CaWRKY30 regulerer positivt peberimmunitet ved at målrette CaWRKY40 mod Ralstonia Solanacearum-podning gennem modulerende forsvarsrelaterede gener, del 1

Abstrakt:

WRKY transkriptionsfaktorer (TF'er) netværket er sammensat af WRKY TF'ernes undergruppe, som spiller en kritisk rolle i immunitetsreguleringen af ​​planter. Funktionerne af WRKY TFs' netværk forbliver dog uklare, især i ikke-modelplanter såsom peber (Capsicum annum L.). Denne undersøgelse karakteriserede funktionelt CaWRKY30 - et medlem af gruppe III Pepper WRKY-protein - for pebers immunitet mod Ralstonia solanacearum-infektion. CaWRKY30 blev påvist i kernen, og dets transkriptionelle ekspressionsniveauer blev signifikant opreguleret af R. solanacearum-podning (RSI), bladpåføringsethylen (ET), abscisinsyre (ABA) og salicylsyre (SA). Virusinduceret gendæmpning (VIGS) af CaWRKY30 forstærkede peberens sårbarhed over for RSI.

Derudover kompromitterede dæmpningen af ​​CaWRKY30 af VIGS HR-lignende celledød udløst af RSI og nedregulerede forsvarsassocierede markørgener, såsom CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1, CaHIR1 og CaWRKY40. Omvendt, forbigående overekspression af CaWRKY30 i peberblade anstiftede HR-lignende celledød og opregulerede forsvarsrelaterede markørgener. Endvidere opregulerede forbigående overekspression af CaWRKY30 transkriptionelle niveauer af CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 og CaWRKY40.

På den anden side opregulerede forbigående overekspression af CaWRKY6, CaWRKY22, CaWRKY27 og CaWRKY40 transkriptionelle ekspressionsniveauer af CaWRKY30. Resultaterne anbefaler, at nyligt karakteriseret CaWRKY30 positivt regulerer pebers immunitet mod Ralstonia-angreb, som styres af synergistisk medieret signalering af phytohormoner som ET, ABA og SA, og transskriptionelt assimileres i WRKY TFs-netværk, bestående af CaWRKY6, CaWRKY24, CaWRKY27, CaWRKY27, CaWRKY27, CaWRKY27, CaWRKY27, CaWRKY27, CaWRKY27, CaWRKY27 og SA. . Samlet set vil vores data gøre det lettere at forklare den underliggende mekanisme for krydstale mellem pebers immunitet og respons på RSI.

Transkriptionsfaktorer spiller en nøglerolle i immunsystemet, der kontrollerer reguleringen af ​​genekspression og dannelsen af ​​specifikke celletyper. Følgende er forholdet mellem transkriptionsfaktorer og immunitet:

1. Transkriptionsfaktor - NF-KB: NF-KB er en nøgletransskriptionsfaktor involveret i reguleringen af ​​adaptive immunresponser af T-celler og B-celler. NF-KB-aktivering kan fremme inflammatorisk respons, immunrespons og celleapoptose.

2. Transkriptionsfaktorer - STAT'er: STAT'er er transkriptionsfaktorer, der medierer bærersignalering og cellulære responser. STAT'er kan aktiveres, spille en nøglerolle i aktiverede T-celler og B-celler og deltage i processer som immuncelleproliferation, differentiering og aktivering.

3. Transkriptionsfaktor - AP-1: AP-1 er en familie af transkriptionsfaktorer, der er involveret i reguleringen af ​​forskellige cellulære funktioner og immunresponser. AP-1-aktivering kan fremme processer såsom celleproliferation, differentiering og transformation, samt opretholde antivirale og immunresponser.

4. Transkriptionsfaktorer - CEBP'er: CEBP'er er en stor familie af transkriptionsfaktorer, herunder CEBP , , , osv. i forskellige vævsceller. I immunsystemet er CEBP involveret i aktivering af makrofager og frigivelse af cytokiner, samt differentiering og aktivering af B-celler og T-celler.

