Kapitel 2: Forbindelser rettet mod OSBPL7 øger ABCA1- afhængig kolesterol efflux, der bevarer nyrefunktionen i to modeller af nyresygdom

For mere info. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Diskussion

Denne undersøgelse beskriver identifikation af en klasse af forbindelser ved fænotypisk lægemiddelopdagelse (PDD), der opregulerer ABCA1-afhængig kolesteroludstrømning. Måldekonvolution afslørede, at OSBPL7 var det molekylære mål. I dyremodeller for nyresygdom reducerede disse forbindelser nyrelipidakkumulering, forhindrede podocyttab, normaliseret proteinuri og nedsat nyrefunktionsnedgang.

Nuværende terapier for kroniskenyre sygdomer begrænset til ACEi, ARB'er og for nylig natrium-glucose cotransporter-type 2-hæmmere (SLGT2i). På trods af effektiviteten af ​​disse midler til at forsinke progressionen af ​​kronisk nyresygdom, primært hos patienter med proteinurisk nyresygdom, er det udækkede medicinske behov ved CKD fortsat enormt 3.3940. I et randomiseret forsøg med 4300 patienter blev SGLT2i uventet fundet at være effektivt uanset af tilstedeværelsen af ​​diabetes4, hvilket tyder på, at andre renobeskyttelsesmekanismer end glukosesænkende er involveret. Faktisk viste en nylig undersøgelse, at SGLT2i kan øge plasma HDL og kan reducere hjertefedtakkumulering42. Denne nylige fremkomst af SGLT2i understreger fordelen ved at målrette flere CKD-drivmekanismer for at udvikle mere effektive terapier.

Vi og andre har beskrevet glomerulær kolesterolophobning inyresygdommestammer fra både metabolisk og ikke-metabolisk oprindelse. Glomerulær lipidakkumulering, i forbindelse med nedsat ABCAl-medieret kolesteroludstrømning, forekommer i DKD7-11, FSGS12-14 og AS13. Disse data tyder på, at genoprettelse af ABCAl-funktionen kan være effektiv til behandling af disse typer nyresygdom. Vi har for nylig demonstreret, at renal kolesteroludtømning med cyclodextrin, eller genetisk ABCAl-overekspression, beskytter modnyre dysfunktioni modeller af DKD9, FSGS13,14 og ASl3. Vi påviste også, at podocytspecifik ABCAl-mangel forværrer den renale fænotype i DKD7. Undersøgelser med LXR-agonister, såsom T1317, har også givet stærk støtte til en nøglerolle af ABC Al, som er forblevet et attraktivt terapeutisk mål på trods af begrænsningen af ​​disse midler.

Vi søgte efter midler ved fænotypisk lægemiddelopdagelse og optimering af kandidat apotek med små molekyler. Vi identificerede en række 5-arylnicotinamider, hvoraf adskillige repræsentanter øgede ABCAl-proteinniveauer og kolesteroludstrømning fra kolesterolfyldte celler. Fraværet af effluxaktivitet i fibroblaster fra en patient med Tangiers sygdom og fraværet af en stigning i ABCAl mRNA afslørede en ny virkningsmekanisme.

Målafviklingsindsatsen identificerede OSBPL7 som et højinteressemål. Den molekylære probe (³H-Cpd K) bandt effektivt OSBPL7 i levende celler og kunne effektivt konkurrere med umærkede forbindelser. Endnu vigtigere viste vi et korrelativt "aktivitet-aktivitet"-forhold for et større sæt af forbindelser mellem deres evne til at øge ABCAl-kolesteroludstrømning og deres evne til at konkurrere om binding af proben til OSBPL7. Mutationsanalyse, kombineret med molekylær modellering og docking-undersøgelser, indikerer direkte interaktion mellem forbindelserne med den forudsagte OSBPL7-sterolbindingslomme. Endelig bekræftede siRNA-undersøgelser involveringen af ​​OSBPL7 i ABC Al-funktion.

Klik for at vide, hvor cistanche kan købes, og hvad cistanche bruges til  

Vi identificerede også CBIR som et potentielt mål. Flere rapporter foreslår en rolle for endocannabinoid-signalering i cellulær kolesterolregulering. Rimonabant blev vist i beskedent at opregulere scavenger-receptor B1 (SR-B1) og ABCGl, men ikke ABC Al, i overensstemmelse med vores data45. Den syntetiske cannabinoid WIN55,212-2 blev vist at reducere ekspressionen af ​​ABC Al, mens den øgede scavenger-receptor CD36 i oxLDL-ladede RAW264.7-makrofager46. Tilsammen understøtter disse data ikke en stærk rolle for CBIR i reguleringen af ​​ABCA1. I vores undersøgelser var rimonabant og andre CBIR-agonister/antagonister, inklusive AM251, WIN55-212-2 og arachidoncholoroethylamin (ACEA), inaktive til at inducere ABCA1 kolesterol efflux (fig. 3a, 4a).

