CD8 og CD4 T-cellepopulationer i menneskelige nyrer

edmund.chen@wecistanche.com

Abstrakt:Baggrund: Ved grænsesteder og i indre organer bidrager vævsresidente hukommelses-T-celler (TRM) til immunbarrieren mod patogener som vira, bakterier, svampe og cancer. Oplysninger om tilstedeværelsen og funktionen af ​​disse celler i den menneskelige nyre er imidlertid ringe. For bedre at forstå det T-cellemedierede immunologiske forsvar i dette organ, sigtede vi på at bestemme fænotypiske og funktionelle aspekter af CD8- og CD4-T-celler til stede i sunde og allotransplanteredenyre væv. Metoder: Ved hjælp af multi-kanal fellowcytometri vurderede vi fænotypen og funktionen af ​​T-celler i raske nyrevævsprøver (n=5) ognyreallotransplantatvæv (n=7) og sammenlignede disse aspekter med T-celler i perifert blod fra raske kontroller (n=13). Resultater:Nyrevævsprøver indeholdt betydelige mængder af CD8- og CD4-T-celler. I modsætning til de cirkulerende celler,nyreT-celler udtrykte ofte CD69 og CD103 og cyklede oftere aktivt. Desuden næsten allenyreT-celler udtrykte CXCR3 og udtrykte ofte CXCR6 sammenlignet med T-celler i kredsløbet. Markant,nyreT-celler producerede større mængder IFN end cirkulerende celler og var ofte polyfunktionelle. Konklusion: Funktionelle T-celler med de karakteristiske træk ved TRM findes i menneskernyrevæv. Disse celler cykler oftere aktivt og udtrykker ofte CXCR3 og CXCR6.

Nøgleord:vævsresidente lymfocytter; T-celler; CD8; CD4; CD69; CD103; nyre; allograft

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYRESYGDOMME

1. IntroduktionResident memory T-celler (TRM) forbliver i væv for at give et langsigtet lokaliseret forsvar mod patogener. I modsætning til recirkulerende T-celler kan TRM-populationer ikke påvises i perifert blod og adskiller sig væsentligt fra recirkulerende T-cellepopulationer med hensyn til deres fænotype, funktion og metabolisme [1]. Dette er faktisk ikke overraskende i betragtning af, at forskellige organsystemer, som lungerne, udsættes for højere belastninger af forskellige patogener, end det er tilfældet for kredsløbet, som generelt er isoleret fra omverdenen [2].Vævsretention af TkM varer ved i årevis og medieres af mekanismer, der involverer Sphingosine-1-phosphat receptor1 (S1PR1)-sphingosin 1-phosphate (SP1)-aksen. S1PR1 er en receptor udtrykt af T-celler, der medierer udgang fra sekundære lymfoide organer ved binding til det bioaktive signalmolekyle SP1, som er en vigtig mediator for handel med T-celler. Denne akse kan afbrydes af CD69, et membranbundet c-type lektin, der antagoniserer S1PR1-ekspression og dermed medierer retention. Ydermere induceres S1PR1-ekspression hos mus af transkriptionsfaktoren Krüppel-lignende faktor 2(KLF2), som viste sig at være nedreguleret i TRM, og derved også hæmme lymfocytudgang [3]. Til gengæld blev nedregulering af KLF2 vist at være medieret af transkriptionsfaktorhomologen af ​​Blimpl i T-celler (Hobit), som udtrykkes på en TpM-specifik måde i murine T-celler [4]. Desuden udtrykker noget TRM også CD103 (integrin E), hvorved TRM kan identificeres ved hjælp af CD69 og CD103 ekspression [1].

Mens viden om TRM-fænotype og -funktion er stigende for forskellige menneskelige væv, vides der kun lidt om disse aspekter inyre. Her udsættes T-celler for et særskilt sæt af patogener, såsom bakterier, der stiger op fra de nedre urinveje og renotrope vira som polyomavirus BK (BKPyV). Faktisk har vi for nylig beskrevet, hvordan menneskelige nyrer indeholder en undergruppe af T-celler, der udtrykker CD69 og/eller CD103, blandt hvilke der er CD8 T-celler, der specifikt målretter mod BKPyV-proteinerne virionprotein1(VP1) og stort T-antigen (LTAG)-protein [5]. Vi og andre påviste også tilstedeværelsen af ​​CD69/CD103-udtrykkende slimhinde-associerede invariante T (MAIT)-celler inyrevæv [6,7].

For bedre at forstå, hvilken slags T-celler der udgør det lokaliserede immunrespons i dette organ, brugte vi multikanal flowcytometri til at undersøge fænotypen og funktionen afnyreTRM'er, isoleret fra donornyremateriale fra nyretransplanterede modtagere (RTR'er) og fra raskenyrevæv, der støder op til renale klare cellekarcinomer, for at se, hvordan disse populationer sammenlignes med T-cellepopulationer i kredsløbet.Vi fandt det menneskenyrevæv indeholder betydelige mængder af CD4- og CD8-T-celler, der kun udtrykker CD69, CD69 og CD103, eller ingen af ​​disse markører. Vi fandt, at CD69-CD103- celler inyrevæv adskiller sig væsentligt fra T-celler i kredsløbet og kan repræsentere en TRM-population, der mangler de kanoniske TRM-markører. Desuden viser vi, at nyre-T-celler oftere cykler aktivt, vurderet ud fra øget ekspression af Ki-67, sammenlignet med blod. Vi fandt også, at CD8 og CD4 T-celler inyrevæv udtrykker næsten altid CXCR3 og udtrykker ofte CXCR6. Disse fund implicerer en rolle for disse kemokinreceptorer i tiltrækningen og vedligeholdelsen af ​​nyre-residente hukommelses-T-cellepopulationer.

