Centrale Fbrøse områder: Ændringer i glomerulære vaskulære pollæsioner forbundet med alder og sygdom

Abstrakt

1. Formål

Centrale fibrøse områder (CFA'er) er små, hyalinotiske, monotone nodulære områder observeret i glomerulære vaskulære pollæsioner. Vi forsøgte at klarlægge forholdet mellem CFA-dannelse og alder i raske nyrer og hos dem, der er ramt af immunglobulin A (IgA) nefropati.

2. Metoder

Nultimers biopsiprøver fra levende nyredonorer (135 tilfælde) og IgA nefropatibiopsiprøver (67 tilfælde) blev indsamlet retrospektivt. Vi observerede hver biopsiprøve og bestemte det samlede antal glomeruli, det totale niveau af glomerulosklerose, antallet af observerbare glomerulære vaskulære poler, antallet af glomeruli med CFA'er, serumkreatininniveau og estimeret glomerulær filtrationshastighed (eGFR). Derudover beregnede vi glomerulær sklerosefrekvens (GSR), vaskulær poludseendehastighed (PAR) og CFA-rate (CFAR) for at evaluere forholdet mellem disse faktorer og patientens alder.

3. Resultater

Der var en signifikant negativ sammenhæng mellem patientens alder og eGFR for både nul-timen (s<0.0001 in Spearman, p=0.0009 in multiple regression, the same hereafter) and IgA (p=0.0022, p=0.0001) groups. In the zero-hour group, we observed a significant positive correlation between patient age and GSR (p=0.0001, p<0.0001); however, there was no such correlation in the IgA group. In both groups, there was a significant positive correlation between patient age and CFAR (zero-hour group: p=0.0003, p=0.0091, IgA group; p<0.0001, p=0.0004). The slope of the regression line of the IgA group formula was also significantly higher than that of the zero-hour group formula (p<0.01).

4. Konklusion

Disse resultater indikerer, at CFA kan være en nyttig indikator for nyreældning, især hos patienter med nyresygdom forårsaget af IgA nefropati.

5. Nøgleord

Centralfibrøst område · Aldring · Nyredonor · IgA nefropati

Klik her for at vide, hvad effekten af ​​Cistanche er

Introduktion

Ændringer i de vaskulære poler af renal glomeruli er blevet rapporteret meget sjældnere end ændringer i andre dele af glomeruli, såsom mesangiale læsioner [1] og dem, der påvirker podocytter [2-4] og den glomerulære basalmembran [1, 3, 5, 6]. Små hyalinotiske nodulære områder er dog nogle gange blevet observeret i glomerulære vaskulære pollæsioner. Disse knuder er monotone og farves blå af Masson-farvning, er svagt positive for periodic acid Schif (PAS)-farvning og kan være immunhistokemisk positive for immunoglobulin M (IgM) (fig. 1).

Fig. 1 Lysmikroskopiske fund af centrale fibrøse områder (CFA) I samme glomeruli (a–c) og immunoglobulin M (IgM) immunhistokemisk farvning af en anden glomerulus (d). Lille monoton hyalinotisk knude i en glomerulær vaskulær pollæsion (pil). Nodulen blev farvet blå af Masson-farvning (a) og udviste svagt positiv periodic acid Schif (PAS)-farvning (d), negativ eller svag positiv periodic acid sølv-methenamin (PAM)-farvning (c) og immunhistokemisk positiv IgM-farvning (pil ) (d)

Få rapporter har beskrevet disse knuder. Vores søgning identificerede kun én rapport af Inomata [7] offentliggjort i 1986, hvori forfatteren omtalte læsionerne som vaskulære polaflejringer (VPD). Imidlertid har vi observeret disse knuder i renale histopatologiske prøver med en vis hyppighed. Derfor mener vi, at knuderne dannes som følge af nogle betydelige påvirkninger på nyrevævet. I denne undersøgelse definerede vi knuder som centrale fibrøse områder (CFA'er).

Til dato er der ikke rapporteret statistisk bevis for sammenhængen mellem CFA-dannelse og patientens alder. Derfor forsøgte vi i denne undersøgelse at klarlægge forholdet mellem CFA-dannelse og aldring ved hjælp af nyrebiopsiprøver. Vi forsøgte også at evaluere indflydelsen af ​​glomerulær sygdom (repræsenteret af immunoglobulin A (IgA) nefropati) på CFA-dannelse. I betragtning af, at vi har observeret, at CFA'er er almindelige i nyrevævet hos ældre patienter, antog vi, at ældning af nyrevæv fremmer CFA-dannelse.