Pattedyroxysterolbindende proteiner (OSBP'er) var oprindeligt impliceret i biosyntesen af ​​kolesterol og sphingomyelin47-49. Adskillige undersøgelser har forbundet specifikke OSBP'er med reguleringen af ​​ABC Al-proteinstabilitet og ABCAl-medieret kolesteroludstrømning50,51. Ingen data før denne rapport har impliceret OSBPL7 som regulator af ABCA1. Vores data tyder på, at OSBPL7 kan give en chaperone eller substratoverførselsfunktion, der påvirker ABC Al. Foreløbige co-immunpræcipitationseksperimenter i transficerede celler identificerede ikke en direkte interaktion mellem de to proteiner. Imidlertid identificerede en meta-analyse af genom-wide association studies (GWAS) OSBPL7 blandt 60 genetiske loci, der påvirker plasmakolesterolniveauer hos mennesker.

Vores langsigtede interesse for ABC Al's rolle i nyresygdom førte os til at evaluere 5-arylnicotinimiderne in vitro og in vivo modeller for nyresygdom. Vi fandt, at OSBPL7 udtrykkes i nyrer, herunder i glomeruli og podocytter, og at Cpd A og Cpd G opregulerer apo Al-medieret kolesteroludstrømning fra kolesterolbelastede podocytter. Cpd A og Cpd G fremmer en stigning af ABCAl ved plasmamembranen uden at påvirke mRNA-ekspression. Denne mekanisme står i kontrast til LXR-agonister, som opregulerer ABCAl mRNA, hvilket fører til en stigning i ABC Al i både plasma og intracellulære membraner. Vi evaluerede den terapeutiske effektivitet af Cpd A og Cpd G in vivo i en musemodel af FSGS (ADR-induceret nefropati). Begge midler viste sig at reducere renalt kolesterolindhold, hvilket korrelerede med reduceret proteinuri, vægttab og nyrepatologiske ændringer. Cpd G var yderst effektiv til at forhindre ADR-induceret podocyttab og glomerulære strukturelle ændringer. Den betydelige reduktion af ABCAl i nyrerne, ledsaget af en stigning iinflammatoriskproteiner, blev forhindret af Cpd G, hvilket understøtter en nøglerolle for ABCA1. Cpd G reducerede effektivt albuminuri, BUN og serumkreatininniveauer i AS-mus. Endnu vigtigere er det, at Cpd G forlængede levetiden hos ældre Col4a3-dyr med fremskreden nyresvigt.

Disse data understøtter det terapeutiske potentiale af forbindelser rettet mod ABCAl og antyder kraftigt, at denne nye virkningsmåde vil tilbyde yderligere eller komplementær effektivitet til lægemidler rettet mod RAAS, SGLT2, NRF2 og kolesterolsyntese eller -absorption. Især, i modsætning til effekten af ​​Cpd G, forlænger RAAS-blokade ikke levetiden hos ældre Col4a3-mus, på trods af at den er den mest effektive terapi til tidlig intervention i denne model53,54. Den antiproteinuriske aktivitet af Cpd G var overlegen i forhold til virkningerne af ramipril, vi tidligere rapporterede i en syngen model af AS38. Cpd G kan derfor bedre målrette mod populationen af ​​patienter med AS og proteinuri sammenlignet med bardoxolon, en NRF-2-agonist, der viste sig at øge GFR, men som ikke havde nogen effekt på proteinuri, den mest kraftfulde forudsigelse af 10- års ESRD-risiko i den generelle befolkning55,56. Statiner viste sig at være beskyttende i eksperimentel AS57 og anbefales til alle CKD-patienter for at reducere kardiovaskulær risiko, men har vist sig at være ineffektive til at bremse udviklingen af ​​nyresygdom 8. Endelig har vi for nylig rapporteret en potentiel fordel ved ezetimib i AS ved reduktion af fedtsyre- og triglyceridabsorption. Imidlertid påvirkede ezetimib ikke nyrernes kolesterolindhold, og dets effektivitet til at forbedre GFR og reducere proteinuri var ringere end de virkninger, vi rapporterer her for Cpd G