Tilsammen spiller transkriptionsfaktorer en vigtig rolle i immunitet, idet de deltager i reguleringen og vedligeholdelsen af ​​immunsystemets aktivitet i forskellige celletyper og funktioner. Derfor skal vi også være opmærksomme på forbedringen af ​​immunitet i vores daglige liv. Cistanche kan øge immuniteten, og polysacchariderne i kød kan regulere immunreaktionen af ​​det menneskelige immunsystem, forbedre immuncellernes stressevne og forbedre virkningen af ​​sterilisering af immunceller.

Klik på sundhedsmæssige fordele ved cistanche

Nøgleord:

chilipeber (Capsicum annuum); Ralstonia solanacearum; CaWRKY30; WRKY TF'er.

1. Introduktion

Planter bliver ofte udsat for forskellige biotiske og abiotiske belastninger i løbet af deres levetid på grund af deres immobile natur [1,2]. Planter har udviklet adskillige forsvarsmekanismer som reaktion på gentagne selektionspres fra store økologiske og miljømæssige begrænsninger. Forskellige transkriptionelle faktorer (TF'er) forbinder hinanden for at udvikle sofistikerede transkriptionelle netværk til regulering af disse klassiske forsvarsmekanismer på et transkriptionelt niveau [3,4]. Forsvarsreaktioner på forskellige belastninger er korrekt synkroniseret og kontrolleret, da de er kritiske for planter i form af energiforbrug og udvikling [5]. Forsvarsmekanismerne kan variere i forskellige plantearter på grund af forskellige miljøforhold, der påvirker deres akklimatisering [6-8].

Derfor kan det forsvarssystem, der anvendes af modelanlæg, ikke fuldt ud impliceres til ikke-modelanlæg. Derfor har planters forsvarssystemer været et hovedfokus i de seneste årtier; disse undersøgelser var dog mest fokuseret på modelplanter, dvs. Arabidopsis thaliana og ris (Oryza sativa L.). Ikke desto mindre er den funktionelle synkronisering af disse transkriptionelle komplekser for at regulere planters reaktion på forskellige belastninger blevet dårligt undersøgt, hovedsageligt i ikke-modelplanter.

WRKY-proteinerne udgør den største TF-familie i planter. WRKY TF'erne indeholder et eller to WRKY-domæner og almindeligvis WRKYGQK-sekvens ved N-terminalen efterfulgt af C2HC- eller C2H2-zinkfingermotiv [4,9,10]. WRKY-proteinerne er fylogenetisk opdelt i tre hovedgrupper (dvs. grupper I-III) baseret på flere WRKY-domæner og strukturen af ​​zink-finger-motivet.

Gruppe II af WRKY TF'er er igen underopdelt i fem undergrupper (IIa, IIb, IIc, IId og IIe) [11-13]. WRKY-medlemmerne binder hovedsageligt med W-bokse [TTGAC(C/T)] fundet i promotorregioner af forskellige målgener ved at indsætte en eksklusiv kile lodret i DNA's hovedrille [14] af WRKY GQK-motiv på den anden b-streng, som stimulerer transkriptionel modulering af ekspressionen af ​​målgener [14-16]. WRKY'erne har været involveret i flere biologiske systemer i planter, herunder frøhvile, frøspiring, alderdom og frøudvikling. Tilsvarende er disse også involveret i respons på biotiske og abiotiske stress og skiftende transkription af deres målgener [17-20].

Det er rapporteret, at en gruppe af WRKY TF'er eller en WRKY TF transkriptionelt induceret af kun én stress modulerer flere belastninger. W-kasserne er beriget inde i promotorregioner [21-24]. Disse undersøgelser viser tilstedeværelsen af ​​WRKY-netværk, der er impliceret som reaktion på en bestemt stress eller en kombination af to eller flere. Rollen af ​​WRKY-proteiner og underliggende mekanismer som reaktion på biotiske og abiotiske belastninger er ofte blevet undersøgt i det sidste årti; dog var vægten af ​​disse undersøgelser primært på ét gen som reaktion på én stress i modelplanter, f.eks. A. thaliana og O. sativa. For nylig er en vigtig funktionel varians blandt tætte homologer af WRKY TF'er fra forskellige plantearter blevet foreslået [24,25]. Funktionerne af WRKY'er og WRKY-web i ikke-modelanlæg såsom Capsicum annuum L., som svar på enkelte eller kombinerede spændinger, er blevet dårligt undersøgt indtil nu.