Materialer og metoder

Levende nyredonorer fra afdelingen for urologi ved Tokyo Women's Medical University og patienter med IgA nefropati, som gennemgik deres første nyrebiopsi på afdelingen for nefrologi eller afdelingen for pædiatrisk nefrologi på samme universitet, blev biopsieret mellem januar 2014 og juni 2015. Alle donorer gennemgik en nul-timers biopsi under donornefrektomi. Alle donorer og patienter med IgA nefropati med diabetes og/eller en anden glomerulær sygdom end IgA nefropati blev udelukket for at eliminere eksterne faktorer, der kunne påvirke nyrestrukturen i størst muligt omfang. Patienter, der fik ordineret antihypertensiva, blev inkluderet, hvis deres blodtryk blev kontrolleret med succes.

Deltagerne blev opdelt i to grupper som følger: nultimersgruppen, som bestod af donorer uden IgA nefropati, og IgA-gruppen, som omfattede patienter med IgA nefropati. Donorer diagnosticeret med IgA nefropati, når en nul-timers biopsi blev udført, blev også klassificeret i IgA-gruppen.

Oplysninger vedrørende alder, køn, serumkreatinin (sCr) og estimeret glomerulær filtrationshastighed (eGFR) blev gennemgået retrospektivt fra patientens journaler lige før deres donoroperation eller nyrebiopsi. Vi brugte eGFR-data fra patienter, der var større end eller lig med 18 år, da nyrebiopsien blev udført, fordi eGFR-beregningsformlen for børn under 18 år afveg fra den for voksne, og eGFR ikke var blevet beregnet for det meste af barnet patienter.

Standardiseret Cistanche

Patologiske undersøgelser

Vi brugte de præparerede prøver fra bestande, der tidligere var blevet klinisk diagnosticeret. Donor nul-timers biopsiprøver blev indsamlet via kilebiopsi. Nyrebiopsiprøver fra Nefrologisk Afdeling eller Pædiatrisk Nefrologisk Afdeling blev indsamlet via nålebiopsi.

Biopsiprøver blev fikseret i 10 procent bufret formaldehyd og indlejret i paraffinblokke. Prøverne blev skåret i 2-μm tykke sektioner og farvet med hæmatoxylin-eosin (HE), Masson, Elastica-Masson, PAS og periodic acid silver-methenamine (PAM)-HE. Disse prøver blev observeret ved hjælp af et lysmikroskop for at undersøge antallet af totale glomeruli, det totale niveau af glomerulosklerose, tilstedeværelsen af ​​glomeruli med en observerbar vaskulær pol og tilstedeværelsen af ​​glomeruli med en CFA i deres vaskulære pollæsion. Vi bestemte, at en CFA var til stede, når en monoton nodulær læsion blev observeret i to serielle sektioner af den samme glomerulus.

scleroserate (GSR) var graden af ​​glomerulosklerose i forhold til det samlede antal glomeruli. CFA'er er histopatologiske fund, der kun kan genkendes i glomeruli med en observerbar vaskulær pol. Af denne grund bør antallet af glomeruli med en observerbar vaskulær pollæsion i hver prøve være nævneren for den numeriske evaluering af CFA-udseende. Vi beregnede hastighederne af glomeruli med en observerbar vaskulær pol til ikke-sklerotisk glomeruli, og nominerede derefter resultatet som den vaskulære pole udseendehastighed (PAR). Derefter beregnede vi rater af glomeruli med CFA til glomeruli med en observerbar vaskulær pollæsion i hver prøve og udpegede resultatet som CFA-hastigheden (CFAR).

Formlerne for GSR, PAR og CFAR er som følger: GSR=glomerulosklerosetal/totalt glomerulært antal, PAR=antal glomeruli med en observerbar vaskulær pol/(total glomeruli – total med glomerulosklerose), og CFAR=antallet af glomeruli med CFA/antal glomeruli med en observerbar vaskulær pol.