Sammenfattende beskriver denne rapport identifikation ved fænotypisk lægemiddelopdagelse af første-i-klassen lægemiddellignende små molekyler, der inducerer ABCAl-medieret kolesteroludstrømning. Kemisk biologi identificerede OSBPL7 som det molekylære mål og demonstrerede, at molekylerne interagerer intimt inden for dets forudsagte oxysterolbindingsdomæne. Så vidt vi ved, er dette et af kun få eksempler på lægemiddellignende forbindelser, der oprindeligt blev opdaget ved fænotypiske tilgange, hvis mål efterfølgende blev identificeret med succes44. Forbindelser G og A var yderst effektive til at forbedre nyrefunktionen i musemodeller, hvilket afspejlede to forskellige ætiologier af progressiv nyresygdom. De ser ud til at være sikre og veltolererede, hvilket afspejles af deres evne til at reducere AST-niveauer i ADR-udfordrede mus og, mere overbevisende, at forlænge levetiden for Col4A3 KO-mus. Disse forbindelser kan tilbyde en potentiel ny terapi for nyresygdom ved at målrette cellulært kolesterolmetabolisme gennem en ny virkemåde. Disse midler kan sammen med nuværende lægemidler rettet mod blodtryk eller glukosekontrol imødekomme det betydelige udækkede behov ved CKD.

Metoder

Forbindelser. Forbindelserne anvendt i denne undersøgelse er opsummeret i supplerende tabel 5 og blev syntetiseret hos F.Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Schweiz, medmindre andet er angivet. Til in vitro-eksperimenter blev lyofiliserede forbindelser rekonstitueret i DMSO (Sigma), og alikvoter blev opbevaret ved -20 grad. Til in vivo-eksperimenter blev lyofiliserede forbindelser resuspenderet i vehikler indeholdende 1,25 procent hydroxypropylmethylcellulose, 0,10 procent docusatnatriumsalt,0,18 procent propylparabennatrium og 0,02 procent citronsyre monohydrat, ved pH 6. En fin partikelsuspension blev genereret ved tre korte pulslydbehandlinger udført på is.

Syntetiske kemiske procedurer og analytiske data. Se venligst Supplerende Data 1-filen.

Kemisk biologi/kandidatmål-screening Kort fortalt blev et plasmid, der udtrykker et kandidatmål af interesse fusioneret med et FLAG-mærke, transficeret ind i HEK293-celler. Efter 24 timer blev tritieret forbindelse K i en koncentration, der var i stand til at inducere ABCA1--medieret kolesteroludstrømning (1.0 μM) tilsat i 3 timer, hvorefter de levende celler blev udsat for UV-lys (K{{ 7}} nm) for at forespørge om potentiel sammensat/mål-tværbinding in situ. Cellelysater blev fremstillet, det udtrykte protein blev derefter selektivt immunpræcipiteret under anvendelse af et anti-FLAG-antistof koblet til sepharose-perler, bundne proteiner blev separeret ved SDS-PAGE, og to identiske blots blev fremstillet og probet ved western blot og ved autoradiografi for at påvise proteinekspression og henholdsvis tilstedeværelse eller fravær af sammensat tværbinding. Flowdiagrammet for denne skærm er illustreret i fig. 2. Figur 2d illustrerer evnen af ​​Cpd A og Cpd G til at fortrænge tritieret Cpd K fra overudtrykt og immunpræcipiteret OSBPL7. Figur 3b illustrerer anvendelsen af ​​dette assay til at detektere bindingen af ​​tritieret Cpd K til overudtrykte og immunpræcipiterede varianter af OSBPL7 indeholdende punktmutationer i den forudsagte oxysterolbindingslomme af OSBPL7. Fordelene ved denne metode er bl.a. brugen af ​​plasmidtransfektion fører til høj ekspression af hver kandidat, hvilket reducerer sandsynligheden for at gå glip af et autentisk mål for dem, der kan udtrykkes ved lave endogene niveauer, iii. interaktionen af ​​den kemiske probe med dens mål sker i en relevant biologisk kontekst (levende celler) ved en farmakologisk aktiv koncentration, og iii. immunpræcipitation tillader det udtrykte protein af interesse at blive oprenset fra baggrundsproteiner, hvilket væsentligt forbedrer signal/støj-forholdet.