2. Materialer og metoder

2.1. Patienter og prøverPrøver blev opnået fra Biobank Renal Diseases i Amsterdam UMC-lokationen AMC. I denne biobank kan patientprøver, såsom blod ognyrevæv, opsamles og opbevares fra sund livsstilnyredonorer og RTR'er, der følges før og efter nyretransplantation. Denne undersøgelse blev udført i overensstemmelse med principperne skitseret i erklæringerne fra Helsinki og Istanbul, og alle deltagere gav skriftligt informeret samtykke før tilmelding til biobanken. Derudover blev resterende væv fra patienter, der gennemgik tumornefrektomi (nyrevæv fjernt fra tumoren) doneret af Patologisk Afdeling og også opbevaret i Biobanken. Disse væv blev behandlet anonymt i henhold til Federation of Dutch Medical Scientific Societies' Code of Conduct (Human Tissue and Medical Research: Code of Conduct for Responsible Use, 2011 www.federa.org).

2.2. Perifere blodmononukleære celler (PBMC'er)Blodprøver blev taget fra cytomegalovirus (CMV)-seronegative sunde kontroller (levendenyredonorer før operationen, n= 13). Karakteristika for deltagerne i denne undersøgelse er vist i tabel 1. PBMC'er blev isoleret fra natriumheparinblod ved standarddensitetsgradientcentrifugering og efterfølgende kryokonserveret indtil analysedagen.

2.3. NyrevævSunde nyrevævsprøver (n {{0}}) blev opnået fra nyrer, der blev fjernet kirurgisk på grund af nyrecellekarcinom (fjernt ikke-tumorøst væv fra den kontralaterale pol af nyren) og transplanteret nyrevæv (n {{1 }}) blev opnået fra eksplanterede nyre-allotransplantater efter transplantationsfejl. Disse prøver omtales som henholdsvis sunde og transplanterede nyreprøver. Skiver af nyrebark blev skåret i 1- mm terninger med McElwain Tissue Chopper (Ted Pella, Redding, CA, USA), overført til 50 mL rør og vasket med kold PBS, indtil der ikke var blod. synligt til stede, og supernatanten var klar. Forvarmet (37 grader) fordøjelsesmedium blev tilsat, 40 ml pr. 10 g væv (DNAse Type IV (50 KU/mL) (Sigma Aldrich, Zwiindrecht, Holland), collagenase type IV (0,5 mg/ml) (Worthington Biochemical, Lakewood, NJ, USA), BSA (60 mg/ml) (Sigma Aldrich), 20 µl/ml føtalt kalveserum (FCS, VWR International BV, Amsterdam, Holland), TRIS (0,025 M) (Merck BV, Amsterdam, Holland), penicillin-streptomycin (Biochrom GMBH, Berlin, Tyskland) i HBSS (Westburg BV, Leusden, Holland)), og inkuberet i en shaker i 20 minutter ved 37 grader. Den varme suspension blev overført til et C-rør (Miltenvi, Bergisch Gladbach, Tyskland) og udsat for M_milten_04.01-programmet på GentleMacs (Miltenyi). Fordøjelsesmediet blev deaktiveret med kold PBS, og den resulterende cellesuspension blev passeret gennem en cellesil for at opnå en enkeltcellesuspension, som blev udsat for standarddensitetsgradientcentrifugering i henhold til producentens protokol (Lymphoprep, Abbott Diagnostics Technologies AS, Oslo, Norge ). De isolerede mononukleære celler (nyre MNC'er) varkryokonserveret indtil analysedagen i IMDM suppleret med 20 procent FCS, 000036 v/v procent -mercaptoethanol, 5 procent DMSO, penicillin og streptomycin.

2.4. FlowcytometriMålinger blev udført på et LSRFortessa flowcytometer (BD Biosciences). For hver prøve blev 2×106 PBMC'er eller 0,5×106 til 10×106 nyre-MNC'er analyseret. Volumenet af hver farvningsreaktion var i forhold til antallet af celler, og antistofkoncentrationerne forblev konstante. Celler blev inkuberet med overfladeantistofferne (Supplerende tabel S1) i 30 minutter ved 4 grader i mørke. Døde celler blev udelukket under anvendelse af det fikserbare levedygtighedsfarvestof eFluor455UV (eBioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonale antistoffer med intracellulære mål (Supplerende tabel S1) blev tilføjet efter fiksering og permeabilisering af cellerne ved hjælp af FoxP3/Transcription Factor Staining Set (eBioscience Inc.). Publicerede metoder til flowcytometri og cellesortering til immunologiske formål blev fulgt [8]. Gatestrategien, der bruges til den fænotypiske analyse, kan findes i Supplerende Figur S1. Vi har tidligere vist, at ingen af ​​de analyserede markører var påvirket af fordøjelsesmetoden, der blev brugt til at isolere nyre-MNC'er [7].

