Kapitel 2: Krϋppel-lignende faktor 15 undertrykker nyre glomerulær mesangial celleproliferation via forbedring af P53 SUMO1-konjugation

For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

3 RESULTATER

3.1|Screening af KLF15-bindingsgener gennem ChIP-Seq i primære renale glomerulære MC'er

For at identificere de direkte bindingspartnergener af KLF15 udførte vi ChlP-Seq-analyse og screenede til sidst 2478 gener. GO-analyse af disse gener gennem værktøjet på webstedet www.uniprot.org (Figur 1A, B) afslørede molekylære funktionsudtryk forbundet med 1941-gener, cellulære komponentudtryk relateret til 1662-gener og biologiske procesudtryk relateret til 1766-gener. Da vores mål var at finde ud af, hvordan KLF15 påvirker MC'er, fokuserede vi på celleproces-relaterede gener. Blandt de 1315 celleprocesrelaterede gener blev 74 gener fundet at deltage i cellecyklusprocesser; specifikt deltog disse gener i den mitotiske cellecyklus, cellecyklusfaseovergangen og andre processer (figur 1C, D). Desuden analyserede vi generne involveret i vækst og fandt ud af, at de var relateret til udviklingsvækst, cellevækst og andre typer vækst (figur 1E).

3.2|Screening af differentielt regulerede gener i KLF15-overudtrykkende renale glomerulære MC'er ved hjælp af SILAC og LC/MS

SILAC og LC/MS-analyse af HRMC'er, der overudtrykker KLF15 sammenlignet med forældreceller, førte til identifikation af 1357 proteiner. Vi brugte DAVID og IPA til at erhverve GO-domænerne og berigede veje for de kvantificerede proteiner identificeret af SILAC. Interessant nok var mange proteiners biologiske funktionsrelaterede termer blandt de top 30 væsentligt berigede GO-termer, herunder reguleringen af ​​den cellulære aminosyremetaboliske proces, proteasomkomplekset, proteinbinding og transkriptions- og translationsudtryk, som alle er tæt beslægtede med ubiquitinering (figur 2A). Figur 2B viser de øverste 30 signifikant berigede pathway-termer. Adskillige biologiske procesudtryk, herunder proteasom- og neurodegenerative sygdomsudtryk, var også relateret til ubiquitinering.

Klik for at vide omcistanchetil salg med detaljer

3.3|Bioinformatisk analyse af KLF15-bindingsgener, der potentielt er forbundet med renal glomerulær MC-proliferation

At udforske de KLF15-bindingsgener, der potentielt er forbundet medrenal glomerulærMC-spredning udførte vi en bioinformatisk analyse af ChIP-Seq-dataene og SILAC-LC/MS-dataene. 52 gener blev screenet (tabel 2 og figur 2C), og fem af disse gener, inklusive SUMO1, makrofag-migrationshæmmende faktor (MIF), eukaryot initieringsfaktor (EIF), insulinlignende vækstfaktor (IGF) og reticulocalbin (RCN) ), var nært beslægtet medcelleproliferation. Da GO- og pathway-analyserne af de differentielt udtrykte proteiner antydede, at de screenede gener hovedsageligt var relateret til ubiquitineringsprocessen, konkluderede vi, at SUMO1, et medlem af den ubiquitin-lignende (UBL) proteinfamilie, deltager i post-translationel modifikation svarende til ubiquitinering som målgenet for KLF15.

Stigende mængder af beviser har indikeret, at HG er en af ​​de vigtigste faktorer, der inducerer udviklingen af ​​diabetisk nefropati, og det fremmer MC-proliferation og øget matrixsyntese in vitro.25En tidligere undersøgelse har vist, at PDGF-BB er afgørende for MC-proliferation forud for udviklingen. af glomerulosklerose i eksperimentel glomerulonefritis.26 Efter at have bekræftet, at MC'er blev stimuleret af HG eller PDGF-BB in vitro, opdagede vi ændringer i ekspressionen af ​​KLF15 og SUMO1 ved både RNA og protein

niveauer og fandt, at disse molekyler havde lignende tendenser (figur 2D-l). Endelig bestemte vi SUMO1 til at være målgenet for KLF15.