Cellekultur. Cellelinjer blev købt fra ATCC og subdyrket i ikke mere end passage 15, bortset fra humane podocytter, som oprindeligt var fra Dr. Jochen Reiser. Betinget udødeliggjorte humane podocytter blev dyrket under permissive forhold ved 33 grader i RPMI-medium (Corning) indeholdende 10 procent FBS (GIBCO),1 procent penicillin/streptomycin,0.01 mg/ml rekombinant humant insulin, 0,0055 mg/ml humant transferrin (i det væsentlige jernfrit) og 0,005 ug/ml natriumselenit (ITS, Corning). For at inducere differentiering blev podocytter dyrket ved 37 grader i 14 dage i et RPMI-medium indeholdende 10 procent FBS (GIBCO) og 1 procent penicillin/streptomycin. Differentierede podocytter blev udsultet i RPMI-0.2 procent FBS i 18 timer og derefter behandlet med 1 uM, 5 uM og 10 µM forbindelser frisk fremstillet i DMSO i 18 timer ved 37 grader som angivet.

Kolesterol efflux i makrofager og fibroblaster. Forbindelsernes evne til at inducere ABCAl-medieret kolesteroludstrømning blev bestemt i replikatkulturer af THP1-celler eller fibroblaster i 96-brøndsmikroplader. Celler blev udpladet med en tæthed på 150,000 celler/brønd. THP1-monocytter blev differentieret til makrofager ved tilsætning af PMA (100 nM) i 72 timer i et RPMI-medium indeholdende 10 procent føtalt bovint serum og 3 pi 2-mercaptoethanol. Celler blev vasket én gang med RPMI-1640 og derefter fyldt med 50 ug/ml acetyleret LDL og 10μCi/ml 【'H】-kolesterol i RPMI-1640-medium indeholdende 2 procent FCS i 48 timer ved 37 grader . Efter påfyldning blev cellerne vasket én gang med RPMI-1640 og inkuberet med testforbindelser i yderligere 24 timer i RPMI-1640-medium indeholdende 1 mg/ml fedtsyrefrit bovint serumalbumin (BSA). Celler blev derefter vasket én gang, og kolesteroludstrømning blev induceret ved tilsætning af 10 ug/ml humant apoAI eller 30 ug/ml HDL2, HDL3 eller LDL i RPMI-1640 indeholdende 1 mg/ml BSA for en yderligere 6 timer. Radioaktivitet i kultursupernatanter blev bestemt ved scintillationstælling. Kolesteroludstrømning blev udtrykt som en relativ værdi i forhold til kontroller inkuberet i fravær af kolesterolacceptorer. Dosis-respons-kurver blev beregnet under anvendelse af XLfit3 (ID Business Solutions Ltd. UK).

Kolesterol efflux i podocytter. Humane podocytter differentieret i 13 dage blev mærket i 24 timer ved 37 grader i RPMI-medium indeholdende 2 procent FBS og [PH]-kolesterol (1 uCi/ml, American Radiolabeled Chemicals). Celler blev derefter vasket 3 gange med PBS og inkuberet med RPMI suppleret med 0,2 procent fedtfri-BSA (Sigma) med eller uden forbindelser i 18-h ved 37 grader. Forbindelserne blev brugt i følgende koncentrationer: Cpd C（1 μM）, Cpd A (1 μM, 5 uM) og Cpd G（l uM, 5 uM,10 μM）. Efter 18- timers inkubation blev human apoAI (Calbiochem) tilsat til mediet (20 ug/ml slutkoncentration), og cellerne blev inkuberet i yderligere 18 timer ved 37 grader. Alikvoter af medium opsamlet før (T =0h) og efter (T=18h) tilsætningen af ​​apoAI blev centrifugeret ved 12,00×g i 5 minutter og radioaktiviteten i supernatanten blev talt ved væskescintillation. Celler blev derefter vasket med PBS, lyseret 0,1 procent SDS, 0,1 M NaOH, og radioaktiviteten i lysaterne blev kvantificeret ved væskescintillation. apo Al-medieret kolesteroludstrømning, udtrykt som procent, blev beregnet som mængden af ​​mærke frigivet til mediet efter tilsætning af apo Al (forskellen i radioaktivitet i mediet før og efter tilsætning af ApoA1) divideret med mængden af ​​total mærke i hver brønd (radioaktivitet frigivet til mediet plus radioaktivitet i de lyserede celler).