Begrænsninger af vævsprøver resulterede i udelukkelse af prøver fra gardinpaneler. CD3 plus celletal analyseret pr. prøve i sunde PBMC'er, sunde nyre MNC'er og TX nyrer kan findes i figur S3. MNCs Prøver blev kun analyseret, når de indeholdt over 50 procent levende celler i lymfocytten, som vurderet af levedygtighedsdve, og CD69/CD103-baserede T-celle-undersæt blev kun yderligere karakteriseret, hvis deres samlede celleantal oversteg 50.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE/NYRESVIGT

2.5. StimuleringsanalysePBMC og nyre MNC blev stimuleret som tidligere beskrevet [7,9]. PBMC'er og nyre-MNC'er blev optøet i nærværelse af DNAse I (200 KU/ml), vasket og fik lov til at komme sig natten over i ubehandlede, rundbundede 96-brøndsplader (Corning) i dyrkningsmedium (RPMI suppleret med 10 procent FCS og penicillin-streptomycin) ved en koncentration på 20 × 106/mL (100 μL/brønd).

Næste morgen blev phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA, 10 ng/ml; Sigma Aldrich) og ionomycin (1 ug/ml; Sigma Aldrich) tilsat for at stimulere cellerne. Medium alene blev tilsat som den negative kontrol. Alle inkubationer blev udført i dyrkningsmedium i nærværelse af CD28 (klon 15E8; 2 ug/ml), CD29 (klon TS 2/16; 1 ug/ml), brefeldin A (10 ug/ml, Invitrogen) og GolgiStop ( BD Biosciences) i et slutvolumen på 200 uL i 4 timer ved 37 grader og 5 procent CO2.

Efterfølgende blev cellerne inkuberet i 30 minutter med overfladeantistofferne (Supplerende tabel S2). Døde celler blev udelukket under anvendelse af fikserbart levedygtighedsfarvestof eFluor780 (bioscience Inc., Thermo Fisher Scientific, San Diego, CA, USA). Monoklonale antistoffer til intracellulær farvning (tabel S1) blev tilføjet efter fiksering og permeabilisering af cellerne ved hjælp af Cytofix/Cytoperm Reagent Set (BD Biosciences). Celler blev vasket to gange og analyseret på et LSRFortessa flowcytometer. Gatestrategien, der bruges i den funktionelle analyse, kan findes i Supplerende Figur S2. For at bestemme polyfunktionaliteten af ​​hver T-celle-undergruppe blev det gennemsnitlige antal funktioner i hver population beregnet ved hjælp af følgende formel:((procent af celler, der producerer 1 cytokin]*1) plus ([procentdel af celler, der producerer 2 cytokiner]*2) plus ([procentdel af celler, der producerer 3 cytokiner]*3) plus ([procentdel af celler, der producerer 4 cytokiner]*4) plus ([procentdel af celler, der producerer alle 5 cytokiner]*5))/100.

2.6.Dataanalyse

Data blev analyseret ved hjælp af FlowJo version 10 (FlowJo, Ashland, OR, USA). Alle grafer og figurer blev oprettet ved hjælp af Graphpad Prism version 8.00 til Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Samme program blev også brugt til de statistiske analyser af dataene. Den ikke-parametriske Mann-Whitney-U-test blev brugt til at bestemme betydningen af ​​uparrede prøver. For at sammenligne parrede prøver blev Wilcoxon signed-rank test brugt. p-værdier<0.05 were="" considered="" statistically="">

3. Resultater

3.1. Distinkt ekspression af CD8 og/eller CD4 og markører for vævsresidency af T-celler i sundt nyrevævFørst sammenlignede vi ekspressionen af ​​CD4 og CD8 af CD3-positive T-celler i perifert blod med celler påvist i sundt nyrevæv. CD4-CD8 plus (CD8) T-celler blev signifikant oftere påvist i nyrevæv end i blod ((median)25 procent vs. 38 procent )(Figur la). I modsætning hertil blev CD4*CD{{9} }(CD4)T-celler blev påvist i højere frekvenser i blod end i nyrevæv ((70 procent vs. 52 procent) Figur la). Samlet set blev CD4 T-celler set hyppigere i sundt nyrevæv end CD8 T-celler (figur 1b).

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​vævsresidensmarkørerne, CD69 og CD103, i CD8- og CD4-definerede T-celleundersæt. Som forventet blev CD69 og CD103 stort set ikke udtrykt af celler i perifert blod (figur 1c). I sundt væv blev CD69-CD103-, CD69 plus CD103-, CD69tCD103 plus og CD69-CD103 plus fænotyper udtrykt med 46 procent, 45 procent, 6,6 procent og 1,8 procent af CD8T-cellerne, 61 procent, 38 procent, 0,44 procent og 0,43 procent af CD4T-cellerne (figur lc). Som konklusion blev CD8, men især CD4 T-celler påvist i betydeligt antal i sundt humant nyrevæv. Ydermere blev ekspression af CD69 og CD103, markører for vævsresidens, detekteret primært blandt T-celler fundet i sundt væv og ikke i blod.