Statistisk analyse

Vi beregnede nøglestatistikken for hver klinisk og histopatologisk parameter for nul-timers- og IgA-grupperne. Kontinuerlige variabler blev udtrykt som den gennemsnitlige standardafvigelse (SD). For at sammenligne data mellem nul-timers- og IgA-grupperne brugte vi to-halede Mann-Whitney U-test med undtagelse af mand/hun-forholdet, hvor 2 × 2 chi-kvadrat-testen blev brugt.

Spearmans rangkorrelationskoefficienter (two-tailed) og multipel regressionsanalyse blev brugt til at evaluere sammenhængen mellem patientens alder og sCr, eGFR, GSR og CFAR i hver gruppe. Til eGFR-evalueringen brugte vi dog kun data fra patienter i alderen større end eller lig med 18 år for de 135 nultimers-tilfælde og 58 IgA-tilfælde. Derudover evaluerede vi forskellen mellem nul-timers- og IgA-gruppernes regressionskurver ved hjælp af kovariatanalyse.

Statistisk signifikans blev sat til s<0.05. Statistical analyses were performed using Microsoft Excel version 16 (Microsoft Corporation, USA).

Etiske overvejelser

Undersøgelsen blev udført af 2013-erklæringen fra Helsinki. Skriftlig omfattende tilladelse blev indhentet fra patienterne eller forældrene til mindreårige patienter før donoroperationen eller nyrebiopsien. Informeret samtykke blev opnået i form af opt-outs på webstedet for Tokyo Women's Medical University. Den medicinske etiske komité ved Tokyo Women's Medical University godkendte denne undersøgelsesprotokol (godkendelsesnr. 3802-R2).

Herba Cistanche

Diskussion

Dette er den første undersøgelse til kvantitativ måling af CFA'er ved hjælp af nyrebiopsiprøver. Vi havde til formål at verificere hypotesen om, at ældning af nyrevæv fremmer CFA-dannelse. For at nå dette mål målte vi kvantitativt CFAR'er i hver nyrebiopsiprøve og evaluerede statistisk forholdet mellem patientens alder og CFAR. Resultaterne af undersøgelsen afslørede, at ældre nyrevæv udviste CFA'er hyppigere end yngre nyrevæv i både nultimers- og IgA-grupperne. Desuden steg CFAR med alderen mere fremtrædende i IgA-gruppen end i nultimersgruppen.

Strukturelle og funktionelle ændringer i nyrevæv relateret til sund aldring er blevet observeret på forskellige måder. GFR falder gradvist under sund aldring [3, 5, 6, 8]. Undersøgelser af relativt raske mennesker har rapporteret, at GFR falder med 0.4–0.75 ml/min/1.73 m2/år [5, 8] eller med 6.3–10 ml/min/1,73 m2/årti [1, 3]. Vi observerede også, at ældre donorer udviste lavere eGFR (faldet med ca. 0,45 ml/min/år), hvilket afspejler den sunde aldringsproces.

Nogle rapporter understøtter forestillingen om, at det glomerulære volumen stiger med sund aldring [1, 2, 4, 9], men andre undersøgelser har givet kontrasterende resultater [3, 8]. Ændringer i nefronstrukturen opstår under aldring [1-3, 8], og ældede nyrer ser ud til at udvise tubuliforstørrelse [3, 8]. Den gennemsnitlige procentdel af bindevæv i ikke-skleroserede glomeruli stiger under aldring [1], og podocytter undergår også aldersrelaterede ændringer [2, 3]. Forskere har antaget, at den progressive reduktion af levedygtige og normalt fungerende podocytter fører til glomerulær forældelse og forringelse af integriteten af ​​spalteporemembranen i glomeruli [3]. Hodgin et al. observerede, at det totale glomerulære volumen og glomerulære volumen per podocyt stiger med alderen [2]. Derudover observeres en vis specifik podocyt-stress og podocytopati hyppigere i gamle nyrer. Disse resultater indikerer, at podocytopati kan være en signifikant indikator for nyrernes aldring. Forholdet mellem sværhedsgraden af ​​podocytopati og nyresygdom er dog stadig uklart.

Få undersøgelser har evalueret aldersrelaterede ændringer i glomerulære vaskulære pollæsioner. I 1986 undersøgte Inomata nyrebiopsiprøver og observerede globulære hyalinaflejringer omkring den glomerulære vaskulære pol, og refererede til disse læsioner som VPD'er [7].