Peber er globalt kendt for sin økonomiske betydning. Den sås i højlandet i tempererede årstider [26,27]. Peber er udsat for forskellige jordbårne sygdomme såsom peberskimmel og bakteriel visnesygdom forårsaget af bakterielle patogener, dvs. henholdsvis Phytophthora capsicum og Ralstonia solanacearum [28,29]. Sammenfaldet af disse patogener giver ødelæggende virkninger på peberproduktion under høje temperaturer og høj luftfugtighed (HTHH). HTHH svækker pebers immunitet medieret af R-proteinet og fremskynder patogenvækst og udvikling. Desuden udøver patogenangreb og HTHH samtidig naturligt selektionstryk på peber, hvilket har påvirket pebers udvikling i fortiden [30-32]. Omvendt kan den samtidige forekomst af patogeninfektion og HTHH muligvis ikke påvirke udviklingen af ​​modelplanter, såsom A. thaliana og O. sativa. Derfor synes peber mere passende til forskning vedrørende immunitet mod biotiske eller abiotiske belastninger, dvs. RSI eller HTHH.

Ralstonia solanacearum forårsager bakteriel visne i adskillige afgrøder, dvs. peber, tomat, kartoffel osv. Det er en jordbåren gram-negativ -proteobakterie [33]. Det danner hurtige kolonier i xylemvævet, hvilket fører til bakteriel visnesygdom i de angrebne planter [34].

Plantearters reaktioner på biotisk og abiotisk stress er kendt for at være reguleret af fytohormoner [35]. Fytohormoner er bittesmå molekyler involveret i plantevækstregulering, planternes reproduktion og overlevelse. Salicylsyre (SA) og jasmonsyre (JA) er kritiske for plantearters immunrespons. Disse to betragtes som kritiske grundlag for planters immunrespons mod patogener. Biosyntese og signalering af SA er afgørende for forsvar mod biotrofiske patogener, mens JA giver forsvar mod nekrotrofiske patogener [36,37]. Ethylen (ET) hjælper med forsvarsreaktioner mod flere plante-patogen-interaktioner [37].

Forskellige indfødte peberkultivarer i subtropiske områder viser accelereret sygdomsresistens, selv under HTHH [38]. Varmerelateret cis-element HSE eksisterer generelt sammen med phytohormoner, herunder SA, JA, ET, ABA eller patogen-relaterede cis-elementer i promotorregioner af de fleste MAPK'er og CDPK'er involveret i planteimmunitet [39-41]. Det anbefaler tilstedeværelsen af ​​krydstale mellem immunitet og HTHH. Pebergenomet er 27 og 7,5 gange større sammenlignet med henholdsvis A. thaliana og O. sativa. Det har dog kun 73 WRKY-gener, hvorimod mindre genomer af A. thaliana og O. sativa har henholdsvis 72 og 122 WRKY-gener [9,42,43]. Vi har tidligere opdaget, at CaWRKY6 [44], CaWRKY22 [9], CaWRKY40 [45] og CaWRKY58 [46] har været involveret i pebers reaktion mod RSI.

Blandt disse fungerer CaWRKY6, -22, -27 og -40 som positive regulatorer af planteimmunitet, hvorimod CaWRKY58 er en negativ regulator. Disse gener har en undergruppe af HSE-elementer og W-bokse i deres promotorregion og promotorerne af andre WRKY TF'er, hvilket udleder WRKY-netværks rolle i reguleringen af ​​pebers respons mod RSI. Derudover blev CaWRKY40 direkte reguleret af CaWRKY6 [44] og CabZIP63 [16], mens CaWRKY40 blev indirekte reguleret af CaCDPK15 [47]. Omvendt er de fleste af peberens WRKY TF'er endnu ikke blevet karakteriseret for deres reaktion på patogenangreb.