siRNA undersøgelser. siRNA-puljer, der er specifikke for human OSBPL7, human CBIR og non-target siRNA negativ kontrol er opsummeret i supplerende tabel 6. THPI monocytter blev udsået ved en tæthed på 80,000 celler/brønd i {{4} }brøndsplader og differentieret med PMA som beskrevet ovenfor. Efter 72 timer blev mediet erstattet med 50 ul frisk medium pr. brønd. Celler blev derefter transficeret under anvendelse af Viromer Blue-reagens (Origene) efter producentens anvisninger. Kort fortalt blev 10 ul siRNA (5 μM) blandet med 90 ul Viromer Blue (fortyndet 1 procent v/v i medfølgende buffer). Efter 15 minutters inkubation blev siRNA-transfektionsreagenskomplekser fortyndet ved 1:6,5 i frisk medium og tilsat til et volumen på 50 ul pr. brønd. Efter 24 timer blev cellerne derefter fyldt med kolesterol ved inkubation med acetyleret LDL (25 ug/ml) i RPMI-medium, 1 procent FBS, 100 nM PMA, 2 μCi H-kolesterol i 24 timer. Et sæt brønde indeholdende transficerede celler blev sat til side for at verificere transfektionseffektiviteten ved RT-PCR. De kolesterolfyldte makrofager blev derefter inkuberet i nærvær af Cpd G 5 uM eller vehikel (0,1 procent DMSO) i RPMI-medium med phenolrødt, 0,2 procent BSA) i yderligere 24 timer. Kolesterol efflux blev derefter målt som beskrevet ovenfor.

RT-PCR. RNA blev isoleret under anvendelse af RNEasy Plus Mini-kittet (Qiagen). Omvendt transkription blev udført under anvendelse af qScript cDNA SuperMix(Quantabio) i henhold til producentens instruktioner. Kvantitativ realtids-PCR blev udført under anvendelse af TaqMan Fast Universal PCR Master Mix og Taqman-genekspressionsassays (supplerende tabel 7).

Western blot. Lysater eller cellefraktioner blev inkuberet i Laemmli-buffer ved 55 grader i 10 minutter under reducerende betingelser. I alt 30 ug protein fra cellelysater eller en tredjedel af volumenet opsamlet i cellefraktionspræparater blev separeret ved SDS-PAGE i 4-20 procent gradientgeler (Biorad), og proteiner blev derefter overført til PVDF-membraner. Efter blokering med 5 procent TBS-mælk blev membraner probet med primære antistoffer natten over ved 4 grader. Følgende primære antistoffer blev brugt: muse-anti-ABCA1(Abcam; 1:1000), kanin-anti-GAPDH-antistof (Milli-pore;1:10,000), muse-anti-aktin( CP01,Millipore 10,000),anti-MEK, anti-ERp72, anti-V5 og anti-Na plus /K plus ATPase(cellesignalering; alle 1:100) og kanin anti-OSBPL7(Sigma 1:1000). Efter vask blev membraner inkuberet med anti-kanin- eller anti-muse-IgG-HRP-antistoffer (Promega, 1:10,00). Signaler blev detekteret efter inkubation med Westernbright ECL HRP-substrat (Advansta), og luminescenssignaler blev fanget med Azure C600 Gel Imaging-arbejdsstation (Azure Biosystems Inc, USA) eller røntgenfilm.

Cellefraktionering. Differentierede podocytter blev behandlet med forbindelserne Cpd C （l μM）, Cpd A（5 μM） eller Cpd G（10 μM） i 18 timer, vasket og derefter høstet i iskold PBS. Celler blev centrifugeret ved 1000×g i 5 minutter, supernatanten blev forsigtigt fjernet, og pelleten blev resuspenderet i hypotonisk buffer (15 mM KCl, 1,5 mM MgClz, 10 mM HEPES og 1 mM DTT) suppleret med en protease inhibitor cocktail (Roche). Celler blev sprængt med en glasdæmper, og saccharose blev tilsat for at opnå en slutkoncentration på 227 mM. Cellelysater blev centrifugeret ved 1000×g i 30 minutter ved 4 grader. Supernatanten blev derefter overført til et nyt rør og centrifugeret ved 10.000 xg i 15 minutter ved 4 grader. Pelleten, der indeholdt den mikrosomale fraktion, blev opsamlet, og supernatanten blev overført til et nyt rør og centrifugeret ved 100.000 xg i 1 time ved 4 grader. Den pelleterede plasmamembranfraktion blev opsamlet, og supernatanten, der indeholdt den organelfri cytosolfraktion, blev koncentreret i Vivaspin 500 filtersøjler. Western blot blev udført under anvendelse af antistoffer for ABCAl og specifikke markører for hver membranfraktion som beskrevet ovenfor. Nat/K plus ATPase blev brugt til at identificere plasmamembranfraktionen, ERp72 som en markør for den mikrosomalt berigede fraktion og MEK som kontrol for den ikke-membranøse cytosoliske fraktion.

