Kemiske egenskaber af en mannoglucan fra Cistanche Deserticola
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
1. Materialer
Der blev brugt oral pasta til heste fra to forskellige producenter indeholdende henholdsvis 10 mg/g (A) eller 20 mg/g (B) ivermectin. Det kvantitative assay for ivermectin blev udført, og indholdet var 104,4-107,7 procent af den deklarerede koncentration.
2. Opløsningstest
Testen blev udført med en Ph. Eur. padleapparat (Pharma Test, Heinberg, Tyskland), ved omrøringer på 75 rpm eller 50 rpm, ved 37 -0,5 C. Natriumlaurylsulfat (BDH Chemicals, Poole, England) 0,5 procent (w /v) vandig opløsning blev anvendt som et opløsningsmedium (900 ml). Pastaen (4 g A eller 2 g B) blev anbragt i beholderen med en sprøjte med en kanyle (A) eller ved at droppe prøven på overfladen af opløsningsmediet (B). Efter tidsintervallerne (15, 30, 45, 60 min og 2 timer) blev en prøve af opløsningsmediet udtaget (2 ml), filtreret gennem et glasfilter og analyseret.
3. HPLC-analyse
Bestemmelsen af ivermectin blev udført med en modificeret HPLC-metode som beskrevet i Ph. Eur. De analyserede opløsninger blev fortyndet med methanol (1:10). HPLC-systemet bestod af en octadecyl-søjle (250 -4 mm; 5 mm; Lichrospher RP-18; Merck), en integrator D-12500 A, en detektor UV-Vis L{{7} }, pumpe L-6200A (Merck-Hitachi, Darmstadt, Tyskland). En blanding af acetonitril:methanol:vand (64:24:16) blev anvendt som den mobile fase med en strømningshastighed på 1,9 ml/min. Volumenet af den injicerede prøve var 20 ml, og detektion blev udført ved 254 nm.
4. Opløselighedsundersøgelser
En adgang af stoffet blev rystet i tæt lukkede glaskolber med et passende opløsningsmiddel (tabel 1) i 20 timer ved 37 0.1 C. Suspensionerne blev filtreret, og filtratet, efter fortynding i methanol, blev analyseret ved HPLC .
5. Stabilitet i sur opløsning
Opløsninger af ivermectin i HCl {{0}}.1 M blev opbevaret i tæt lukkede hætteglas af glas ved 20 C og 37 C. Kromatogrammer af opløsningerne blev registreret ved t ¼ 0 og efter 1, 2 og 6 timer. Arealet af ivermectin (retentionstid 10,5 min) og yderligere toppe blev beregnet.
Referencer
FDA-vejledning til industrien: SUPAC-SS ikke-sterile halvfaste doseringsformer. Ændringer i opskalering og eftergodkendelse: kemi, fremstilling og kontrol; in vitro frigivelsestest og in vivo bioækvivalensdokumentation. Maj 1997. FIP retningslinjer for opløsningstest af faste orale produkter (1997) Dissolute. Teknol. 4:5-14. Siewert M, Dressman J, Brown C, Shah VP (2003) FIP/AAPS retningslinjer for opløsning/in vitro frigivelsestest af nye/særlige doseringsformer, AAPS PharmSciTech, 4 (1) artikel 7 Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, Beijing, Kina
Xiang mei Wu, Pengfei Tu Modtaget 13. februar 2004, accepteret 4. april 2004, Prof. Dr. Pengfei Tu, Modern Research Center for Traditional Chinese Medicine, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center, nr. 38, Xueyuan Road , Haidian District, Beijing 100083, Kina Pengfeitu@bjmu.edu.cn Pharmazie 59: 815–816 (2004)
En ny mannoglucan fraCistanche deserticolafra Kina er karakteriseret. Forbindelsen er ansvarlig for en mild stimulering af mitogen-induceret T- og B-lymfocytproliferation.
