-hovedkapsidproteinerne dominerende bidrager til de vaccine-inducerede krydsneutraliserende antistoffer [67]. Desuden er det blevet vist af tidligere undersøgelser, at indsættelse af HIV-1 MPER i BPV L1 DE-løkken kunne inducere delvist neutraliserende antistoffer, der specifikt genkender den native konformation af MPER i HIV-1 Env [20]. Imidlertid har ingen data vist, om det rekombinante BPV L1:MPER VLP påvirker immunogeniciteten og neutraliseringen mod BPV efter indsættelse af HIV-1 MPER i BPV L1-protein. I vores undersøgelse med HPV16 L1 VLP'er som HIV-antigenleveringsvektor har vi observeret, at HIV-1-peptidindsættelse ikke har ændret HPV L1-strukturen, og at de kimære HPV: HIV-proteiner stadig har kapaciteten til at danne VLP'er. Derudover udførte vi konceptet med immunbrobinding for at demonstrere sammenlignelige immunresponser mellem en HPV: HIV VLP-kandidat (vores) og en godkendt VLP-baseret HPV-vaccine (licenseret Gardasil-9). Vores data afslørede, at insertionen af HIV-1 P18I10- eller T20-peptid i kimærisk HPV: HIV-VLP'er kunne fremkalde en lignende titer af HPV16 L1-specifikke bindingsantistoffer sammenlignet med HPV Gardasil-9 vaccine. De typespecifikke anti-HPV16 L1-bindende antistoffer observeret med licenseret HPV Gardasil-9 VLP-vaccine sammenlignet med kimære versioner af HPV Gardasil-9 VLP-vaccine var i overensstemmelse med vores data.
Længden og stedet for optimalt HIV-1 fremmed antigen inkorporeret i HPV16 L1 VLP'erne og in vitro-stabiliteten af det resulterende kimære HPV: HIV VLP'er bør verificeres før museimmunisering. Vores nuværende undersøgelse har vist, at indsættelsen af P18I10 eller T20 peptider i HPV16 L1 protein ikke påvirkede in vitro stabilitet, selvsamling og morfologi af kimæriske HPV: HIV VLP'er. Disse resultater var i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der indikerer, at indsættelse af HIV-1 MPER-domæne i BPV L1 DE-løkkesekvensen ikke påvirkede kapaciteten af BPV L1-capsidprotein selv-samler til VLP'er [20]. Dybest set bidrager epitoper lokaliseret i overfladeeksponerede DE- og FG-løkker af HPV L1-capsidproteinerne dominerende til at inducere L1--specifikke krydsneutraliserende antistoffer [67]. Her demonstrerede vi, at insertionen af HIV-1 P18I10- eller T20-peptider i HPV16 L1 DE-løkken ikke påvirkede L1--specifik antistofinduktion af kimærisk HPV: HIV-VLP'er efter museimmunisering. Derudover blev HIV-1 P18I10- eller T20-epitoperne på HPV16 DE-løkker af kimærisk HPV: HIV-VLP'er blev påvist in vitro og var immunogene in vivo. HPV16 L1 VLP'er udgør et potentielt stillads til overfladevisning af HIV-1-epitopen af interesse. I denne undersøgelse har vi udført indirekte ELISA for at demonstrere det konformationelle P18I10- og T20-peptid præsenteret på overfladen af vores kimære HPV: HIV VLP'er. I fremtiden kan immun-elektronmikroskopi også være en yderligere tilgang til at demonstrere P18I10 eller T20 antigen strukturel lokalisering og organisering inden for HPV: HIV VLP'er.
Selvsamling er et repræsentativt indeks for in vitro-stabiliteten af HPV16 L1 VLP'er. Det er kendt, at pH, ionstyrke, temperatur [52] og redoxmiljø alle korrelerer med disulfidbindinger af HPV16 L1 capsidproteiner [53]. De tidligere værker om papillomavirus VLP'er antydede vigtigheden af disulfidbindinger for L1 major capsid-selvsamling [68,69]. Disulfiddannelse indikerede et højere cystein af L1 capsidprotein i en passende geometri [53]. Disse disulfid-tværbindinger forbinder resterne 175 og 428 (for HPV16), der stabiliserer HPV-virioner og VLP'er [70]. I denne undersøgelse analyserede vi intermolekylære disulfid-tværbindingsmønstre som indirekte bevis for at bevise, at vores L1:P18I10- og L1:T20-capsidproteiner har en tendens til selv at samle sig in vitro. I figur 3A viste vi, at oprensede L1:P18I10 og L1:T20 VLP'er præsenterede lignende intermolekylære disulfid-tværbindingsmønstre som HPV16 L1 VLP'er under samme pH, ionstyrke og termiske betingelser. I figur 3B viste vi yderligere, at oprensede L1:P18I10- og L1:T20-proteiner var i stand til selv at samle sig til større partikler (større end L1-pentamer MW 280 kDa) in vitro. Derfor, sammen med det morfologiske selvsamlings-VLP-mønster (selvom den icosaedriske struktur ikke var helt god) observeret i figur 4, konkluderede vi vores oprensede kimære HPV: HIV-VLP'er er stabile in vitro. Udover VLP-stabilitet bør mange andre kritiske faktorer, der kan påvirke immunogeniciteten af kimærisk HPV: HIV-VLP'er overvejes, såsom immunogen-indsættelsessted blandt forskellige loops af VLP'er [71], dosis, prime-boost-intervaller og administrationsvej [22] , etc.
