Kort indånding af sevofluran kan reducere glialardannelse efter hypoxisk-iskæmisk hjerneskade hos neonatale rotter, del 1

Abstrakt

Tidligere undersøgelser har vist, at sevofluran-postkonditionering kan give neurobeskyttelse efter hypoxisk-iskæmisk skade og forbedre indlærings- og hukommelsesfunktionen ved udvikling af gnaverhjerner.

Hypoksisk-iskæmisk skade refererer til en patologisk tilstand forårsaget af cerebral iskæmi, hypoxi, metabolisk lidelse og nervecelleskade på grund af lidelser i det kardiovaskulære og cerebrovaskulære system. Med sociale fremskridt og livsstilsændringer bliver hypoxisk-iskæmisk skade mere og mere almindelig. Denne tilstand kan forårsage mange skader på menneskers sundhed, herunder påvirke ens intelligens og hukommelse.

Selvom hypoxi og iskæmi kan forårsage et fald i hjernens funktion, betyder det ikke, at hukommelsen vil blive negativt påvirket. Tværtimod kan vi forbedre hukommelsen og øge hjernens effektivitet gennem de rigtige metoder. Her er nogle måder, hvorpå du kan hjælpe med at forbedre din hukommelse:

1. Sund kost: Kostens indvirkning på hukommelsen er meget vigtig. Fødevarer rige på protein, vitaminer og mineraler kan hjælpe med at opretholde et sundt nervesystem og tankefunktion.

2. Træn mere: Fysisk træning kan fremme blodcirkulationen, øge ilttilførslen, forbedre kroppens immunitet og reducere risikoen for sygdom. Gennem træning kan du forbedre din hukommelsesevne.

3. Styrk selvtilliden: Tillid er en vigtig faktor i en persons hukommelse. Hvis du tror på, at du kan klare en bestemt opgave, opnår du nemt de resultater, du ønsker, og du kan også effektivt forbedre din hukommelse.

Det kan ses, at hypoxisk-iskæmisk skade ikke er en tilstand, der uundgåeligt vil skade menneskets hukommelse. Så længe vi mestrer de korrekte metoder og passer godt på vores hjerner, kan vi omfavne en sund fremtid med en positiv indstilling. Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola er et traditionelt kinesisk medicinsk materiale, der har mange unikke effekter, hvoraf en er at forbedre hukommelsen. Virkningen af ​​Cistanche deserticola kommer fra de mange aktive ingredienser, den indeholder, herunder garvesyre, polysaccharider, flavonoidglycosider osv. Disse ingredienser kan fremme hjernens sundhed gennem en række forskellige veje.

Klik på kender 10 måder at forbedre hukommelsen

Den klassiske Rice-Vannucci-model blev brugt til at inducere hypoxisk-iskæmisk skade, og nyfødte (postnatal dag 7) rotter blev behandlet med 2,4% sevofluran i 30 minutter efter hypoxisk-iskæmisk skade.

Vores resultater viste, at sevofluran-postkonditionering signifikant forbedrede lærings- og hukommelsesfunktionen hos rotter, reducerede astrogliose og glialscar-dannelse, øgede antallet af dendritiske rygsøjler og beskyttede hippocampus' histomorfologi. Mekanistisk reducerede sevofluranpostkonditionering udtrykket af von Hippel-Lindau af hypoxi-inducerbar faktor-1 og øgede ekspressionen af ​​DJ-1.

Injektion af 1,52 ug af den hypoxi-inducerbare faktor-1-hæmmer YC-1 (Lificiguat) i venstre laterale ventrikel 30 minutter før hypoksisk-iskæmisk skade vendte neurobeskyttelsen induceret af sevofluran. Dette fund tyder på, at sevofluran effektivt kan lindre astrogliose i hippocampus og reducere indlærings- og hukommelsessvækkelser forårsaget af glialardannelse efter hypoxisk-iskæmisk skade.