Inomata dannede to hypoteser vedrørende VPD-generering. En hypotese er, at plasmaproteinholdige materialer trænger ind i den vaskulære intima af den glomerulære vaskulære pollæsion og stabiliserer den lokale vaskulære væg. Den anden er, at mesangiale aflejringer i glomeruli bevæger sig til den vaskulære pollæsion via mesangialkanalen og akkumuleres der. Imidlertid rapporterede forfatteren ingen sammenhæng mellem VPD-dannelse og immunreaktioner. Faktisk udviste hele den undersøgte biopsiprøve en form for nyresygdom, så VPD'erne kan være blevet påvirket af nyresygdomme.

I denne undersøgelse observerede vi, at CFA'er var hyppigere og større i ældre nyrer end i yngre nyrer (fig. 6). Baseret på disse observationer antog vi, at CFA'er udvikles under aldring. Derfor undersøgte vi forholdet mellem CFA'er og nyrealder ved hjælp af nyretransplantationsdonorvæv. Desværre målte vi ikke størrelsen af ​​CFA'erne i denne undersøgelse, selvom vi mener, at dette er en vigtig parameter, som bør undersøges i fremtidige undersøgelser.

For nul-timers donor nyrer observerede vi en signifikant positiv sammenhæng mellem alder og GSR; for IgA nefropati nyrer observerede vi imidlertid ingen signifikant sammenhæng mellem patientens alder og GSR. Det er muligt, at glomerulosklerose på grund af IgA nefropati forårsagede variationer i patienternes GSR, som kan have set ud til at være en ændring på grund af aldring. Vi fandt dog, at for ældre patienter var CFAR signifikant højere i både nul-timers- og IgA-grupperne. I modsætning til nul-timersgruppen observerede vi en positiv sammenhæng mellem patientalder og CFAR i IgA-gruppen, og CFAR for IgA-gruppen udviste en signifikant hurtigere stigning i henhold til alder end CFAR for nul-timersgruppen.

Cistanche kapsler

Mekanismen for CFA-dannelse er sjældent blevet undersøgt. Det er dog kendt, at glomerulære kapillærer, herunder vaskulære pollæsioner, udsættes for forskellige former for tryk og bevægelser over tid. Glomeruli modstår vaskulært hydrostatisk tryk (60-65 mmHg), plasma kolloid osmotisk tryk (25 mmHg i den afferente ende og op til 35 mmHg i den efferente ende) og urinrums hydrostatiske tryk (20-25 mmHg) [10]. Vi antager, at vedvarende højt tryk, der påvirker glomerulære vaskulære pollæsioner, spiller en rolle i CFA-dannelsen.

Neal et al. undersøgte den tredimensionelle struktur af voksne humane glomerulære kapillærer [10]. De fandt ud af, at glomerulære kar ved vaskulære pollæsioner udvider sig i højere grad end forbindende arterier, som kaldes afferente og efferente vaskulære kamre (VC'er). Disse VC-strukturer er ikke blevet observeret i hverken gnavere eller spædbørns nyrer, hvor glomeruli er mindre end voksne human glomeruli, hvilket tyder på, at VC'er er forbundet med store voksne glomeruli. Disse forfattere simulerede hæmodynamik i glomeruli og antog, at VC'er spiller en rolle i at sikre ensartet blodfordeling til hver af de glomerulære lobuler.

Som vi observerede, er en CFA en strukturel ændring, der forekommer i VC-væggen, potentielt på grund af nedbrydningen af ​​VC-vægkomponenter fra at blive udsat for et højtryksmiljø i årtier, hvilket resulterer i CFA-dannelse i ældede glomeruli. IgA nefropati er en form for glomerulonefritis med IgA-dominant immunkompleksaflejring i de glomerulære mesangiale og para mesangiale læsioner. Mange IgA nefropati nyrevæv udviser proliferative endocapillære forandringer, halvmånedannelse og tubulointerstitiel skade, foruden mesangial matrixudvidelse og mesangial celleproliferation. Disse strukturelle ændringer i glomeruli kan forstyrre glomerulær blodgennemstrømning hos patienter med IgA nefropati. Imidlertid har ingen undersøgelser diskuteret faktisk glomerulær blodgennemstrømning i forbindelse med IgA nefropati. Fremtidige undersøgelser bør undersøge sammenhængen mellem glomerulær struktur, glomerulær blodgennemstrømning, IgA nefropati og CFA-dannelse.