P18I10-peptiderne afledt af HIV-1 gp120 V3-løkken præsenteres i HIV-inficerede celler af major histocompatibility complex (MHC-I) klasse I-molekyler [26]. CD8+, cytotoksiske T-lymfocytter (CTL), kunne genkende MHC-I-begrænsede P18I10-antigener og udskille en række cytokiner, såsom IFN- for at eliminere HIV-inficerede celler [72-75]. Rekombinant viralt eller plasmid-DNA er gode vaccinebærere til at udtrykke P18I10-peptider i værtsceller og inducere P18I10-specifikke cellulære responser gennem MHC-I-vejen [76-79]. For eksempel var et kombineret regime af DNA-prime og modificeret vacciniavirus Ankara (MVA) boost tilstrækkelig til induktion af IFN- og CTL-responser mod P18I10-epitopen [79]. Tværtimod præsenteres eksogene P18I10-peptider ikke effektivt for CD8+ T-celler af MHC-I-vejen [80,81] og kræver deltagelse af passende adjuvanser [82-85] eller antigenbærere, som f.eks. VLP'er. For eksempel var immunogeniciteten af syntetiske P18I10-peptider suppleret med adjuvanser marginal på grund af fraværet af T-hjælper-determinanter [82-85]. Det er tidligere blevet rapporteret, at HIV-1 Gag VLP'er [86], hepatitis B overfladeantigen (HBsAg) VLP'er [87], parvovirus VP2 VLP'er [88] og papillomavirus L1 VLP'er [17-19] kunne fungere som leveringsvektorer for MHC-I-begrænset CTL-epitoppræsentation in vivo. Selvom mekanismen for VLP-induceret MHC-I-begrænsede T-celle-responser stadig er uklar, kan den partikelformige struktur af VLP'er gavne endocytisk optagelse af makrofager eller dendritiske celler, og dermed få adgang til cytosolen og efterfølgende gå ind i typisk MHC-I-vej [89, 90]. Derudover blev den MHC-I-begrænsede P18I10-determinant observeret at inducere CD4+-hjælper-T-celle-responser gennem en MHC-II-vej [91,92]. Hybrid BPV1 L1 VLP'er kan bruges som antigene epitopbærere til at fremkalde terapeutiske virusspecifikke CTL-responser gennem MHC-I- og MHC-II-veje [17,19], hvilket giver en lovende strategi for vaccinedesignet til at kontrollere virusinfektion. Nogle tidlige undersøgelser indikerede også BPV L1-VLP'er, der udtrykker HPV16 E7-epitop eller P18I10-epitop af HIV-1 gp120 V3-loop-inducerede slimhindeoverflader og også systemisk VLP-epitopspecifik humoral og T-celleimmunitet [18]. I overensstemmelse med tidligere undersøgelser har vi foreløbigt vist, at vores kimære HPV: HIV (L1:P18I10) VLP'er kunne inducere HIV-specifikke T-celle immunresponser i BALB/c mus efter splenocytstimulering med P18I10 peptid. Derudover forbedrede BCG.HIVA-priming de HIV-1-specifikke T-celle-immunresponser hos mus. Imidlertid ville de multifunktionelle T-celle-immunresponser induceret af L1:P18I10 VLP'er kræve yderligere immunologiske undersøgelser.