I den nuværende undersøgelse blev et cDNA i fuld længde for WRKY TFs-familien af ​​peber isoleret og kaldt CaWRKY30. Vi karakteriserede det udtryksmæssigt og funktionelt og fandt ud af, at CaWRKY30 blev induceret af RSI og bladpåføring af SA, JA, ET og ABA. Forbigående overekspression af CaWRKY30 i peberblade udløste HR-lignende celledød og H2O2-produktion. Silencing af CaWRKY30 i peber kompromitterede pebers immunitet over for RSI. Disse resultater tyder på, at CaWRKY30 positivt regulerer pebers immunitet over for RSI.

2. Resultater

2.1. Kloning og sekvensanalyse af CaWRKY30

Et nyt WRKY-gen CaWRKY30 (CA01g34480) blev identificeret ved genom-dækkende analyse. CaWRKY30-genet blev valgt til funktionel karakterisering, da eksistensen af ​​immunitetsrelaterede cis-elementer såsom TGA (TGACG-motiv-bindende faktor), TGACG-motiv, TATC-box, TATAbox og W-box i promotorregionen angiver dets mulige rolle i pebers immunitet (figur S1). Et cDNA-fragment af CaWRKY30 (CA01g34480) af 924 bp åben læseramme (ORF) blev klonet ved anvendelse af genspecifikke primere (tabel S1). Længden af ​​den udledte aminosyresekvens af CaWRKY30 var 307 aminosyrerester, som besad det konserverede WRKY-domæne, og den blev kategoriseret i gruppe III (figur 1). Det forudsagte protein har en størrelse og teoretisk pI på henholdsvis 34,55 kDa og 7,32. CaWRKY30 deler 88, 60, 68 og 57 procent aminosyreidentitet med henholdsvis NsWRKY53, CcWRKY53, NaWRKY53 og StWRKY53 (figur S2).

2.2. Transkriptionel ekspression af CaWRKY30 under RSI og behandling med forskellige fytohormoner

Tilstedeværelsen af ​​immunitetsassocierede cis-elementer i promotorregionen af ​​CaWRKY30 indikerede dets potentielle rolle i pebers immunitets-RSI. For at kontrollere begrebet blev qRT-PCR-analyse udført for at vurdere de transkriptionelle niveauer af CaWRY30 efter RSI. Transkriptionsniveauerne af CaWRKY30 blev øget i Ralstonia-behandlede blade sammenlignet med mock-behandlede blade (figur 2A). De forbedrede CaWRKY30 transkriptionelle ekspressionsniveauer var konsistente mellem 0 timer til 48 timer efter behandling (HPT). De højeste transkriptionelle ekspressionsniveauer blev registreret ved 48 hpt (figur 2A).

Fytohormoner, herunder ET, ABA, SA og JA-medierede signalveje, er nøgleregulatorer for planters reaktioner på biotiske og abiotiske belastninger. Reguleringen af ​​CaWRKY30 af fytohormonmedierede signalveje blev undersøgt ved bladapplikation af ET, ABA, SA og JA ved hjælp af qRT-PCR-analyse. Resultaterne indikerede, at relative transkriptionelle ekspressionsniveauer af CaWRKY30 blev forstærket fra 0 timer til 48 hpt med 100 µM ET sammenlignet med mock. Disse transkriptionelle niveauer var højest ved 48 hpt med ET (figur 2B). Bladpåføring af 100 µM ABA øgede signifikant transkriptionelle niveauer af CaWRKY30 sammenlignet med mock. Transkriptionelle niveauer nåede det højeste niveau ved 12 hpt med ABA (figur 2C). Resultater indikerede, at transkriptionel akkumulering af CaWRKY30 var signifikant øget efter påføring af 1 mM SA sammenlignet med mock. Disse forbedrede transkriptionelle ekspressionsniveauer var højest ved 24 hpt (figur 2D).

Figur 2. qRT-PCR assayet af CaWRKY30 relative transkriptionelle ekspressionsniveauer i peberblade udsat for Ralstonia solanacearum podning (RSI) og bladpåføring af forskellige phytohormoner. qRT-PCR-analysen blev brugt til at kontrollere transkriptionsniveauerne af CaWRKY30 i peberblade, der blev udsat for forskellige behandlinger, herunder RSI (A), påføring af 100 µm ET (B), påføring af 100 µm ABA (C) og påføring af 1 mM SA (D) ved forskellige tidsintervaller. Den transkriptionelle overflod i RSI-behandlede blade blev sammenlignet med MgCl2 --behandlede kontrolblade (mock), hvis relative ekspressionsniveau blev sat til "1". (B-D) De transskriptionelle ekspressionsniveauer i fytohormonbehandlede blade blev sammenlignet med ddH2O-behandlede blade (mock), hvis ekspressionsniveau blev sat til "1". Højden af ​​bjælken angiver middelværdier og fejlbjælker angiver standardfejlen for middelværdier. Forskellige bogstaver over søjlerne viser en signifikant forskel mellem middelværdierne baseret på Fishers beskyttede LSD-test.