Cistanche deserticolaYC Ma er en holoparasit, der vokser på rødderne af den tokimbladede plante Haloxylon ammodendron Bunge, som er vidt udbredt i det nordvestlige Kina. Da det er et vigtigt tonic i orientalsk medicin, er der hævdet at mange aktive komponenter og farmakologiske aktiviteter (Karasawa et al. 1986; Yoshizawa et al. 1990). Disse egenskaber kan være forbundet med nogle af polysaccharidkomponenterne iCistanchesom endnu ikke er undersøgt. Mitogene pectinpolysaccharider og neutrale polysaccharider er blevet isoleret og karakteriseret fraCistanche deserticolafra Mongoliet (Radna et al. 1996; Anna et al. 1997; Bozena et al. 1999). Her rapporterer vi de kemiske egenskaber af en ny mannoglucan fraCistanche deserticolafra Kina, som er ansvarlig for mild stimulering af mitogen-induceret T- og B-lymfocytproliferation. Efter stænglerne afCistanche deserticolaYC Ma blev ekstraheret med 95 procent ethanol, koldt destilleret vand blev brugt til at ekstrahere remanensen. Koldtvandsekstrakten blev præcipiteret med EtOH, proteinet blev fjernet og dialyseret, hvilket gav det rå polysaccharid CCDP. Det rå polysaccharid blev fraktioneret på en DEAE-søjle og en Sephadex G-150-søjle for at give et proteinfrit polysaccharid (CDP-6), som omfattede glucose (89,2 procent) og mannose (1{{58} },4 procent ), og hvoraf den gennemsnitlige Mr blev anslået til at være 6.8 -104. Polysaccharidet CDP-6 viste [a 20 D 42 (c 1, H2O). De absolutte konfigurationer af sukkerarterne blev bestemt ved GC af TMS (– )-2-butylglycosider. CDP-6 blev methyleret (Needs et al. 1993), hydrolyseret, omdannet til alditolacetaterne og analyseret ved GC og GC-MS (tabel). Dette resultat sammen med molforholdsdata fra methyleringsanalyse antydede, at CDP-6 har en overvejende 1,6-linket Glcp og en backbone 1,6- forbundet i mindre grad forgrenet ved O{{ 24}} af mannose. Methyleringsanalysen af to polymerer (CDP-6-1, CDP-6–2) fra partiel hydrolyse bekræftede, at CDP-6 har en rygrad bestående af 1,6-forbundne glucosylrester og 1,6-koblede mannosylrester, som er substitueret ved O-3 af mannose af grene bestående af den terminale, 1,6--forbundne glucosylrester og 1,3,{{38} }forbundne mannosylrester. Ifølge molære forhold og litteraturen (Bozena et al. 1999; Bacon et al. 1996) viste 13C NMR-spektret af CDP-6 signaler på grund af anomere carbonatomer i a-d-Glcp (C{{45) }} ved 98,4 ppm), bd-Map (C-1 ved 104,3-104,9 ppm) og ad-Map (C-1 ved 100,0 ppm). 1H NMR-spektret af CDP-6-2 i D2O viste protonsignaler svarende til ad-Glcp (H-1 ved 4,94-4,95 ppm) og a-d-Map (H-1 ved 4,96-5,00 ppm). 13C NMR-spektret for CDP-6-2 i D2O viste protonsignaler svarende til aD-Glcp (C-1 ved 98,6 ppm) og ad-Map (C-1 ved 98,4 ppm). Mannoglucaner rapporteres at have en 1,4-linket glucopyrannan og 1,4-linket mannopyrannan-rygrad (Radjabi Nassab et al. 1984; Tanabe et al. 2000). CDP-6 har nogle forskellige strukturelle træk ved dets en-1,6-linkede Glcp og b-1,6-linkede kort-rygrad, og den erstattes af mannoglucangrene (Fig.). For at undersøge brugen afCistanche deserticolai folkemedicin blev effekten af CDP-6 på T- og B-cellesystemerne evalueret. Det viste sig mildt at stimulere mitogen-induceret T- og B-lymfocytproliferation.