Derfor er det stadig tilbage at afgøre, om IgA nefropati er forbundet med nyreældning. Oxford-klassifikationen af ​​IgA nefropati er meget brugt som en histopatologisk indikator til at forudsige de kliniske resultater af patienter med IgA nefropati [11]. Klassifikationen omfatter histopatologiske kriterier, interstitiel fibrose/tubulær atrofi og arteriosklerose, og disse kriterier er også anerkendt som aldringsrelaterede ændringer. Forskning har vist, at patienter med IgA nefropati, som skønnes at have flere aldringsrelaterede ændringer, udviser dårligere kliniske resultater, såsom ældre alder [12, 13], højere serumkreatininniveauer, interstitiel fibrose og tubulær atrofi [13].

Nyrevæv med IgA nefropati kan fremme aldersrelaterede eller aldringslignende ændringer. Klotho er for eksempel et transmembranprotein, der fungerer som en coreceptor for den vigtigste fosfaterende fibroblastvækstfaktor -23 (FGF23), som betragtes som et anti-aldringsprotein [5, 14, 15]. Klotho har forskellige roller i at lindre vaskulær forkalkning, vævshypoksi og nyrefibrose [5, 14]. En undersøgelse, der involverede en kohorte af raske mennesker i alderen 70-79 år, opdelte deltagerne efter deres opløselige klotho-niveauer, og rapporterede, at højere klotho-niveauer var forbundet med lavere odds for relative fald i nyrefunktionen [14]. I modsætning hertil faldt klotho-ekspression i nyrevæv påvirket af IgA nefropati, efterhånden som dets histopatologiske sværhedsgrad udviklede sig [15]. Faktisk har vi ikke et klart svar vedrørende forholdet mellem IgA nefropati og vævsaldring.

Cistanche tubulosa

Konklusion

Denne undersøgelse viste, at aldring er en uafhængig faktor, der fremmer CFA-dannelse. I både nul-timers- og IgA-grupperne udviste biopsiprøver fra ældre patienter signifikant højere CFAR'er, og IgA-gruppen udviste større stigninger i CFAR med alderen end nul-timersgruppen. På den anden side var GSR den mest signifikante aldringsmarkør i nultimersgruppen; der var dog ingen sammenhæng mellem GSR og patientens alder i IgA-gruppen. Disse resultater indikerer, at CFA kan være en nyttig indikator for nyrernes aldring, især i nyrer påvirket af IgA nefropati. Ikke desto mindre er der behov for yderligere undersøgelser for at afklare nytten.

Referencer

1. Stojanovic VR, Janovic ID, Ugrenovic SZ, Vasovic LP, Zivkovic VS, Jocic MV, Kundalik BK, Pavlovic MN (2012) Morfometrisk analyse af ikke-skleroseret glomeruli størrelse og bindevævsindhold under ældningsprocessen. Sci World J 2012:845046. https:// doi.org/10.1100/2012/845046

2. Hodgin JB, Bitzer M, Wockman L, Afshinnia F, Wang SQ, Conner CO, Yang Y, Meadowbrooke C, Chowdhury M, Kikuchi M, Wiggins JE, Wiggins RC (2015) Glomerulær aldring og fokal global glomerulosklerose: et fotometrisk perspektiv . J Am Soc Nephrol 26:3162-3178. https://doi.org/10.1681/ASN.2014080752

3. Denic A, Glassock RJ, Rule AD (2016) Strukturelle og funktionelle ændringer med den aldrende nyre. Adv Chronic Kidney Dis 23:19– 28. https://doi.org/10.1053/j.ackd.2015.08.004

4. Puelles VG, Douglas-Denton RN, Cullen-McEwen LA, Li J, Hughson MD, Hoy WE, Kerr PG, Bertram JF (2015) Podocyttal hos børn og voksne: associationer med glomerulær størrelse og antal af andre glomerulære residente celler . J Am Soc Nephrol 26:2277-2288. https://doi.org/10.1681/ASN.2014070641

5. O'Sullivan ED, Hughes J, Ferenbach DA (2017) Renal aldring: årsager og konsekvenser. J Am Soc Nephrol 28:407-420. https:// doi.org/10.1681/ASN.2015121308