Bredere CD8+ T-celleresponser mod flere konserverede CTL-epitoper er gavnlige til at overvinde HIV-1 genetisk diversitet og undslippe [7,93-100]. Det rationelle design af HIV-1 T-celle-immunogener, såsom HIVA, burde have potentialet til at reagere på flere CTL-epitoper [34]. HIV-1 HIVA-immunogenet, designet af Dr. Tomas Hanke, er sammensat af fuldlængde HIV-1 Gag-proteinet kombineret med flere CTL-epitoper inklusive P18I10-epitoper ved C-terminalen [34]. DNA, MVA og rBCG blev udvalgt som HIVA-immunogenleveringsbærere og inducerede høj størrelse og bredde af CTL-epitopspecifikke cellulære responser ved at bruge heterologe prime-boost-regimer i muse- og ikke-humane primater (NHP)-modeller [34.101]. Vores tidligere undersøgelser har vist, at BCG.HIVA prime i kombination med MVA.HIVA boost fremkaldte HIV-1-specifikke IFN-producerende CD8+ T-celler i BALB/c mus [31-33.102]. Interessant nok kunne VLP'er være en potentiel booster til at øge HIV-specifikke cellulære responser i den heterologe immunisering med rBCG [29,30] eller DNA-vacciner [103,104]. For eksempel kunne rBCG-udtrykkende HIV-1 Gag-protein effektivt prime T-celleimmunsystemet til et boost med Gag VLP'er i NHP-modeller [29,30]. I den aktuelle undersøgelse har vi vist, at BCG.HIVA-priming kunne booste T-celle-immunresponserne induceret af HPV: HIV (L1:P18I10) VLP'er. Vi vil yderligere undersøge omfanget af polyfunktionelle CD4+-, CD8+- og hukommelses-T-celle-responser genereret af dette rBCG-prime- og VLP-boost-regime.
cistanche tubulosa-forbedrer immunsystemet
I øjeblikket fokuserer vores forskningsgruppe på udviklingen af lovende rBCG: HIV-vacciner, der udtrykker nye HIV-1 T-celle immunogener, såsom tHIVconsvX og HIVACAT (HTI) T-celle immunogen, for at forbedre HIV-1 variant match og T-celle respons bredde. 2. generations HIVconsvX-immunogener blev designet ved at omdefinere gruppe M-konserverede regioner og bruge et bivalent mosaikdesign for at maksimere matchningen af potentielle 9-mer T-celle-epitoper i vaccinen til globale varianter [64]. HTI-immunogenet blev designet til at dække T-celle-mål, mod hvilke T-celle-responser overvejende observeres hos HIV-1-inficerede individer med lav HIV-1 viral belastning [65,66]. Fordi papilloma-VLP'er har vist sig at være flere CTL-epitopbærere [17], sigtede vi mod at konstruere kimære HPV16 L1-VLP'er, der bærer flere konserverede HIV-1 CTL-epitoper i kombination med rBCG-udtrykkende ThivconsvX- eller HTI T-celle-immunogener for at inducere bredere CTL-immunresponser mod HIV-1. Den høje tæthed og multiple kopier af HIV-1 CTL-epitopen præsenteret på kimærisk HPV: HIV VLP'er kan forbedre antigenleveringen til immunsystemet og inducere en højere frekvens af CTL-responser. I modsætning hertil er det mere sandsynligt, at rekombinant BCG genererer en lavere frekvens af CTL-responser på grund af langsom replikation in vivo. Fordi BCG har en tydelig indflydelse på differentieringen af T-celler, hvilket betyder, at BCG kan inducere hukommelse af CD8+ T-celler gennem deltagelse af CD4+ T-hjælperceller [105], er denne immunogene egenskab kan gøre BCG egnet som et primingmiddel i heterologe prime-boost-regimer. Derfor forventede vi, at vores HPV: HIV VLP'er kunne se ud til at være en lovende booster til at øge omfanget og bredden af HIV-1 CTL-responser, når de primer med et rekombinant BCG, der udtrykker nyt HIV-1 T-celle-immunogen .
T20-peptidet indeholder en meget konserveret lineær epitop 2F5 (ELDKWA). 2F5-antistoffet indsamlet fra langtids HIV-inficerede patienter blev rapporteret at have bredt neutraliserende effekt [106,107]. MPER af gp41 anses for at være dårligt immunogen, måske relateret til dets placering tæt på det cellulære og virale phospholipid-dobbeltlag [108]. Brug af DNA-vektorer, der præsenterer MPER i et lipidmiljø, er gavnligt til at inducere gp41-specifikke nAbs [109-111]. For eksempel er HIV-1 T20-kodende DNA-vacciner, designet af Dr. Britta Wahren, blevet påvist at inducere cross-clade neutraliserende antistof (nAb)-responser [109]. I modsætning hertil har mange tidlige forsøg på at inducere nAbs rettet mod gp41 ved at bruge peptid- eller