ABC AT co-immunpræcipitation. ABCA{{0}}Flagkonstruktion blev venligst leveret af Dr.Michael Fitzgerald, Harvard University. OSBPL7-V5-konstruktion (pcDNA3.1-V5-ORP7) blev købt fra Addgene. Pattedyrsekspressionsvektorer PCMV6-AN-GFP og pCMV6-AC-3DDK, fra Origene, blev brugt som negative kontroller. HEK293-celler blev transient co-transficeret med en af ​​følgende plasmidkombinationer:(1)ABCA1-Flag plus OSBPL7-V5;(2)ABCA1-Flag plus PCMV{{19 }}AN-GFP; eller(3) OSBPL7-V5＋pCMV6-AC-3DDK ved hjælp af Fugene 6-transfektionsreagens (Promega) ved at følge producentens instruktioner. 48 timer efter transfektion blev celler lyseret med 1 ml immunpræcipitationsbuffer (1 procent Triton X-100,50 mM Tris-Cl pH 7,0,150 mM NaCI) suppleret med en proteaseinhibitorcocktail (Roche). Lysaterne blev renset ved centrifugering, og lige store mængder af totale proteiner fra hver supernatant blev inkuberet natten over ved 4 grader med 30 ul anti-Flag M2 Affinity gel (Sigma Aldrich). Perlerne blev pelleteret ved centrifugering og vasket 5 gange med 1 ml immunpræcipitationsbuffer. Immunpræcipiterede proteiner blev elueret ved at inkubere perlerne med 50 ul 2x prøvebuffer i 15 minutter ved 56 grader. Tilstedeværelsen af ​​ABC A1 og OSBPL7-V5 i lysaterne og eluaterne blev verificeret ved western blot som beskrevet ovenfor.

Dyreundersøgelser. Dyrene blev anbragt i 12 timer/12 timer lys/mørke cyklusser og under kontrolleret temperatur (18-23 grad) og fugtighed (40-60 procent) i en patogenfri dyrefacilitet under afdelingen for veterinære ressourcer på universitetet fra Miami, Miller School of Medicine. Mus fik en standard 18 procent protein gnaverfoder diæt og vand ad libitum. Studieprotokollen blev godkendt af Animal Care and Use Committee (IACUC) ved University of Miami, som er akkrediteret af Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Alle procedurer blev udført i overensstemmelse med alle føderale og statslige etiske regler, herunder Animal Welfare Act (AWA)-bestemmelserne overvåget af United States Department of Agriculture (USDA) og Public Health Service Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals (PHS) Politik) administreret af National Institutes of Health (NIH), Office of Laboratory Animal Welfare (OLAW). Balb/c hunmus blev købt fra Jackson Laboratories til Adriamycin-inducerede nefropatiundersøgelser. Ved 8 ugers alderen modtog mus en enkelt dosis Adriamycin (Sigma-Aldrich, 12 mg/kg) eller vehikel (0,9 procent NaCI) via haleveneinjektion. Mus blev tilfældigt adskilt i seks eksperimentelle grupper og, startende 24 timer efter ADR-injektion, behandlet med enten vehikel eller forskellige doser af forbindelser dagligt via oral gavage i 28 dage. Følgende doser blev anvendt: Cpd C (LXR-agonist) 10 mg/kg; Cpd A 30 mg/kg; Cpd G 100mg/Kg. Alle dyr blev aflivet 28 dage efter ADR-injektion. Col4a3 KO-mus (Col4a3tmiDec-stamme 129X1/SvJ) blev købt fra Jackson Labs. Mus blev tilfældigt adskilt i 2 grupper. Startende ved 4 ugers alderen blev musene doseret ved oral sonde en gang dagligt med enten vehikel eller Cpd G (100 mg/kg) i 4 uger efterfulgt af aflivning ved 8 ugers alderen. En anden undersøgelse blev udført i Col4a3 KO-mus med behandling påbegyndt ved 6 ugers alderen. Denne undersøgelse blev udført for at vurdere, om Cpd G-behandling af mus med etableret nyresvigt kunne forsinke nyresygdom i slutstadiet og derfor forlænge overlevelsen. Til behandling med ramipril begyndte Col4a3 KO-mus at få ramipril i en alder af 4 uger. Ramipril blev tilsat drikkevandet i en koncentration, der ville føre til en dosis på 10 mg/kg/dag 8.