2.3. CaWRKY30 blev fundet at være lokaliseret i kernen

Sekvensanalyse ved brug af WoLFPSORT viste, at den forudsagte CaWRKY30-proteinsekvens besidder et formodet nuklear lokaliseringssignal (figur 1), der viser dets potentielle målretning i kernen. For at validere denne opfattelse blev en aCaWRKY30 GFP-fusionskonstruktion genereret, der blev drevet af en konstitutiv promotor af CaMV35S. Bagefter blev denne konstituerede vektor overført til Agrobacterium stamme GV3101. Vi har forbigående overudtrykt CaWRKY30 GFP-konstruktionen i blade af Nicofiamabenthamiana ved A. tumefacient-injektion, og GFP-signaler blev undersøgt med konfokale fluores.science-mikroskop. Resultaterne viste, at GFP-signaler af CaWRKY30-GFP var til stede i kernerne, mens GFP af kontrol blev påvist i forskellige subcellulære dele, såsom cytoplasma og kerner (figur 3).

Figur 3. Subcellulær lokalisering af CaWRKY30. CaWRKY30 er fuldt placeret i kernen af ​​nicotiana benthaminna blade. Den grønne farve demonstrerer GFP Blå farve demonstrerer DAPI-farvning af kernen. Den cyanfarve demonstrerer fusionen af ​​grøn CFP og blå DAPI-farvede kerner. CPP signaGreen) for kontrollen blev N. benthamiana-blade påvist over hele cellen. billeder blev fanget ved konfokal mikroskopi 48 timer efter inokulering. Barer=25 um.

2.4. Silencing of CaWRKY30 by VIGS Curtailed Pepper's Immunity to RSI and Downregulated Immunity Associated Marker Geners.

CaWRKY30 blev dæmpet af virus-induceret gen-silencing (VIGS) for at studere dens rolle i peberimmunitet. Der blev anskaffet i alt 50 CaWRKY30-u-dæmpede (TRV:00) og 50 CaWRKY30--dæmpede (TRV: CaWRKY30) planter. Seks CaWRKY30-afdæmpede planter blev tilfældigt udvalgt for at kontrollere deres effektivitet af gendæmpning ved rodpodning med celler af kompatibel virulent R. solanacearum-stamme. Vores resultater indikerede, at transkriptionelle niveauer af CaWRKY30 blev reduceret med ~30 procent i Ralstonia-behandlede CaWRKY30 tavsede planter sammenlignet med ikke-dæmpede planter, hvilket validerede lyddæmpningen af ​​CaWRKY30 (figur 4A).

De CaWRKY30 dæmpede planter viste signifikant højere modtagelighed for RSI sammenlignet med ikke-dæmpede planter. Peppers modtagelighed over for patogen blev øget ved at vise en stigning i Ralstonia-populationsvækst, præget af højere cfu-værdier i CaWRKY30-udstødnings-peberplanter sammenlignet med ikke-udstumlede planter 3 d og 5 dage efter podning (dpi) (figur 4B). Histokemisk farvningsassay blev udført for at detektere H2O2-produktionen og cellenekrose i Ralstonia-podede CaWRKY30 dæmpede (TRV: CaWRKY30) og ikke-dæmpede (TRV:00) peberblade. En mørk DAB-farvning (et tegn på H2O2-produktion) og HR-lignende celledød indikeret ved mørk trypanblå farvning blev bemærket i udæmpede peberblade ved 48 hpi (timer efter podning). Omvendt blev koncentrationerne af trypanblåt og DAB-farvning signifikant reduceret i CaWRKY30-dæmpede peberblade (figur 4C). Elektrisk ledningsevne - en indikator for ionlækage - blev beregnet til at studere plasmamembranskade og celledød efter RSI.