underenhedsvaccinestrategier mislykkedes [112-116]. For nylig viste nogle undersøgelser, at BPV L1-VLP'er, der udtrykker 2F5-epitop eller MPER af HIV-1 gp41-inducerede 2F5--specifikke antistoffer i mus, resulterede i cross-clade-neutralisering [20,21]. Et lignende immunogenicitetsmønster blev fundet, når hepatitis B overfladeantigen (HBsAg) blev fusioneret med HIV-1 2F5-epitop eller MPER [59.117-119]. Her demonstrerede vi, at præsentationen af HIV-1 T20- og P18I10-peptid i vores kimære HPV16 L1-VLP kunne inducere antistofresponser mod HIV-1 og HPV16. Neutraliserende epitoper stabiliseret på et konformationelt stillads, såsom HIV-1 funktionelle spikes eller VLP'er, kunne være hovedstrømmen af B-celle immunogen design til at opnå brede neutraliserende antistoffer (bnAbs) [93]. Imidlertid er de fleste nye bnAb-epitoper (ca. 90%) ikke-kontinuerlige og konstituerede regioner samlet i 3-dimensionelle konfigurationer [120]. Selvom præsentationen af diskontinuerlige epitoper på et proteinstillads kunne forudsiges ved beregningsmodellering [121], kan disse bnAb-epitoper blive udfordret til at blive indlejret i et ikke-indkapslet HPV16 L1-proteinstillads. I modsætning hertil indeholder en minoritet af HIV-1 B-celle immunogener, såsom MPER (2F5) af HIV-1 gp41 eller V3 loop (P18IIB) af gp120, lineære neutraliserende epitoper og kan være egnede til HPV: HIV-proteinrygrad. Derfor valgte vi den lineære 2F5-neutraliserende epitop, der er inkluderet i et udvidet T20-peptid af HIV -1 MPER med hensyn til gunstig struktur for -helix-dannelse [122]. T20-peptider kunne fusioneres og stabiliseres på L1-capsid-stilladser for at fremkalde neutraliserende antistofresponser, hvis den native konfiguration af 2F5-epitopen kunne præsenteres. I denne undersøgelse fandt vi, at 2F5 nAbs var bundet til kimære HPV: HIV (L1:T20) VLP'er in vitro. Desuden kan L1:T20 VLP'erne også inducere T20-specifikke bindingsantistoffer i BALB/c-mus. Der var voksende beviser for, at HIV-1 fusionsinhiberende (T20) peptid-inducerede antistoffer har lignende egenskaber som anti-HIV-1 fusionspeptid Enfuvirtide til at binde den hydrofobe trans-membran T20 rest lokaliseret i MPER af gp41 under HIV-1-fusion og bidrager til viral kontrol [109,123,124]. Ifølge vores tidligere anmeldelser vil det rationelle design af kimære VLP-baserede vacciner til at inducere HPV og HIV-specifikke neutraliserende antistof- og CTL-responser altid skulle overvejes med hensyn til immunogenselektion, antigenleveringsvektorer og prime-boost-regimer. Som konklusion har denne undersøgelse vist en alternativ pattedyrcellebaseret ekspressionsplatform og en skalerbar kromatografisk oprensningsmetode til at konstruere kimære HPV: HIV VLP'er. Vi mener, at vores nye oprensningsmetoder vil hjælpe med at genvinde antigene HPV: HIV VLP'er fra pattedyrsceller med det mål at reducere tid, omkostninger og arbejdskraft, samtidig med at kapaciteten til industriel produktion øges. Derudover har vi demonstreret HPV16 L1 VLP'er kan fungere som en leveringsplatform til at bære HIV-1-peptidantigen, fordi indsættelsen af P18I10- eller T20-peptider i DE-løkken af HPV16 L1-capsidproteiner ikke påvirkede in vitro-stabilitet, selvsamling og morfologi af kimærisk HPV: HIV VLP'er og gjorde ikke forstyrre HPV16 L{107}}specifik antistofinduktion in vivo. På den anden side kunne kimæriske HPV: HIV VLP'er fremkalde HPV16 og HIV-specifikke B- og T-celle-immunresponser mod begge vira. Denne rapport undersøgte muligheden for at udvikle HIV-1-vacciner baseret på rekombinante BCG-udtrykkende HIV-1-immunogener og HPV: HIV-VLP'er, som kan bruges til HIV-{113}}-immunisering hos børn. Da udviklingen af en effektiv kimærisk vaccine mod HPV16 og HIV-1 stadig er en udfordring, bidrager dette arbejde et skridt i retning af udviklingen af den nye kimære HPV: HIV VLP-baserede vaccineplatform til kontrol med HPV16 og HIV{{118 }} infektion, som er et presserende behov i udviklingslande og industrialiserede lande.
Referencer
1. UNAIDS Global HIV & AIDS Statistics-2018 Faktaark. 2019. Tilgængelig online: http://www.unaids.org/en/resources/fact sheet (tilgængelig den 15. juni 2020).