3.2.Forskellige udtryksmønstre af almindelige undergruppe-benævnende markører efter T-celle i sundhed/efter nyrevæv

CD45RA, en tyrosinphosphatase, CCR7, en kemokinreceptor, der er kendt for at mediere T-cellehandel til sekundære lymfoide organer, og CD28 og CD27, begge costimulerende receptorer, der er stærkt involveret i T-celleaktivering, er alle markører, der traditionelt bruges til at identificere funktionelle T-celleundergrupper J1{ {53}},1l. Vi ønskede at undersøge, i hvor høj grad fordelingen af ​​disse delmængder i blod adskiller sig fra fordelingen i nyrevæv. Som forventet var de største CD8 T-celle-undergrupper, der blev påvist i kredsløbet (dvs. dem, der vedrører mere end eller lig med 5 procent af den samlede befolkning) dem med en CD45RA plus CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (naive T-celler eller TN, ( median) 13 procent ), CD45RA-CCR7 plus CD28 plus CD27 plus (central-hukommelse T-celler eller TcM, 6 procent), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27 plus (TEv1,30 procent), CD45RA-CCR7-CD28 plus CD27-(Tau2,10 procent ), CD45RA-CCR7-CD28-CD27*(TEy3,6 procent) , CD45RA-CCR7-CD28-CD27-(TM4,6 procent )og CD45RA plus CCR7-CD28-CD27-(TEMRA ,10 procent )fænotype. I sundt væv blev næsten ingen (0,6 procent) CD8 T-celler påvist med en TN-fænotype, og kun få (0,8 procent) viste en Tax-fænotype. I modsætning hertil bestod CD8 T-celler påvist i sundt nyrevæv af betydelige TEv1-(22 procent),TEM2-(12 procent), Tpx3-(18 procent),TEx{ {65}} (23 procent) og TEyRA(11 procent) T-cellepopulationer (figur ld og figur S4). Når man ser på CD4 T-celler i blodet, var de største populationer dem, der udtrykte Ty-(35 procent), TcM-(25 procent), TEMl-(16 procent), TFM2-(9 procent) og en population med en ikke ellers specificeret CD45RAtCCR7-CD28 plus CD27* fænotype (0,4 procent) (Figur 1d og Figur S4). I sundt nyrevæv udtrykte få CD4 T-celler en TN- (3 procent) eller en TcM -(3 procent) fænotype. I stedet blev et betydeligt antal celler med en TEM1-(22 procent), TEM2-(40 procent) eller TEM4(14 procent)-fænotype påvist i sundt væv (figur ld og figur S4) . Som konklusion er fordelingen af ​​CD45RA/CCR7/CD28/CD{101}}definerede CD8- og CD4-T-celleundergrupper væsentligt forskellig mellem blod og sundt nyrevæv.

3.3. CD8 og CD4 T-celler i sundt menneskeligt nyrevæv omfatter oftere aktivt cyklende cellerDernæst undersøgte vi, om der er forskelle i ekspressionen af ​​markører, der er typiske for en cytotoksisk effektor-hukommelsesprofil, mellem CD8 og CD4 T-cellepopulationer i blod og nyrevæv. Først så vi på udtrykket af T-box-transskriptionsfaktorerne T-bet og eomeso-dermin(Eomes). Disse transkriptionelle regulatorer er direkte involveret i generering af akut fase effektorceller, inducering af ekspressionen af ​​molekyler som interferon-y og granzym B, og i genereringen af ​​sekundære hukommelsesresponser. Som forventet var ekspression af T-bet hyppigt blandt cirkulatoriske CD8 T-celler (54 procent), mens kredsløbs-CD4 T-celler sjældent udtrykte denne transkriptionsfaktor (13 procent). Interessant nok var T-bet-ekspression for CD4-T-celler signifikant højere blandt T-celler påvist i sundt nyrevæv end i kredsløbet (53 procent mod 13 procent). Noget ekspression blev også detekteret hyppigt blandt cirkulatoriske CD8 T-celler (59 procent), mens det igen var sjældent blandt cirkulatoriske CD4 T-celler (15 procent). Imidlertid var Eomes-ekspression hyppigere blandt CD4 T-celler i nyrevæv (32 procent) end i blod (figur 2a,b).

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​granzym B, en serinprotease, der er kendt for at mediere apoptose efter injektion i cytoplasmaet af cytotoksiske T-celler. I overensstemmelse med tidligere rapporter blev T-bet og granzym B-ekspression påvist i betydeligt antal i cirkulerende CD8 T-celler (28 procent). Dets ekspression var dog sjælden blandt cirkulerende CD4 T-celler (1 procent). For CD8 T-celler var granzym B-ekspression ens i nyrevæv og cirkulerende populationer (28 procent ys.23 procent) (figur 2c). Interessant nok svarede de højere T-bet og Eomes ekspressionsfrekvenser påvist i nyre CD4 T-celler ikke til en højere ekspressionsfrekvens af granzym B i dette rum (5 procent). Vi så derefter på ekspressionen af ​​KLRGl, en coinhibitorisk receptor, der vides at være overvejende udtrykt af cytotoksiske akutfase-effektorceller og effektor-hukommelsesceller. KLRG1 blev ofte udtrykt af cirkulerende CD8 T-celler (54 procent), men ikke af CD4 T-celler ( 10 procent). Der blev ikke fundet forskelle mellem anatomiske rum i KLRG1l-ekspression for CD8- eller CD4-T-celler. Til sidst undersøgte vi ekspressionen af ​​Ki-67, en markør, der angiver aktivt cyklende celler. I overensstemmelse med tidligere observationer var Ki-67-ekspression blandt cirkulerende CD8- og CD4-T-celler sjælden (henholdsvis 1 procent og 2 procent). Interessant nok, blandt CD8 T-celler, men især blandt CD4 T-celler, blev Ki-67-ekspression signifikant oftere påvist i T-celler i nyrevæv (henholdsvis 3 procent og 11 procent) (figur 2e). Som konklusion blev CD4 T-celler påvist i sundt humant nyrevæv, men ikke CD8 T-celler i dette rum, oftere udtrykt T-bet og Homes. Dette udmøntede sig imidlertid ikke i en hyppigere ekspression af granzym B af nyre CD4 T-celler. Desuden, selvom det samlede antal af cykliske celler var lavt, indeholdt nyrevæv signifikant mere aktivt cyklende CD8- og CD4-T-celler end kredsløbet.