6. Glassock RJ, Regel AD (2012) Implikationerne af anatomiske og funktionelle ændringer af den aldrende nyre: med vægt på glomeruli. Nyre Int 82:270–277. https://doi.org/10.1038/ki. 2012.65

7. Inomata I (1986) En klinisk patologisk undersøgelse af vaskulære polaflejringer observeret i nyrebiopsiprøver. Jikeikai Med J 101:1009-1020 ((på japansk))

8. Hommos MS, Glassock RJ, Regel AD (2017) Strukturelle og funktionelle ændringer i menneskelige nyrer med sund aldring. J Am Soc Nephrol 28:2838-2844. https://doi.org/10.1681/ASN.2015121308

9. Tan JC, Workeneh B, Busque S, Blouch K, Derby G, Myers BD (2009) Glomerulær funktion, struktur og antal i nyreallotransplantater fra ældre afdøde donorer. J Am Soc Nephrol 20:181-188. https://doi.org/10.1681/ASN.2008030306

10. Neal CE, Arkill KP, Bell JS, Betteridge KB, Bates DO, Winlove CP, Salmon AHJ, Harper SJ (2018) Nye hæmodynamiske strukturer i den menneskelige glomerulus. Am J Physiol Renal Physiol 315:F1370–F1384. https://doi.org/10.1152/ajprenal.00566.2017

11. Roberts ISD, Cook HT, Troyanov S, Alpers CE, Amore A, Barratt J, Berthoud F, Bonsib S, Bruijn JA, Cattran DC, Rosanna Coppo R, D'Agati V, et al (2009) Oxford-klassifikationen af IgA nefropati: patologiske definitioner, korrelationer og reproducerbarhed. Nyre Int 76:546–556. https://doi.org/10.1038/ki.2009. 168

12. Duan Z, Cai G, Chen Y, Liang S, Liu S, Wu J, Qiu Q, Lin S, Zhang X, Chen X (2013) Aldring fremmer progression af IgA nefropati: en systematisk gennemgang og meta-analyse. Am J Nephrol 38:241-252. https://doi.org/10.1159/000354646

13. Sevillano AM, Diaz M, Caravaca-Fontàn F, Barrios C, Bernis C, Cabrera J, Calviño J, Castillo L, Cobelo C, Delgado-Malleñ P, Espinosa M, Fernandez-Juarez G, et al (2019) IgA nefropati hos ældre patienter. Clin J Am Soc Nephrol 14:1183-1192. https:// doi.org/10.2215/CJN.13251118

14. Drew DA, Katz R, Krichevsky S, Ix J, Shlipak M, Gutiérrez OM, Newman A, Hoofnagle A, Fried L, Semba RD, Sarnak M (2017) Sammenhæng mellem opløselig klotho og ændring i nyrefunktion: sundhedens aldring og kropssammensætning undersøgelse. J Am Soc Nephrol 28:1859–1866. https://doi.org/10.1681/ASN.2016080828

15. Yamada K, Doi S, Nakashima A, Kawaoka K, Ueno T, Doi T, Yokoyama Y, Arihiro K, Kohno N, Masaki T (2015) Udtryk af aldersrelaterede faktorer under udvikling af nyreskade hos patienter med IgA nefropati. Clin Exp Nephrol 19:830-837. https://doi.org/10.1007/s10157-014-1070-2

Yukiko Kanetsuna1 · Kazunari Tanabe2 · Motoshi Hattori3 · Kosaku Nitta4 · Takahito Moriyama4 · Shigeru Horita5 · Yutaka Yamaguchi6

1 Afdeling af Patologi, International Universitet af Sundhed og Velfærd, Atami Hospital, 13-1 higashi-kagan-cho, Atami, Shizuoka 413-0012, Japan

2 Department of Urology, Tokyo Women's Medical University, 8-1 Kawada-cho Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

3 Department of Pediatric Nephrology, Tokyo Women's Medical University, 8-1 Kawada-cho Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

4 Department of Nephrology, Tokyo Women's Medical University, 8-1 Kawada-cho Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

5 Kidney Center, Tokyo Women's Medical University, 8-1 Kawada-cho Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan

6 Yamaguchi's Pathological Laboratory, 1-31-20 Minoridai Matsudo-shi, Chiba 270-2231, Japan