Fænotypisk analyse af mus. Ugentlige pleturinprøver blev indsamlet. Urinalbumin blev målt ved ELISA (Bethy! laboratorier) og kreatinin ved et kolorimetrisk assay (Stanbio). Albuminuri blev udtrykt som albumin/kreatinin-forholdet. Mus blev bedøvet med ketamin (90 mg/kg)/xylazin (10 mg/kg), blod blev opsamlet i hepariniserede rør, og dyrene blev derefter perfunderet via venstre ventrikel med 0,9 procent NaCl-opløsning. Nyrebarken blev omhyggeligt skåret ud og adskilt i prøver, der enten blev lynfrosset, indlejret i OCT eller fikseret i 10 procent formalin til efterfølgende vurderinger.

Bestemmelse af lipidaflejring i nyrebarkssnit. OCT-indlejrede nyrebarkprøver blev kryosektioneret i 4 μm tykkelse og farvet med olie. Rød O-isopropanol-opløsning (Electron Microscopy Science, PA) fortyndet 6:4 i vand og derefter modfarvet med Hematoxylin Harris Hg Free (VWR, PA). Snit blev derefter vurderet ved anvendelse af et lysmikroskop (Olympus BX 41, Tokyo, Japan).

Bestemmelse af kolesterol- og triglyceridindhold. Snap frosne nyrecortex-prøver blev homogeniseret i 2 mM kaliumphosphatbuffer, pH 7,(1{{10}} pulbuffer/mg væv) ved hjælp af en glasdæmper på is. 100 ul af homogenatet blev blandet grundigt med 1 ml hexan:isopropanol (3:2;vv) pr. volumen vævshomogenat Den vandige (pellet) og organiske (supernet) fase blev adskilt ved centrifugering ved 12,000× g i 5 min. Pellets (vandfase) blev tørret og rekonstitueret i 8 M urinstof, 0,1 procent SDS, 0,1 M NaOH, og totale proteiner blev kvantificeret ved BCA-metoden (Thermofisher) Den organiske fase blev tørret ved eksponering for nitrogen. Lipider blev derefter rekonstitueret i 100 ul isopropanol∶NP-40 (9:1;vv). Triglyceridindhold blev analyseret ved hjælp af et kolorimetrisk kit i henhold til producentens instruktioner (Cayman Chemical USA). Totalt kolesterol- og CE-indhold blev analyseret vha. en enzymatisk fluorometrisk metode59. Til total kolesterolmåling blev ekstrakter fortyndet 1:100 i assaybuffer (100 mM kaliumphosphat) e,50mM NAC,5mM cholsyre,0,1 procent Triton X-10,pH 7,4) indeholdende kolesteroloxidase(1 U/ml), kolesterolesterase(1 U/ml), peberrodsperoxidase（1 U/ml）, og Amplex Red (75 μM). Reaktionerne blev inkuberet ved 37 grader i 30 minutter i en sort uigennemsigtig 96-brøndplade (Greiner), og fluorescens blev målt i en mikropladelæser (Spectramax i3X, Molecular Devices) ved 530 nm excitation og 580 emissioner.

Til CE-bestemmelse blev 150 µl af assaybufferen beskrevet ovenfor, suppleret med bovin leverkatalase (45 E/ml) og kolesteroloxidase (1 E/ml), tilsat til 25 µl prøve og inkuberet natten over ved 37 grader for at udtømme fri. kolesterol efterlader kun kolesterolestere. Derefter blev der tilsat 75 µl cholesterolesterdetektionsreagens (1 U/ml cholesteroloxidase, 4 U/ml cholesterolesterase, 24 U/ml peberrodsperoxidase, 300 μM Amplex Red). Reaktionen blev inkuberet ved 37 grader i 30 min. fluorescenssignalet blev målt som beskrevet ovenfor Interne standarder inkluderede prøver indeholdende 1 mM cholesterol og 5 µM cholesterololeat for at verificere fuldstændigheden af ​​den enzymatiske nedbrydning af frit cholesterol såvel som assaysensitivitet og specificitet.