3.4. CD8 og CD4 T-celler i sundt nyrevæv er næsten alle CXCR3-positionVi ledte derefter efter forskelle i ekspression af andre markører, typiske i cirkulerende populationer af ikke umiddelbart cytotoksiske hukommelsesceller, som vist tidligere for cirkulerende T-cellepopulationer. Vi så først på udtrykket af IL-7R, primært udtrykt på naive og tidligt differentierede hukommelsesceller i kredsløbet, hvor det er involveret i at opretholde homøostatisk proliferation [10,12,13]. I perifert blod blev IL-7Ra ofte udtrykt af CD8 T-celler (84 procent) og CD4 T-celler (98 procent). CD8- og CD4-T-celler i sundt nyrevæv udtrykte denne markør signifikant sjældnere end cirkulerende T-celler (henholdsvis 71 procent og 76 procent) (figur 2f).

Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​forskellige andre kemokinreceptorer. Interessant nok blev CXCR3, en kemokinreceptor involveret i Tcell-handel til betændt væv[14-17], udtrykt af et overordentlig stort antal CD8- og CD4-T-celler i nyrevæv (99) procent og 91 procent, henholdsvis), og væsentligt sjældnere ved cirkulerende T-celler (henholdsvis 58 procent og 26 procent) (figur 2g). Til sidst bestemte vi ekspressionen af ​​CXCR6, som vides at være impliceret i dannelsen af ​​TRM-populationer [18-22]. Mens CXCR6 kun blev udtrykt af en lille population af cirkulerende CD8 T-celler (16 procent), og stort set ikke af cirkulerende CD4 T-celler. en signifikant større andel af CD8- og CD4-T-celler i nyrevæv udtrykte dette molekyle (henholdsvis 40 procent og 40 procent) (figur 2h). Som konklusion blev markører, der typisk er forbundet med en ikke umiddelbart differentieret tilstand i kredsløbet, sandsynligvis-7Ra, CCR7, CD28 og CD27, signifikant sjældnere udtrykt af nyre-CD8- og T-celler sammenlignet med dem i blod. I modsætning hertil udtrykte nyre-T-celler oftere CXCR6 og udtrykte næsten altid CXCR3.

3.5. Forskellene i fænotype mellem sunde nyre- og allograft-T-celler er minimaleDernæst ønskede vi at undersøge, om disse fund blev stående i væv fra transplanterede nyre-allotransplantater, der blev opnået til forskellige kliniske indikationer (tabel 1).Med hensyn til antallet af CD8- og CD4-T-celler i sundt væv og allograftvæv blev der ikke set nogen forskelle (figur 3a). Imidlertid bemærkede vi en ikke-signifikant tendens mod flere CD4T-celler og færre CD8T-celler i sundt væv end i allotransplantatvæv (figur 3b). Når man ser på CD69/CD103expression og CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definerede undersæt, er der desuden ingen forskelle i distributionen af ​​CD69/CD103- eller CD45RA/CCR7/CD28/CD27- definerede undergrupper blev noteret, uanset CD8/CD4-fænotype (figur 3d og figur S5). Når vi undersøgte ekspressionsfrekvenser af markørerne mere typiske for cytotoksiske cirkulerende T-celler, fandt vi ingen forskelle i ekspression af T-bet, KLRG1 eller granzym B mellem sunde nyre- eller allotransplanterede T-celler (figur 3a, gh). Vi fandt, at Eomes-ekspression blev set mindre hyppigt i allograftvævs-CD4-T-celler end i sunde vævs-T-celler (figur 3f). Ingen forskelle i ekspressionen af ​​de andre markører blev observeret. (Figur 3-l og Figur S5b-d). Som konklusion, bortset fra en lavere ekspressionsfrekvens af Eomer blandt allotransplanterede CD4 T-celler, var cellepopulationer ikke forskellige mellem undersøgelsespopulationer.