3.4|KLF15 opregulerer SUMO-1-genekspression ved at binde til en 16 bp CACCCA-SUMO-1-promotorregion og et C plus A-rigt motiv

Vi brugte MEME-pakken(http://meme-suite.org/tools/meme) til at karakterisere KLF15-bindingsmotiverne af de 52 screenede gener fra KLF15 ChlP-Seq-dataene og identificerede KLF-bindingsmotivet (Figur 3A). Derudover analyserede vi yderligere mere end tusind baser opstrøms for SUMO1-promotoren og fandt ud af, at KLF15 kunne genkende og binde til en 16 bp-sekvens (nukleotider -205~-199) inklusive - CACCCA-(Figur 3B).ChIP-PCR bekræftede, at KLF15 er bundet til SUMO1-promotoren, og resultaterne viste signifikant højere ekspression af SUMO1 i anti-KLF15-antistofgruppen end i baggrundskontrolgruppen (Figur 3C).

Desuden udførte vi en dual-luciferase reporter-assay for at bekræfte målretningsforholdet mellem SUMO1 og KLF15. Vildtype SUMO1-promotorgruppen viste højere luciferaseaktivitet end pGL3-vektoren og mutantgrupperne i HRMC'er, og aktiviteten blev signifikant øget ved overekspression af KLF15. Forbedringerne i luciferaseaktivitet blev reverseret ved transfektion med et plasmid, der udtrykker den mutante promotorregion (figur 3D). Tilsammen tyder disse data på, at SUMO1 er et direkte transkriptionelt mål for KLF15.

3.5 |Screening af P53 som SUMOyleringssubstratet af SUMO1

SUMO-modifikationer er bredt udtrykte post-translationelle modifikationer i eukaryoter. Reversibel konjugering af disse modifikationer til substratproteiner er også kendt som SUMOylation, som spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​målproteinernes funktioner og deltager yderligere i forskellige biologiske processer, såsom nukleocytoplasmatisk transport, transkriptionel regulering, apoptose, proteinstabilisering, stressrespons og cellecyklusprogression.27 For at udforske de nedstrøms signalmolekyler direkte konjugeret af SUMO1, udførte vi en netværksanalyse af SUMO1 ved hjælp af IPA-databasen, og dataene viste, at SUMO1 direkte kunne konjugere til P53, APP, JUN og AKT, bl.a. proteiner (figur 4A-C). Vi valgte oprindeligt P53 som et nedstrøms molekyle af SUMO1, fordi det er et velkendt protein, der er nært beslægtet med celleproliferation.28.29 Desuden brugte vi SUMOsp-software til at forudsige de mulige SUMOyleringssekvenser af P53invariousspecies og fandt ud af, at P53 havde SUMOyleringssekvensen（ Figur 4D). For at bestemme, om P53 faktisk er modificeret af SUMOylering, transficerede vi forbigående HRMC'er med et SUMO1-overekspressionsplasmid eller SUMO1-siRNA. Både IP- og Western blot-resultaterne afslørede tendenser i ekspressionsændringer af SUMO1-P53 og P53, som var i overensstemmelse med ændringerne i SUMO1 (figur 4E-J). Disse data indikerer, at P53 er et SUMOyleringssubstrat af SUMO1.

3.6 |KLF15 hæmmer MC-proliferation ved at fremme SUMO1-ekspression og P53 SUMOylering