Resultaterne viste, at udæmpede planter behandlet med RSI udviste højere ionlækage end Ralstonia-behandlede CaWRKY30 lyddæmpede planter ved 24 og 48 dpi (figur 4D). Relativt sygdomsindeks blev estimeret op til 10 dpi for at udlede sygdomsniveauet i CaWRKY30-tilstillede og ikke-dæmpede planter efter RSI (Supplerende Tabel S2). Fremtrædende sygdomssymptomer blev bemærket i CaWRKY30-dæmpede planter ved 10 dpi, mens ikke-dæmpede planter udtrykte få sygdomssymptomer (figur 4E). Seks CaWRKY30-tilstillede og ikke-dæmpede planter blev tilfældigt udvalgt og infiltreret med R. solanacearum i rødderne til fænotypeanalyse. Tydelige visnesygdomssymptomer blev bemærket i CaWRKY30 dæmpet peber ved 10 dpi, mens udæmpede planter udtrykte meget svage visnesymptomer (figur 4F). qRT-PCR-analysen blev udført for at studere den transkriptionelle akkumulering af immunitetsrelaterede markørgener, og resultaterne udtrykte, at transskriptionelle ekspressionsniveauer af immunitetsassocierede markørgener såsom CaPR1, CaNPR1, CaDEF1, CaABR1 og CaHIR1 blev reduceret i CaWRKY{{ 25}}dæmpede planter sammenlignet med ikke-dæmpede planter ved 48 dpi (figur 4G).

Figur 4. Silencing af CaWRKY30 af VIGS indskrænkede pebers resistens over for RSI og opregulerede immunitetsassocierede markørgener. qRT-PCR-assayet af CaWRKY30-ekspressionsniveauer i R. solanacearum-podede, mock (podet med MgCl2-opløsning) CaWRKY30-stillede peberplanter (TRV: CaWRKY30) og kontrolplanter (TRV:00) (EN). Forskellen i væksten af ​​R. solanacearum mellem CaWRKY30-dæmpede og ikke-dæmpede (kontrol) peberplanter inokuleret med R. solanacearum ved 3 og 5 dpi (B). Histokemisk farvning (DAB- og trypanblå-farvning) i R. solanacearum-podede CaWRKY30-dæmpede (TRV: CaWRKY30) og ikke-dæmpede (TRV:00) peberblade ved 48 dpi. Målestok=50 µm (C). Elektrolytlækagemåling som ionledningsevne for at evaluere celledødsreaktionerne i bladskiverne af CaWRKY30-stillede (TRV: CaWRKY22) og ikke-dæmpede (TRV:00) peberplanter ved 24 og 48 hpi med og uden R. solanacearum (D). CaWRKY30-dæmpning af VIGS forbedrede peberplanters modtagelighed for R. solanacearum-infektion.

Sygdomsindekset eskalerede markant med tiden. CaWRKY30-tilstillede (TRV: CaWRKY30) planter udtrykte høj modtagelighed for R. solanacearum-infektion sammenlignet med ikke-dæmpede (TRV:00) planter over tid. Gennemsnit er baseret på fire biologiske replikater med fem planter pr. replikation (E). Den fænotypiske effekt af R. solanacearum-behandling på CaWRKY30-tilstillede (TRV: CaWRKY30) og ikke-dæmpede (TRV:00) peberplanter ved 10 dpi (F). qRT-PCR-assay af transkriptionelle niveauer af forsvarsassocierede markørgener i CaWRKY30-silented (TRV: CaWRKY30) og ikke-silened (TRV:00) peberplanter 48 timer efter inokulering med R. solanacearum (G). Det relative transkriptionelle ekspressionsniveau af mock-behandlede ikke-dæmpede planter blev sat til "1". Højden af ​​bjælken angiver middelværdier og fejlbjælker angiver standardfejlen for middelværdier. Data repræsenterer middelværdierne ± SE fra fire biologiske replikater. Forskellige bogstaver over søjlerne viser signifikante forskelle mellem middelværdier.

For more information:1950477648nn@gmail.com