2. Baeten, JM PrEP for HIV: Grad A for bevis, men afventer effekt. Nat. Rev. Urol. 2019, 16, 570-571. [CrossRef]
3. Rerks-Ngarm, S.; Pitisuttithum, P.; Nitayaphan, S.; Kaewkungwal, J.; Chiu, J.; Paris, R.; Premsri, N.; Namwat, C.; De Souza, M.; Adams, E.; et al. Vaccination med ALVAC og AIDSVAX for at forhindre HIV-1-infektion i Thailand. N. Engl. J. Med. 2009, 361, 2209-2220. [CrossRef]
4. Ng'uni, T.; Chasara, C.; Ndhlovu, ZM Større videnskabelige forhindringer i udvikling af HIV-vacciner: Historisk perspektiv og fremtidige retninger. Foran. Immunol. 2020, 11, 590780. [CrossRef]
5. Robinson, HL HIV/AIDS-vacciner: 2018. Clin. Pharmacol. Ther. 2018, 104, 1062-1073. [CrossRef]
6. Wang, Q.; Zhang, L. Bredt neutraliserende antistoffer og vaccinedesign mod HIV-1-infektion. Foran. Med. 2020, 14, 30-42. [CrossRef]
7. Collins, DR; Gaiha, GD; Walker, BD CD8+ T-celler i HIV-kontrol, helbredelse og forebyggelse. Nat. Rev. Immunol. 2020, 20, 471-482. [CrossRef] [PubMed]
8. Pollard, AJ; Bijker, EM En guide til vaccinologi: Fra grundlæggende principper til nye udviklinger. Nat. Rev. Immunol. 2021, 21, 83-100. [CrossRef]
9. Shapiro, SZ Lektioner til generel vaccinologisk forskning fra forsøg på at udvikle en HIV-vaccine. Vaccine 2019, 37, 3400-3408. [CrossRef]
10. Ahmed, HG; Bensumaidea, SH; Alshammari, FD; Alenazi, FSH; ALmutlaq, BA; Alturkstani, MZ; Aladani, IA Forekomst af human papillomavirus subtype 16 og 18 blandt yemenitiske patienter med livmoderhalskræft. Asian Pacific J. Cancer Forrige. 2017, 18, 1543-1548. [CrossRef]
11. Olcese, VA; Chen, Y.; Schlegel, R.; Yuan, H. Karakterisering af HPV16 L1-løkkedomæner i dannelsen af en typespecifik, konformationel epitop. BMC Microbiol. 2004, 4, 29. [CrossRef]
12. Dupuy, C.; Buzoni-Gate, D.; Touze, A.; Le Cann, P.; Bout, D.; Coursaget, P. Cellemedieret immunitet induceret i mus af HPV 16 L1 viruslignende partikler. Microb. Pathog. 1997, 22, 219-225. [CrossRef] [PubMed]
13. Schiller, J.; Lowy, D. Forklaringer på den høje styrke af HPV-profylaktiske vacciner. Vaccine 2018, 36, 4768-4773. [CrossRef] [PubMed]
14. Markowitz, LE; Schiller, JT Human Papillomavirus Vacciner. J. Infect. Dis. 2021, 224, S367-S378. [CrossRef] [PubMed]
15. Chen, CW; Saubi, N.; Joseph-Munné, J. Designkoncepter for viruslignende partikelbaserede HIV-1-vacciner. Foran. Immunol. 2020, 11, 573157. [CrossRef] [PubMed]
16. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph, J. Design af kimæriske viruslignende partikelbaserede vacciner til humant papillomavirus og HIV: Erfaringer. AIDS Rev. 2019, 21, 218-232. [CrossRef]
17. Liu, WJ; Liu, XS; Zhao, KN; Leggatt, GR; Frazer, IH Papillomavirus-viruslignende partikler til levering af flere cytotoksiske T-celleepitoper. Virology 2000, 273, 374-382. [CrossRef]
18. Liu, XS; Abdul-Jabbar, I.; Qi, YM; Frazer, IH; Zhou, J. Slimhindeimmunisering med papillomavirus-viruslignende partikler fremkalder systemisk og slimhindeimmunitet hos mus. Virology 1998, 252, 39-45. [CrossRef]
19. Peng, S.; Frazer, IH; Fernando, GJ; Zhou, J. Papillomavirus-viruslignende partikler kan levere definerede CTL-epitoper til MHC klasse I-vejen. Virology 1998, 240, 147-157. [CrossRef]
20. Zhai, Y.; Zhong, Z.; Zariffard, M.; Spyd, GT; Qiao, L. Bovint papillomavirus-lignende partikler, der præsenterer konserverede epitoper fra den membranproksimale eksterne region af HIV-1 gp41-inducerede slimhinde- og systemiske antistoffer. Vaccine 2013, 31, 5422-5429. [CrossRef]
21. Zhang, H.; Huang, Y.; Fayad, R.; Spyd, GT; Qiao, L. Induktion af slimhinde- og systemisk neutraliserende antistoffer mod human immundefektvirus type 1 (HIV-1) ved oral immunisering med bovint papillomavirus-HIV-1 gp41 kimærisk viruslignende partikler. J. Virol. 2004, 78, 8342-8348. [CrossRef]
22. Xiao, SL; Wen, JL; Kong, NZ; Yue, HL; Leggatt, G.; Frazer, IH Indgivelsesvej for kimærisk BPV1 VLP bestemmer karakteren af de inducerede immunresponser. Immunol. Cell Biol. 2002, 80, 21-29. [CrossRef]