For at etablere reguleringen af ​​P53 SUMOylation og MC-proliferation af KLF15 og SUMO1 intervenerede vi med KLF15- eller SUMO1-ekspression i HRMC'er og behandlede HRMC'er med PDGF-BB. Blandt PDGF-BB-behandlede HRMC'er udviste celler transficeret med KLF15-overekspressionsplasmidet højere ekspression af SUMO1-P53, P53, KLF15 og SUMO1 end celler transficeret med KLF15-kontrolplasmidet. De samme ændringer i SUMO1-P53, P53 og SUMO1 blev fundet i de SUMO1-overekspressionsplasmid-transficerede celler, mens KLF15-ekspression var uændret i disse celler (figur 5A-F). PDGF-BB er en af ​​de mest effektive vækstfaktorer for MC'er beskrevet hidtil, og proliferativ respons af HRMC'er på PDGF-BB blev observeret. Som vist i figur 5G, H, blev procentdelen af ​​EdU-positive celler signifikant forøget ved administration af rekombinant PDGF-BB. EdU-farvningsresultaterne indikerede, at både KLF15 og SUMO1 overekspression hæmmede PDGF-BB-induceret celleproliferation (figur 5G, H).

For at få yderligere indsigt i rollerne af KLF15 og SUMO1 i prolifererende HRMC'er, transficerede vi celler med kun SUMO1 siRNA eller cotransficerede dem med SUMO1 siRNA og et KLF15 overekspressionsplasmid. Nedregulering af SUMO1 påvirkede ikke ekspressionen af ​​KLF15, men ekspressionsniveauerne af SUMO1-P53 og P53 var tydeligvis faldet efter SUMO1 siRNA-transfektion (Figur 6A-C). Når ekspressionen af ​​SUMO1 blev hæmmet, blev SUMO1-P53- og P53-ekspressionsniveauer desuden også undertrykt, selv i celler, der overudtrykte KLF15 (figur 6D-F). Derefter blev MC-proliferation evalueret under anvendelse af et EdU-farvningsassay. SUMO1 RNAi øgede den proliferative effekt af PDGF-BBon HRMC'er, og gruppen cotransficeret med KLF15 overekspressionsplasmidet og SUMO1 siRNA havde flere EdU-positive celler end gruppen cotransficeret med overekspressionsplasmidet og hybridsekvenskontrol siRNA (Figur 6G, H) . Vi konkluderer derfor, at KLF15 undertrykker MC-proliferation ved at forbedre P53 SUMOylation.

3.7|Global SUMO1- og P53-ekspression i glomerulære MC'er er negativt korreleret med MC-proliferation i rotte Thy-1 nefritis

Anti-Thy1 nefritis er en klassisk model af selvbegrænset mesangial proliferativ glomerulonefritis med en proliferativ fase og en genopretningsfase. Vi injicerede et Thy1-antistof i Wistar-rotter for at skabe denne model. Både serumurinstofnitrogen og kreatinin har ingen signifikant ændring mellem kontrolrotterne og modelrotterne (figur S1). Markeret mesangial proliferation og ECM-akkumulering blev observeret under den proliferative fase (dage 5 og 7) hos modelrotterne, og antallet af MC'er faldt under genopretningsfasen på dag 10 (figur 7A). Vi påviste også ekspressionsændringerne i celleproliferationsmarkøren PCNA ved IHC (figur 7A, B). PCNA-niveauer blev øget på dag 5, toppede på dag 7 og faldt på dag 10 (figur 7F). Western blot-analyse viste, at proteinekspressionen af ​​P53, SUMO1 og KLF15 i isolerede glomeruli var lavere i modelgrupperne end i kontrolgruppen (figur 7C, D), i overensstemmelse med de immunhistokemiske resultater (figur 7E, F). Disse resultater indikerer, at den unormale spredning af MC'er i anti-Thy1-modelrotter er relateret til lavniveau-ekspressionen af ​​KLF15 og SUMO1. Interferering med ekspressionen af ​​disse molekyler forventes at lindre den patologiske fænotype hos rotter.