Eksperimentel
1. Generelle procedurer
Optisk rotation blev målt med et W22-1S automatisk polarimeter. IR-spektre blev bestemt på et Perkin-Elmer 599B spektrometer. GC-analyse blev udført på et Agilent HP6890N-instrument udstyret med en FID-detektor. GC-MS blev udført på et Finnigan Trace GC-MS instrument. Homogenitet og Mr of CDP-6 blev estimeret ud fra kalibreringskurven for elueringsvolumenet af standard dextraner, som blev udført på
et Agilent 1100-serieapparat med en Shodex KS-805-søjle.1H NMR- og 13C NMR-spektre blev optaget med et INOVA-500-instrument. Proteinindholdet blev analyseret ved metoden ifølge Bradford (Andre et al. 1975). Monosaccharider blev analyseret med hensyn til deres alditolacetat efter at de var blevet hydrolyseret (2 M TFA, 2 timer, 110 C), reduceret og acetateret. Hydrolysaterne blev analyseret ved hjælp af TLC på en silicagelplade indeholdende 5 procent natriumdihydrogenphosphat i BuOH-EtOAc-isopropylalkohol-HOAC--H2Opyridin (3,5: 10: 6: 3,5 : 3 : 3), og sukker blev påvist ved sprøjtning med orcinol -H2SO4. De resulterende alditolacetater blev analyseret ved GLC under anvendelse af en HP-5 kapillarsøjle (30 m 0,32 mm). CDP-6 blev methyleret ved Ciucanu-metoden efterfulgt af hydrolyse og blev analyseret som delvist methylerede alditolacetater ved GC-MS. Efter delvis hydrolyse blev produkterne dialyseret og adskilt, hvilket gav to polymerer, CDP-6-1 og CDP-6-2.
2. Plantemateriale
Planten blev indsamlet fra provinsen Indre Mongoliet i Kina i august 2001 og blev identificeret af Hu-Biao Chen, Institut for Naturmedicin, School of Pharmaceutical Sciences, Peking University Health Science Center. Et voucher-eksemplar [E-1-(9)] af denne plante blev deponeret på School of Pharmaceutical Sciences, Peking University. 3. Ekstraktion, isolering og oprensning af polysaccharid CDP-6 Stammen afCistanche deserticolaYC Ma (1500 g) blev ekstraheret med 95 procent ethanol (6 L) under tilbagesvaling. Den tørrede ethanol-uopløselige remanens blev macereret tre gange med koldt destilleret vand pr. 12 timer. Den kolde vandekstrakt blev filtreret, og filtratet blev centrifugeret. Efter præcipitation med fire volumener EtOH (omrøring og henstand i 24 timer ved 4 C) blev bundfaldsproduktet (35,5 g) opnået. Proteinet i præcipitatet blev fjernet ved Savages metode. Efter opløsning i destilleret vand blev remanensen (25,5 g) dialyseret og lyofiliseret (udbytte: 10,6 g). Det rå polysaccharid (8 g) blev opløst i destilleret vand (100 ml, 8 procent vægt/volumen) og adskilt under anvendelse af en DEAE-søjle (70 5 cm, gradienten på 0-2 M NaCl, pr. 1,5 L). En vand-elueret fraktion (600 mg) blev opnået. En prøve (250 mg) blev oprenset ved søjle-gelpermeationskromatografi på en Sephadex G- 150-søjle (4 - 80 cm, 1600 ml, 5 ml pr. fraktion). Fraktioner af CDP-6 (1500-1600 ml) blev samlet, dialyseret og frysetørret. Efter at være blevet afsaltet af Sephadex G-25 (60 1 cm). CDP-6 (110 mg) blev opnået og bestemt som en enkelt top ved HPSGC.
Anerkendelse:Forfatteren takker Dr. Baomei Shao og Prof. Xiaoming Gao, School of Basic Medical Sciences, Peking University Health Science Center, for at måle den immunmodulerende aktivitet af CDP-6.