23. Kirnbauer, R.; Taub, JANET; Grønsten, HEATHER; Roden, RICHARD; Dürst, M.; Gissmann, L.; Lowy, DR; Schiller, JT Effektiv selvsamling af humant papillomavirus Type 16 LI og L1-L2 til viruslignende partikler. J. Virol. 1993, 67, 6929-6936. [CrossRef] [PubMed]
24. Zhao, Q.; Potter, CS; Carragher, B.; Lander, G.; Sworen, J.; Towne, V.; Abraham, D.; Duncan, P.; Washabaugh, MW; Sitrin, RD Karakterisering af viruslignende partikler i GARDASIL® ved kryotransmissionselektronmikroskopi. Hum. Vacciner Immunother. 2014, 10, 734-739. [CrossRef] [PubMed]
25. Achour, A.; Lemhammedi, S.; Picard, O.; M'bika, JP; Zagury, JF; Moukrim, Z.; Willer, A.; Beix, F.; Burny, A.; Zagury, D. Cytotoksiske T-lymfocytter, der er specifikke for HIV-1 gp160-antigen og syntetisk P18IIIB-peptid i et HLA-A-11-immuniseret individ. AIDS Res. Hum. Retroviruses 1994, 10, 19-25. [CrossRef]
26. Nakagawa, Y.; Kikuchi, H.; Takahashi, H. Molekylær analyse af TCR og peptid/MHC-interaktion ved anvendelse af P18-I10--afledte peptider med en enkelt D-aminosyresubstitution. Biofys. J. 2007, 92, 2570-2582. [CrossRef]
27. Qiu, Z.; Chong, H.; Yao, X.; Su, Y.; Cui, S.; He, Y. Identifikation og karakterisering af en underlomme på N-trimeren af HIV-1 Gp41: Implikation for viral indgang og lægemiddelmål. Hjælpemidler 2015, 29, 1015–1024. [CrossRef]
28. Peters, BS; Cheingsong-Popov, R.; Callow, D.; Foxall, R.; Patou, G.; Hodgkin, K.; Weber, JN Et pilotfase II-studie af sikkerheden og immunogeniciteten af HIV p17/p24:VLP (p24-VLP) i asymptomatiske HIV-seropositive forsøgspersoner. J. Infect. 1997, 35, 231-235. [CrossRef]
29. Chege, GK; Burgere, WA; Stutz, H.; Meyers, AE; Chapman, R.; Kiravu, A.; Bunjun, R.; Shephard, EG; Jacobs, WR; Rybicki, EP; et al. Robust immunitet mod en Auxotrophic Mycobacterium bovis BCG-VLP Prime-Boost HIV-vaccinekandidat i en ikke-menneskelig primatmodel. J. Virol. 2013, 87, 5151-5160. [CrossRef]
30. Chege, GK; Thomas, R.; Shephard, EG; Meyers, A.; Bourn, W.; Williamson, C.; Maclean, J.; Gray, CM; Rybicki, EP; Williamson, AL Et prime-boost-immuniseringsregime ved anvendelse af rekombinante BCG- og Pr55gag-viruslignende partikelvacciner baseret på HIV type 1-subtype C fremkalder med succes Gag-specifikke responser hos bavianer. Vaccine 2009, 27, 4857-4866. [CrossRef]
31. Joseph, J.; Saubi, N.; jeg, EJ; Fernández-Lloris, R.; Gil, O.; Cardona, PJ; Gatell, JM; Hanke, T. Vaccination af nyfødte mus med BCG.HIVA222 + MVA.HIVA øger HIV-1-specifikke immunresponser: Påvirkning af alder og immuniseringsveje. Clin. Dev. Immunol. 2011, 2011, 516219. [CrossRef]
32. Saubi, N.; Gea-Mallorquí, E.; Ferrer, P.; Hurtado, C.; Sánchez-Úbeda, S.; Eto, Y.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Design af nyt mykobakterielt vaccinedesign til HIV-TB pædiatrisk vaccine vektoreret af lysinauxotrof af BCG. Mol. Ther. Metoder Clin. Dev. 2014, 1, 14017. [CrossRef]
33. Mahant, A.; Saubi, N.; Eto, Y.; Guitar, N.; Gatell, JM; Hanke, T.; Joseph, J. Præklinisk udvikling af BCG.HIVA2auxo.int, der rummer en integrativ ekspressionsvektor, til en HIV-TB pædiatrisk vaccine. Forbedring af stabilitet og specifik HIV-1 T-celle-immunitet. Hum. Vacciner Immunother. 2017, 13, 1798-1810. [CrossRef] [PubMed]
34. Hanke, T.; McMichael, AJ Design og konstruktion af en eksperimentel HIV-1-vaccine til et års-2000 klinisk forsøg i Kenya. Nat. Med. 2000, 6, 951-955. [CrossRef] [PubMed]
35. Durocher, Y.; Perret, S.; Kamen, A. Højt niveau og høj-throughput rekombinant proteinproduktion ved forbigående transfektion af suspension-voksende humane 293-EBNA1-celler. Nucleic Acids Res. 2002, 30, E9. [CrossRef] [PubMed]
36. Kim, HJ; Kim, SY; Lim, SJ; Kim, JY; Lee, SJ; Kim, HJ Et-trins kromatografisk oprensning af humant papillomavirus type 16 L1-protein fra Saccharomyces cerevisiae. Protein Expr. Purif. 2010, 70, 68-74. [CrossRef] [PubMed]
37. Eto, Y.; Saubi, N.; Ferrer, P.; Joseph-Munné, J. Ekspression af kimært HPV-HIV-protein L1P18 i pichia pastoris; oprensning og karakterisering af de viruslignende partikler. Pharmaceutics 2021, 13, 1967. [CrossRef]
38. GE. Brugen af CaptoTM Core 700 og Capto Q ImpRes til oprensning af humane papillomavirus-lignende partikler. J. Asia's Pharm. Biopharm. Ind. 2014, 1-4.