4 DISKUSSION

Detglomerulier filtreringsenhederne fornyre. Afbrydelse af glomerulær funktion kan være forårsaget af primær glomerulær patologi eller kan være sekundær til systemiske sygdomme. Mesangiale ændringer blev set efter glomerulær skade, herunder hyperproliferation af MC'er efterfulgt af overdreven produktion af ECM (mesangial ekspansion) og produktion af kemoattraktant til inflammatoriske celler. Derfor er modulering af MC-responser, især unormal proliferation, en ny terapeutisk tilgang. KLF15 er et protein, der spiller en regulerende rolle som transkriptionsfaktor ved at binde sig til specifikke DNA-sekvenser. Mange undersøgelser har rapporteret, at KLF15 er involveret i reguleringen af ​​celleproliferation. For eksempel har det vist sig, at KLF15 deltager i hæmningen af ​​MC-proliferationsrelaterede signalveje,15,30, men dets direkte målgen er ikke blevet rapporteret i litteraturen. Derfor involverede denne undersøgelse hovedsagelig fælles screening af transkriptions- og translationsniveauer for at identificere det direkte målgen af ​​KLF15.

KLF15 regulerer forskellige gener i forskellige arter og i forskellige væv og organer. I processen med at regulere proliferationen af ​​MC'er påvirker KLF15 ekspressionen af ​​flere gener og deltager i flere pathways.131,32 For at udforske de direkte målgener af KLF15 brugte vi ChIP-Seg.Klein RH og hans kolleger brugte ChlP-seq. teknologi til at studere reguleringen af ​​KLF7 på differentieringen af ​​corneale epitelceller.33 Ying M et al brugte denne teknik til at studere den hæmmende effekt af KLF9 på glioblastoms pluripotens.34Sammenlignet med ChlP-chip muliggør ChIP-Seq ægte hel-genomanalyse med højere opløsning, højere detektionsfølsomhed og lavere prøvestørrelseskrav.35 Vi brugte ChP til at opnå DNA-fragmenterne direkte bundet af KLF15, og efter sammenligning og analyse med GenBank screenede vi 2478 mulige målgener. Gennem GO- og pathway-analyser identificerede vi mange målgener involveret i cellecyklus- og proliferationsprocesserne.

ChlP-Seq eksperimenter kræver PCR til amplifikation af detektionssignalet, og en vis grad af bias under amplifikationsprocessen er uundgåelig. Derudover opnår ChIP-Seq kun de gener, som KLF15 kan binde, og indikerer ikke de ændringer, der sker i ekspressionen af ​​disse gener, når ekspressionen af ​​KLF15 ændres. Vi brugte SILAC-LC/MS proteomics-analyse til at kompensere for disse mangler. Denne teknik giver information om alle de proteiner, hvis ekspression ændres ved regulering af KLF15, inklusive de proteiner, der er direkte reguleret af KLF15, og de proteiner, der er indirekte reguleret eller post-translationelt modificeret. HRMC'er blev dyrket under anvendelse af SILAC, og KLF15 blev overudtrykt i cellerne gennem plasmidtransfektion. Proteinerne blev opsamlet til LC/MS-detektion, og 1357 differentielt udtrykte proteiner blev opnået. GO- og pathway-analyser afslørede, at nogle af de differentielt udtrykte proteiner var involveret i ubiquitinering. Gen- og proteindata blev krydset. De gener, der ikke var relateret til forskningsformålet, og gener, der ikke var direkte reguleret af KLF15, blev fjernet; i sidste ende blev 52 gener screenet. Blandt disse blev de fem gener med de mest tydelige ekspressionsforskelle, som var tættest beslægtet med spredning, udvalgt. I betragtning af de kombinerede resultater af pathway-analyse, SUMO1 og KLF15 ekspressionsanalyse i prolifererende HRMC'er, ChlP-PCR og dual-luciferase reporter assays, blev proteinet SUMO1 udvalgt som målgenet for KLF15.