Histologisk vurdering. Formalinfikserede paraffinindlejrede nyrebarksektioner på 4 um tykke blev farvet med periodic acid-Schiff(PAS). Objektglassene blev analyseret af en nyrepatolog i et dobbeltblindt design. Glomerulær sklerose (global og segmental), podocythypertrofi og podocythyperplasi blev udtrykt som procentdelen af ​​glomeruli fundet med disse abnormiteter. Tubulære mikrocyster og interstitiel inflammation blev bedømt på en 0-4-skala, hvor 0=0 procent ,05=1-10 procent ,1=11-25 procent ,2:26-50 procent ,3:{{ 12}} procent og 4=mere end 75 procent skade. Den mesangiale ekspansion blev scoret baseret på semi-kvantitativ analyse (skala 0-5) eller procent af glomeruli, der udviser mesangial ekspansion (procent ).

Immunfluorescensmikroskopi. Til påvisning af ABC Al-ekspression blev 4 um paraffinnyrebarksnit afparaffineret og rehydreret. Antigener blev udvundet ved kogning i 30 minutter i citratbuffer pH 6.0(Target Retrieval Solution, Citrate pH 6, Sigma, USA). Sektionerne blev permeabiliseret i 30 minutter med 0,1 procent Triton X-100 i TBS. Vævssnit blev inkuberet med 10 procent gedeserum (kat #G9023, Millipore Sigma) og 1 procent BSA (kat# SP-5050-500, Vector, USA) i TBS-T i 1 time ved stuetemperatur for at blokere enhver uspecifik bindende. Prøver blev derefter inkuberet natten over ved 4 grader med rotte anti-ABCAl (Novus, 1:200) og kanin anti-WI1 (Abcam, 1:200) antistoffer i et befugtet kammer. Efter grundig vask blev prøverne derefter inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med fluorochrom-konjugerede sekundære antistoffer (Invitrogen, 1:500). Antifade monteringsmedier indeholdende DAPI (Vectashield Plus) blev tilføjet til sektionerne før de blev analyseret

Billeder blev optaget ved hjælp af et FluoView FV1000 Confocal Microscope (Olympus) med en x63 olieobjektivlinse i forskellige planer ved hjælp af et Z-seriemønster med en trinstørrelse på 0,18 um. Under analysen blev individuelle fly deconvoluted og stablet for at producere et maksimalt projiceret billede ved hjælp af influenzavisningssoftware version 4.3b (Olympus). Der blev taget minimum 5 billeder fra 5 forskellige felter pr. prøve. Kvantificering af ABCAl glomerulær gennemsnitlig fluorescensintensitet (MFI) blev udført ved hjælp af Fiji-ImageJ-software.

Til påvisning af OSBPL7 blev 4 um frosne nyrebarkssnit indlejret i OCT fikseret med PFA-saccharose (2 procent ,4 procent) i PBS i 2 0 minutter ved stuetemperatur og permeabiliseret med 0,3 procent Triton-PBS for 15 min og blokeret med blokeringsbuffer (5 procent FBS i PBS) i 1 time. Vævssektioner blev derefter inkuberet med kanin anti-OSBPL7 (Sigma, 1:50) og gede anti-Synaptopodin (Santa Cruz, 1:800) antistoffer i et befugtet kammer natten over ved 4 grader. Efter grundig vask blev prøverne derefter inkuberet med fluorochrom-konjugerede sekundære antistoffer og dækket med monteringsmedier som beskrevet ovenfor. Billeder blev taget ved hjælp af et Leica DMI 6000B fluorescerende mikroskop.

Statistisk analyse. GraphPad Prism ver 6 eller 7 blev brugt til at udføre alle statistiske analyser. Grupper blev sammenlignet ved hjælp af en tosidet t-test eller envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts eller Tukeys test. F, Brown-Forsythe eller Bartletts test blev brugt til at bestemme signifikante varianser mellem grupperne, hvis P<0.05, then="" groups="" were="" compared="" using="" two-tailed="" mann-whitney,="" or="" kruskal-wallis="" followed="" by="" dunn's="" tests.="" the="" correlation="" between="" albuminuria="" and="" accumulation="" of="" cholesterol="" ester="" in="" kidney="" cortexes="" was="" assessed="" using="" the="" spearman="" coefficient="" test.="" p=""><0.05 were="" considered="" statistically="" significant.="" only="" data="" from="" independent="" experiments="" were="">

Alle dyr blev tilfældigt tildelt til behandlingsgrupper.