3.6. CD69-CD103-T-celler i nyrevæv er forskellige fra cirkulerende cellerI betragtning af den lignende fænotypiske sammensætning af CD8- og CD4-T-celler fundet i sundt nyrevæv og i nyre-allograftvæv, samlede vi data fra begge undersøgelsesgrupper for yderligere at undersøge karakteristika for disse celler i henhold til CD69- og CD103-ekspression. Da CD69-CD103 plus-celler altid blev detekteret i meget lave frekvenser(<50 events),="" we="" excluded="" these="" cells="" from="" further="" analyses.="">Først undersøgte vi forskelle i disse undergrupper i henhold til CD69/CD103 co-ekspression i nyre-T-cellepopulationer (figur 4 og figur S6). Det er interessant, at der for både CD8- og CD4-T-celler blev bemærket væsentlige forskelle i fordelingen af ​​CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definerede undergrupper blandt CD69-CD103-, CD69 plus CD{ {14}}og CD69*CD103* undersæt. For CD8 T-celler indeholdt CD69-CD103-celler en betydelig population af TeyRA-celler (21 procent ), som var meget mindre blandt CD69 plus CD103- og CD69 plus CD103 undergrupperne (5,8) procent og 2,2 procent). I stedet indeholdt disse sidstnævnte populationer meget større TEy3 (henholdsvis 13 procent, 30 procent og 32 procent) og TEy4 (henholdsvis 8 procent, 19 procent og 33 procent) subpopulationer. For CD4 T-celler blev der set få TEyRA-celler blandt CD69-CD103-, CD69*CD103- og CD69 plus CD103* undergrupper (2,6 procent ,0 procent og 1,7 procent, henholdsvis). I stedet rummede disse celler store underpopulationer af TFw1 (henholdsvis 26 procent, 24 procent og 10 procent) og TEy2-celler (henholdsvis 30 procent, 46 procent og 27 procent). Blandt CD69 plus CD103-og især blandt CD69*CD103*-cellerne sås en meget større TEM4-subpopulation (henholdsvis 6 procent, 11 procent og 34 procent).

I betragtning af disse forskelle og den tidligere observation af, at nyre-T-cellepopulationer næppe omfattede TN- og TcM-celler, undersøgte vi yderligere CD69-CD103--cellerne fundet i nyrevæv for at bestemme, i hvilket omfang disse celler var ikke kun cirkulerende celler, der passerer gennem nyrekredsløbet. For at gøre det sammenlignede vi disse celler med cirkulerende celler. CD69-CD103~celler i nyrevæv afveg signifikant fra dem i kredsløbet: T-bet, Ki-67 og CXCR3 blev udtrykt oftere af nyre-T-celler, uanset CD8/CD4-fænotype (figur 5a-c). I modsætning hertil blev IL-7R, CCR7, CD28 og CD27 alle udtrykt signifikant sjældnere af CD69-CD103- nyre-T-celler, uanset CD8/CD4-fænotype (figur 5d- g). CD69-CD103-CD4 T-celler i nyrevæv udtrykte KLRG1 signifikant oftere end i blod og CD69-CD103-CD8 T-celler i nyrevæv udtrykte Eomer signifikant oftere end i blod.

Dernæst ønskede vi at se, hvordan CD69 og CD103 co-ekspression påvirkede markører for funktionelt potentiale. Først så vi på markører forbundet med cytotoksisk potentiale. Selvom der blev bemærket forskelle mellem individuelle subpopulationer, blev der ikke set nogen konsekvente mønstre for T-bet og Eomer i CD8 T-celler, når CD69 eller CD103 blev co-udtrykt (figur 6a,b). I modsætning hertil steg disse transkriptionsfaktorer i CD4 T-celler begge sammen med CD69 og CD103 coekspression (figur 6a,b). Når vi så på KLRG1, bemærkede vi, at for CD8 T-celler faldt KLRG1-ekspression sammen med CD69/CD103-samekspression. For CD4 T-celler sås en lignende tendens. Men her udtrykte kun CD69-CD103-celler KLRG1 ved en højere frekvens end CD69 plus CD103- og CD69 plus CD103* celler (figur 6c). Ekspressionsfrekvenser for granzym B faldt også sammen med markører for vævsresidens, hvor dets ekspressionsfrekvens var lavest blandt CD69 plus CD103*-celler i både CD8- og CD4-T-celler (figur 6d). Ekspression af Ki-67, som var højere blandt nyre-T-celler sammenlignet med T-celler i blodet, afveg ikke i henhold til CD69- eller CD103-samekspression (figur 6e).

Vi undersøgte derefter markører, der normalt er forbundet med en ikke-cytotoksisk hukommelsesprofil ifølge CD69/CD103-samekspression. Ekspression af IL-7Ra, CCR7 og CD28 var højest inden for CD69-CD103--populationerne, med en tendens til at definere udtryk sammen med co-ekspression af CD69/CD103 (figur 6f-h) ). Vi så derefter på udtrykket af CXCR3 og CXCR6. Begge kemokinreceptorer blev oftest udtrykt af CD69tCD103t-celler, uanset CD8/CD4-fænotype, og viste en opadgående tendens med co-ekspression af CD69/CD103. Kun for CXCR6 var denne tendens statistisk signifikant og påvirkede både CD8 og CD4 Tells (figur 6j,k). Som konklusion er CD69-CD103--celler i nyrevæv væsentligt forskellige fra celler i kredsløbet og kan vedrøre en anden TBv-population, der ikke er mærket af CD69- eller CD103-ekspression. Den eneste markør, der adskilte sig konsekvent, uanset CD8/CD4 fænotype, med hensyn til CD69 og CD103 coekspression, var CXCR6.