Ud over ubiquitin identificeres et stigende antal UBL-proteiner, 3637 inklusive SUMO,38 neurale precursorcelle-udtrykte, udviklingsmæssigt nedregulerede 8(NEDD8)3940 og interferon-stimulerede gen 15(ISG15),41. Disse modificerende proteiner regulerer kraftigt en række biologiske processer. Den kovalente tilføjelse af SUMO til substrater, kaldet SUMOylation, er en post-translationel modifikation involveret i en række cellulære processer, herunder nuklear-cytosolisk transport, transkriptionel regulering, apoptose, proteinstabilitetskontrol, stressresponser og cellecyklusprogression.27SUMO er typisk bundet til acceptorlysinrester af proteinsubstrater, der rummer en konsensussekvens og bidrager til reguleringen af ​​protein-protein-interaktioner såvel som til subcellulær kompartmentalisering og proteinstabilitet.2 sUMO1, som et medlem af SUMOS-familien, kan påvirke celleproliferation ved at modificere substrat og stabilisering af cellecyklusregulerende proteiner.43 Derfor fokuserede vi, kombineret med litteraturrapporten og de omfattende screenings- og analyseresultater, på, hvordan KLF15 regulerer effekten af ​​SUMO1 på mesangial celleproliferation.

For at identificere substraterne for SUMO1 udførte vi en netværksanalyse af SUMO1 ved hjælp af IPA-databasen og SUMOsp-softwaren. Kombineret med publiceret forskning om P53 foreslog vores indledende screeningsdata P53 som et nedstrøms molekyle af SUMO1 med SUMOyleringssekvensen YKxD/E. Tidligere undersøgelser har vist, at P53 var et substrat for SUMOylation,45 og forbedret P53 SUMO1-konjugation fremmede stabiliteten og aktiviteten af ​​P53 og inducerede se-nescens.46 I vores undersøgelse frembragte interferens med ekspressionen af ​​SUMO1 i HRMC'er de samme ændringstendenser i SUMO1-P53 og P53, hvilket indikerer, at P53 var et SUMOyleringssubstrat for SUMO1.

Nye beviser har indikeret, at SUMOylering og de-SUMOylering spiller roller i adskillige nefropatiske sygdomme, såsom nyredysgenese, renal carcinom, glomerulær sygdom, podocytapoptose og nyremarvhypertonicitet, akut nyreskade og nefrolithiasis.{klarere1}}. forhold mellem KLF15, SUMO1, P53 SUMOylation og MC-proliferation udførte vi en række transfektionsbehandlinger på celler, der havde gennemgået PDGF-BB-induceret proliferation. Overekspression af KLF15 opregulerede ekspressionen af ​​SUMO1, mens overekspression af SUMO1 ikke påvirkede ekspressionen af ​​KLF15. Enten KLF15- eller SUMO1-overekspression øgede SUMOyleringen af ​​P53 og antagoniserede celleproliferationen induceret af PDGF-BB. Når ekspressionen af ​​SUMO1 blev hæmmet, blev SUMOyleringen af ​​P53 også hæmmet, og KLF15 mistede sin antagonistiske effekt på celleproliferation. In vivo. proliferationen af ​​MC'er steg gradvist med forværring af mesangial proliferativ nefritis, mens ekspressionen af ​​KLF15, SUMO1 og P53 faldt signifikant. I betragtning af de integrerede observationer i celler og væv konkluderer vi foreløbigt, at KLF15 regulerer SUMOyleringen af ​​P53 gennem SUMO1 og derved hæmmer MC-proliferation.

5. KONKLUSIONER

Nogle undersøgelser har vist, at KLF15 spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​spredningen af ​​MC'er. I dette arbejde undersøgte vi mekanismerne for MC-proliferationsundertrykkelse medieret af denne transkriptionsfaktor. Vi identificerede SUMO1 som det primære mål for KLF15 i MC'er via bioinformatikanalyser, der involverer ChIP-Seq og SILAC-LC/MS. Ved hjælp af IPA-databasen og SUMOsp-softwaren bestemte vi desuden, at P53 var et direkte substrat for SUMO1. In vitro og in vivo eksperimenter bekræftede, at KLF15 kunne fremme ekspressionen af ​​SUMO1 og SUMOyleringen af ​​P53 og derefter hæmme spredningen af ​​MC'er (figur S2). Disse resultater bidrager til forståelsen af ​​KLF15's regulerende rolle i MC-proliferation og giver et teoretisk grundlag for at finde nye behandlinger for MC-proliferation-relaterede nyresygdomme.