39. McLean, CS; Churcher, MJ; Meinke, J.; Smith, GL; Higgins, G.; Stanley, M.; Minson, AC Produktion og karakterisering af et monoklonalt antistof mod human papillomavirus type 16 ved brug af rekombinant vacciniavirus. J. Clin. Pathol. 1990, 43, 488-492. [CrossRef]
40. Merck Canada Inc. Produktmonografi Gardasil®. Prod. Monogr. Monopril Prod. Monogr. 2015, 1-71.
41. Achour, A.; Persson, K.; Harris, RA; Sundbäck, J.; Sentman, CL; Lindqvist, Y.; Schneides, G.; Kärre, K. Krystalstrukturen af H-2D(d) MHC klasse I kompleksdannet med det HIV-1--afledte peptid P18-110 ved en opløsning på 2,4 Å: Implikationer for T-celler og NK-celler anerkendelse. Immunitet 1998, 9, 199-208. [CrossRef]
42. Pang, W.; Tom, SC; Zheng, YT Nuværende peptid HIV type-1 fusionshæmmere. Antivir. Chem. Kemother. 2009, 20. [CrossRef]
43. Chen, XS; Garcea, RL; Goldberg, I.; Casini, G.; Harrison, SC Struktur af små viruslignende partikler samlet fra L1-proteinet fra humant papillomavirus 16. Mol. Cell 2000, 5, 557-567. [CrossRef] [PubMed]
44. Dag, PM; Weisberg, AS; Thompson, CD; Hughes, MM; Pang, YY; Lowy, DR; Schiller, JT Humant papillomavirus 16 kapsider medierer nuklear indtrængen under infektion. J. Virol. 2019, 93, e00454-19. [CrossRef]
45. Zhou, J.; Dørbar, J.; Sol, XY; Crawford, LV; McLean, CS; Frazer, IH Identifikation af det nukleare lokaliseringssignal af humant papillomavirus type 16 L1-protein. Virology 1991, 185, 625-632. [CrossRef] [PubMed]
46. Vlps, A.; Middelberg, APJ; Lua, LHL Viruslignende partikelbiobehandling: Udfordringer og muligheder. Pharm. Bioproces. 2013, 1, 407-409.