3.7.T-celler i nyrevæv producerer oftere interferon- end T-celler i blodTil sidst undersøgte vi cytokinproduktionskapacitet ved CD8/CD4-definerede T-cellepopulationer i nyrevæv. Først sammenlignede vi produktionen af ​​interferon-y (IFNy), tumornekrosefaktor (TNF ), interleukin-2 (IL-2), granulocyt-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) og IL-17 af stimulerede CD8/CD4-definerede T-cellepopulationer fundet i blod til dem i sundt nyrevæv (figur 7a-e). Interessant nok blev kun IFNy konsekvent udtrykt af en større andel af T-celler i sundt nyrevæv sammenlignet med T-celler i blodet, uanset CD8/CD4-fænotype (figur 7a). Der blev også bemærket forskelle på et individuelt undersætniveau. Specifikt blev TNF og GM-CSF hyppigere produceret af CD4 T-celler i nyrevæv (figur 7b.c). Med hensyn til polyfunktionalitet (dvs. antallet af samtidigt producerede cytokiner) viste CD4 T-celler i nyrevæv sig at være mere polyfunktionelle end CD4-celler i blodet (figur 7f).

Dernæst så vi på forskelle i cytokinproduktionskapacitet mellem stimulerede T-celler fra sundt og allograftvæv. Ingen forskelle i produktionen af ​​individuelle cytokiner eller i et antal samtidigt producerede cytokiner blev påvist mellem T-celler fra sundt eller allograft nyrevæv (figur S7). Da CD69 udtrykkes ved stimulering af T-celler, undersøgte vi kun forskellen mellem CD103-negative og CD103-udtrykkende CD4- og CD8-T-celler (figur 7g-). Ved sammenligning af CD4- og CD8-T-celler, der udtrykker CD103, med celler, der ikke udtrykker CD103 i nyrevæv, bemærkede vi, at CD8- og CD4-CD103-celler udtrykte mere IFNy end CD103--celler (figur 7g). Derudover, selvom IL-1ZA-producerende celler var lave blandt CD103 plus CD8 og CD4 T-celler i nyrevæv, blev de konsekvent fundet hyppigere i denne population sammenlignet med CD103--populationen. Som konklusion producerede flere T'-celler i nyrevæv IFNy sammenlignet med cirkulerende T-celler, uanset CD8/CD4-fænotype. Faktisk blev den højeste procentdel af IFNy-producerende celler fundet blandt de CD103-, der udtrykker CD4- og CD8-nyre-afledte T-celler. Derudover adskilte T-celler i nyre-allotransplantater sig ikke fra dem i sundt nyrevæv med hensyn til disse parametre.

4. Diskussion

I den aktuelle undersøgelse behandlede vi mangfoldigheden af ​​T-celle-undergrupper, i henhold til ekspressionen af ​​CD8 og CD4, og markørerne for vævsresidens, CD69 og CD103, i humane nyrer og sammenlignet med disse med blod. Væsentlige antal CD8- og CD4-T-celler blev faktisk påvist i nyrevæv. Desuden indeholdt disse T-celler i nyrerne et betydeligt antal CD69*CD103-celler. CD69 plus CD103 plus celler blev også påvist, men overvejende blandt CD8 T-cellerne og var praktisk talt ikke-eksisterende blandt CD4 T-celler. Et lignende fund vedrørte lunge-TRM tidligere [23]. Som forventet var sådanne CD69- og CD-{15}}udtrykkende populationer i stedet næsten fraværende i cirkulationen. En slående forskel, når man sammenlignede T-celler i nyrerne med celler i blod, vedrørte en distinkt fordeling af de traditionelle CD45RA/CCR7/CD28/CD27-definerede undergrupper. Interessant nok blev ekspressionen af ​​CD28 oftere ikke udtrykt, når T-celler co-udtrykte CD69 alene eller i kombination med CD103. Teoretisk set burde dette gøre disse populationer mindre modtagelige for costimulerende signaler fra CD80 og CD86. Andre forskelle vedrørte en højere ekspressionsfrekvens af CXCR3, CXCR6 og Ki-67. Derudover indeholdt nyre-T-celler oftere IFNy-producerende celler og var ofte polyfunktionelle. Faktisk indeholdt CD103 plus Tpys i nyrerne flere IFN-producerende celler end deres CD103-negative modstykker. Derudover producerede CD103T-celler oftere IL-17, selvom dette vedrørte en beskeden befolkning.

CISTANCHE VIL FORBEDRE NYRE-/NYREINFEKTION

Med hensyn til den hyppigere ekspression af CXCR3 af CD8- og CD4-nyre-T-celler, blev CXCR3/CXCL10-aksen tidligere vist at være involveret i udformningen af ​​TpM-populationer i hud, lever og lymfoidt væv [24-28]. Derudover er det involveret i handel med stresset epitel og betændelse i generel forstand [14-17]. I betragtning af de høje frekvenser af CXCR3 blandt disse T-celler i sundt nyrevæv, ser CXCR3 ud til også at være impliceret i TRM-homeostase i nyrevæv og involverer muligvis ikke nødvendigvis inflammation eller faresignaler for at gøre det. Med hensyn til CXCR6 har CXCR6/CXCL16-aksen faktisk allerede vist sig at være essentiel for handel med Tpst til forskellige rum som lunger, hud, lever og hjerne, og kan vedrøre en universel mekanisme, der er essentiel for at styre og fastholde TRM til og i væv, også vedrørende TRM i humant nyrevæv [18-22].