Den underliggende mekanisme kan være relateret til opreguleret DJ-1-ekspression, reduceret ubiquitination af hypoxi-inducerbar faktor-1 og stabiliseret hypoxi-inducerbar faktor-1-ekspression. Denne undersøgelse blev godkendt af Laboratory Animal Care Committee ved China Medical University, Kina (godkendelsesnr. 2016PS337K) den 9. november 2016.

Nøgleord: hjerneskade; hjerne; centralnervesystemet; in vivo; skade; model; plasticitet; rotte; genopretning; regenerering; reparationChinese Library Classification No. R453; R741; R614.2+1.

Introduktion

Neonatal hypoxisk-iskæmisk encefalopati (HIE) er en almindelig komplikation i den neonatale periode forårsaget af mange faktorer, såsom neonatal asfyksi, intrauterin lidelse og hyalinemembransygdom (Douglas-Escobar og Weiss, 2015;Barkhuizen et al., 2017).

HIE er den førende årsag til spædbørnsdødelighed og den primære kilde til neurologiske følgesygdomme (Edwards et al., 2010; Descloux et al., 2015). Halvfems procent af HIE-overlevere har langvarig neurologisk dysfunktion, såsom indlærings-, kognitive og motoriske dysfunktioner og epilepsi (Doi et al., 2012; Davies et al., 2019). Nuværende behandling af HIE fokuserer hovedsageligt på symptomatisk behandling, herunder mekanisk ventilation, korrektion af hypotension, tilskud af glukose og begrænsning af væskeindtagelse, hvis det er passende.

Der kræves dog en effektiv behandling, der er i stand til at vende eller reducere langvarig hjerneskade (Stankowski og Gupta, 2011; Davidson et al., 2015). Som en central del af læring og genkendelse er hippocampus, inklusive dentate gyrus (DG) , CA1 og CA3 regioner, deltager i transformation og integration af perifer information i nervecentre (Morris et al., 2012; Jung et al., 2020).

Hippocampus er overfølsom over for hypoxisk-iskæmisk(HI) skade, som kan fremkalde apoptose af hippocampalneuroner, stimulere overdreven reaktiv gliose og føre til glialscar dannelse (Hopkins og Haaland, 2004; Wang et al., 2012). Spredningen af ​​astrocytter er afgørende for forsegling af infarktstedet, ombygning af hippocampus-strukturen og tidsmæssig kontrol af lokale immunresponser under den akutte fase (Rolls et al., 2009).

Imidlertid bidrager hypertrofi og glialardannelse til afvigende neurogenese, hindrer dendritisk rygsøjlevækst og hæmmer synapseformen, hvilket yderligere forringer indlærings- og genkendelsesfunktioner (Yiuand He, 2006; Wanner et al., 2008; Burda og Sofroniew, 2014; Pekny et al. , 2014; Shi et al., 2017).

Glialt fibrillært surt protein (GFAP) og chondroitinsulfatproteoglycaner, såsom neurocan, er patologiske markører for astrogliose og glialscarring, hvis ekspression kan opreguleres af højtaktiverede astrocytter (Pekny og Nilsson, 2005; Choudhuryand Ding, 2016). Hæmning af astrogliose og glialscarring kan således være et terapeutisk mål for HIE og dets langsigtede neurologiske følgesygdomme.

Anvendelse af sevofluran har vist sig at afbøde HI-skader hos gnavere. Undersøgelser, der undersøger betydningen af ​​sevofluran-postkonditionering (SPC) for at lindre HI-skader ved at opregulere hypoxi-inducerbar faktor-1 (HIF-1) hos voksne gnavere og neonatale rotter har identificeret flere potentielle mekanismer (Wang et al., 2019b; Yanget al., 2019; Du et al., 2020;

Som en nøglefysiologisk sensor for hypoxi er HIF-1 en transkriptionsfaktor med hundredvis af downstream-molekyler involveret i iskæmiske tolerancemekanismer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor og erythropoietin (Na et al., 2015). Hypoksisk postkonditionering er blevet verificeret til at reducere astrocyt- og mikroglialaktivering efter HI i neonatale rottehjerner (Teo et al., 2015).