47. Bousarghin, L.; Touzé, A.; Combita-Rojas, AL; Coursaget, P. Positivt ladede sekvenser af human papillomavirus type 16 capsidproteiner er tilstrækkelige til at mediere genoverførsel til målceller via heparansulfatreceptoren. J. Gen. Virol. 2003, 84, 157-164. [CrossRef]
48. Sasagawa, T.; Pushko, P.; Steers, G.; Gschmeissner, SE; Nasser Hajibagheri, MA; Finch, J.; Crawford, L.; Tommasino, M. Syntese og samling af viruslignende partikler af humane papillomavira type 6 og type 16 i fissionsgær Schizosaccharomyces pombe. Virology 1995, 206, 126-135. [CrossRef]
49. Biemelt, S.; Sonnewald, U.; Galmbacher, P.; Willmitzer, L.; Müller, M. Produktion af humant papillomavirus type 16 viruslignende partikler i transgene planter. J. Virol. 2003, 77, 9211-9220. [CrossRef]
50. Zahin, M.; Joh, J.; Khanal, S.; Husk, A.; Mason, H.; Warzecha, H.; Ghim, SJ; Miller, DM; Matoba, N.; Jenson, AB Skalerbar produktion af HPV16 L1-protein og VLP'er fra tobaksblade. PLoS ONE 2016, 11, e0160995. [CrossRef]
51. Aires, KA; Cianciarullo, AM; Carneiro, SM; Villa, LL; Boccardo, E.; Pérez-Martinez, C.; Perez-Arellano, I.; Oliveira, MLS; Ho, PL Produktion af humant papillomavirus type 16 L1-viruslignende partikler af rekombinante Lactobacillus casei-celler. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72, 745-752. [CrossRef]
52. Shank-Retzlaff, ML; Zhao, Q.; Anderson, C.; Hamm, M.; Høj, K.; Nguyen, M.; Wang, F.; Wang, N.; Wang, B.; Wang, Y.; et al. Evaluering af den termiske stabilitet af Gardasil®. Hum. Vaccine. 2006, 2, 147-154. [CrossRef] [PubMed]
53. Mukherjee, S.; Thorsteinsson, MV; Johnston, LB; DePhillips, PA; Zlotnick, A. En kvantitativ beskrivelse af in vitro samling af humant papillomavirus 16 viruslignende partikler. J. Mol. Biol. 2008, 381, 229-237. [CrossRef] [PubMed]
54. McCarthy, MP; White, WI; Palmer-Hill, F.; Koenig, S.; Suzich, JA Kvantitativ adskillelse og gensamling af humant papillomavirus type 11 viruslignende partikler in vitro. J. Virol. 1998, 72, 32-41. [CrossRef] [PubMed]
55. Kirnbauer, R.; Booy, F.; Cheng, N.; Lowy, DR; Schiller, JT Papillomavirus L1 hovedkapsidprotein samler sig selv til viruslignende partikler, der er meget immunogene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 88, 12180-12184. [CrossRef]
56. Patel, MC; Patkar, KK; Basu, A.; Mohandas, KM; Mukhopadhyaya, R. Produktion af immunogent humant papillomavirus-16 hovedkapsidproteinafledt viruslignende partikler. indiske J. Med. Res. 2009, 130, 213-218.
57. Shi, L.; Sanyal, G.; Ni, A.; Luo, Z.; Doshna, S.; Wang, B.; Graham, TL; Wang, N.; Volkin, DB Stabilisering af humant papillomavirus viruslignende partikler med ikke-ioniske overfladeaktive stoffer. J. Pharm. Sci. 2005, 94, 1538-1551. [CrossRef]
58. Carter, JJ; Wipf, GC; Benki, SF; Christensen, ND; Galloway, DA Identifikation af en human papillomavirus type 16-specifik epitop på C-terminalarmen af hovedkapsidproteinet L1. J. Virol. 2003, 77, 11625-11632. [CrossRef]
59. Von Brunn, A.; Brand, M.; Reichhuber, C.; Morys-Wortmann, C.; Deinhardt, F.; Schdelt, F. Det primære neutraliserende domæne af HIV-I er stærkt immunogent, når det udtrykkes på overfladen af hepatitis B-kernepartikler. Vaccine 1993, 11, 817-824. [CrossRef]
60. Dennison, SM; Anasti, K.; Scearce, RM; Sutherland, L.; Parks, R.; Xia, S.-M.; Liao, H.-X.; Gorny, MK; Zolla-Pazner, S.; Haynes, BF; et al. Ikke-neutraliserende HIV-1 gp41 Envelope Cluster II humane monoklonale antistoffer viser polyreaktivitet for binding til fosfolipider og proteinautoantigener. J. Virol. 2011, 85, 1340-1347. [CrossRef]
61. Trkola, A.; Kuster, H.; Russert, P.; Joos, B.; Fischer, M.; Leemann, C.; Manrique, A.; Huber, M.; Rehr, M.; Oxenius, A.; et al. Forsinkelse af HIV-1-rebound efter ophør af antiretroviral behandling gennem passiv overførsel af humane neutraliserende antistoffer. Nat. Med. 2005, 11, 615-622. [CrossRef]
62. Shank-Retzlaff, M.; Wang, F.; Morley, T.; Anderson, C.; Hamm, M.; Brown, M.; Rowland, K.; Pancari, G.; Zorman, J.; Nederste.; et al. Korrelation mellem musestyrke og in vitro relativ styrke for human papillomavirus Type 16 viruslignende partikler og Gardasil-vaccineprøver. Hum. Vaccine. 2005, 1, 191-197. [CrossRef] [PubMed]
63. Kilpeläinen, A.; Maya-Hoyos, M.; Saubí, N.; Soto, CY; Joseph Munne, J. Fremskridt og udfordringer i rekombinant Mycobacterium bovis BCG-baseret HIV-vaccineudvikling: Erfaringer. Ekspert Rev. Vaccines 2018, 17, 1005-1020. [CrossRef] [PubMed]