Farber og kolleger har i vid udstrækning karakteriseret og sammenlignet CD8- og CD4 TRM-populationer, der er bosat i forskellige humane vævstyper afledt af organdonorer. De beskrev, hvordan TRM-populationer i lunger, milt, tyndtarm og forskellige sekundære lymfoide væv adskiller sig med hensyn til transkriptomet, men også til ekspressionen af ​​forskellige proteiner, herunder cytokiner, undersøgt i den aktuelle undersøgelse [29-31. Disse undersøgelser omfattede dog ikke TRM-populationer i den humane nyre og data herom

emnet er knapt. Vi har tidligere vist, at CD8 T-celler rettet mod polyomavirus BK VP1- og LTAG-proteiner, der stammer fra en virus, der har en stærk tropisme for nyreepitelceller, kan påvises i allotransplanterede nyrer. Disse virus-specifikke T-celler udtrykte CD69 og CD103 i højere antal end deres modstykker fundet i kredsløbet af de samme patienter. Desuden udtrykte disse T-celler generelt en CD45RA-CD27-granzyme B-negativ fænotype[5]. Senere har andre også rapporteret om TRM-populationer i humant nyrevæv opnået fra transplanterede nefrektomier. I denne publikation rapporterer forfatterne, at T-celler i disse væv hovedsageligt vedrørte CD8 T-celler [321. Vi fandt i stedet ud af, at CD4 T-celler faktisk omfattede den største T-celleundergruppe. Vi fandt dog også, at balancen skiftede, men ikke signifikant, mod et større antal CD8 T-celler i allograftvæv sammenlignet med sundt nyrevæv. Som sådan kan denne uoverensstemmelse forklares af en anden undersøgelsesgruppe, og det kan være, at det immunologiske forsvar i sundhed er mere fokuseret på ekstracellulære trusler, som bakterier, versus mere intracellulære trusler, som vira og kræft hos de immunkompromitterede værter. Vi fandt ikke andre forskelle i de undersøgte markører mellem sunde nyre og allotransplanterede T-celler. Imidlertid bør yderligere forskning, ved hjælp af teknikker med et bredere syn på transkriptomer, såsom RNA-sekventering eller proteom, såsom massespektrometri, anvendes for at fastslå, om dette faktisk er tilfældet.

Derudover har de Leur et al. beskrive, hvordan TRM i nyrerne ofte udtrykte granzym B, mens vi kun påviste lave mængder af granzym B i både sundt og allotransplanteret nyrevæv [32]. Vi påviste imidlertid betydelige T-bet og Eomes-udtrykkende T-celler i nyrevæv, som i cirkulerende T-cellepopulationer normalt faktisk er forbundet med en højere ekspression af granzym B [10]. Selvom sidstnævnte måske ikke er overraskende, givet det faktum, at granzym B-ekspression også er direkte induceret af T-bet [33,34], var denne sammenhæng ikke tydelig blandt nyre-T-celler i den aktuelle undersøgelse. Som vi og andre har vist, at også human lunge-, hjerne- og hudafledt TRM [25,26,3536], såvel som nyre-afledt vævsresident MAIT ælls 【6,7】 har lavt indhold af deres granzym B indhold, mens det ofte udtrykker betydelige mængder af T-bet og Eomes, kan dette være et fælles træk ved (menneskelig) TkM. Ydermere sås granzym B-ekspression i lunge-TRM at blive hurtigt opreguleret ved stimulering [35l, hvilket tyder på, at dette også kan forekomme i andre TeM. Her antog forfatterne, at en sådan 'skjult cytotoksicitet tjener til at beskytte den strukturelle integritet af væv mod beskadigelse af cytotoksiske T-celler.

Som konklusion viser vi, at Tcl'er i nyrevæv er til stede i et betydeligt antal og omfatter populationer, der ofte udtrykker CD69 plus og CD103 plus, molekyler, hvormed T-celler adhærerer til og persisterer i væv. Ikke desto mindre ser CD69-CD103- T-cellerne i nyrevæv ud til at adskille sig fra cirkulerende T-celler og kan vedrøre en anden distinkt TiM-population, muligvis persisterende i nyrerne af andre mekanismer, der skal afsløres. En anden mulighed kan være, at disse CD69-CD103-T-celler vedrører en population, som først for nylig er kommet ud af kredsløbet, og hø kun forbigående har erhvervet nye fænotypiske egenskaber på grund af en interaktion med nyrernes mikromiljø. Yderligere undersøgelser af denne population er nødvendige for at belyse disse muligheder. Desuden. CD8- og CD4-nyre-T-celler cyklede ofte aktivt og udtrykte oftere CXCR6. Derudover fortrængte CD8- og CD4-populationer en særlig høj ekspression af CXCR3, hvilket kraftigt implicerede disse kemokinreceptorer såvel som CXCR6 i TRM-tilvækst og persistens i humane nyrer. Derfor er der behov for yderligere undersøgelser for at forbedre vores billede af Tpv-populationer i den menneskelige nyre. Ikke desto mindre udgør de her præsenterede resultater et solidt første skridt mod en mere detaljeret karakterisering af T-cellepopulationer i nyrevæv og deres rolle i sundhed og sygdom.