Derfor antog vi, at HIF-1 kan bidrage til at dæmpe dannelsen af ​​gliale ar og astrogliosis.HIF-1 kan konstitutivt eksistere i neuroner, hvorved det hurtigt øges i udtryk og akkumuleres under hypoxiske forhold. Men når oxygen vender tilbage til det normale, kan HIF1-ekspression ikke opretholdes på et højt nok niveau til kontinuerligt at udøve en neurobeskyttende effekt på grund af oxygenafhængig nedbrydning af prolyl-hydroxylaseproteiner og efterfølgende ubiquitylering af von Hippel-Lindau (VHL)-proteiner (Berra et al., 2003; Zhang et al., 2018).

DJ-1 (kodet af Park7) er angiveligt et neurobeskyttende protein, især under oxidative forhold (Aleyasin et al., 2007, 2010). VHL-protein interagerer fysisk med DJ-1, som bestemt af en upartisk massespektrometrisk skærm og bekræftet i en Parkinsons sygdom (PD) model. Derudover viste Parsanejad et al.(2014), at DJ-1 hæmmer VHL-afhængig ubiquitylering og stabiliserer HIF-1-ekspression.

Vi antog således, at sevofluran stabiliserer HIF-1-protein i hippocampus ved at opregulere DJ-1 for at hæmme HIF-1 ubiquitylering og derved forbedre langsigtet indlæring og hukommelsesfunktion.

For at undersøge HIFs-1 rolle i forholdet mellem sevofluran og astrogliose brugte vi YC-1 (Lificiguat), en aselektiv antagonist af HIF-1, til fuldstændigt at inhibere HIF-1-ekspression ved det post-transskriptionelle niveau. I denne undersøgelse undersøgte vi rollen af ​​HIF-1a i neurobeskyttelse af SPC-behandlede HIE neonatale rotter.

Materialer og metoder

Dyr
Dyreforskning blev udført på det synaptiske stadie af rotteudvikling, som begynder på postnatal dag 7 (P7), svarende til vækstperioden for menneskelige spædbørn fra sen graviditet til 3 år efter fødslen (Jevtovic-Todorovic et al., 2003). Syv dage gamle Sprague-Dawley-rotter, der vejede 12-16 g, blev udvalgt blandt 20 drægtige rotter (købt fra Laboratory of Shengjing Hospital, China Medical University, Kina; han/hun-forhold, 1:1).

Alle rotter var i stand til frit at få adgang til vand og mad og holdt ved standard luftfugtighed og temperatur i laboratoriet med 12-timers lys/mørke (8 am/8 p.m.) cyklusser. Alle dyreforsøg blev udført i henhold til National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA) retningslinjer for pleje og brug af laboratoriedyr.

The Laboratory Animal Care Committee of China Medical University godkendte formelt de beskrevne eksperimenter (Shenyang, Kina; godkendelse nr. 2016PS337K) den 9. november 2016.

Fra 25 drægtige rotter blev 249 P7-rotter udvalgt og tilfældigt inddelt i grupper baseret på en tilfældig taltabel (Wang et al., 2019a). Vores endelige analyse omfattede i alt 201 nyfødte rotter; dødeligheden efter HI-behandling var 19 %.

Disse 201 nyfødte rotter blev tilfældigt opdelt i fire grupper: sham(n=54), HI (n=54), HI + sevofluran (HIS) (n=54) og HIS+ YC{{ 6}} (n=39) grupper. I hver gruppe blev 24 rotter brugt til western blot-assay, 5 blev brugt til immunhistokemi og Golgi-farvning, og 10 blev brugt til adfærdstestning. De resterende 45 rotter i sham-, HI- og HIS-grupper blev brugt til revers transkriptionspolymerasekædereaktion (RT- PCR).

Eksperimentelt design og eksponering for anæstesi

Den anvendte HIE-model er tidligere beskrevet (Zhao et al., 2007; Grandvuillemin et al., 2017). Baseret på afstanden mellem anus og reproduktive organer blev kønsidentifikation af postnatale rotter fuldført. For at etablere HIE-modellen blev hovedet af hver P7-rotte sat i et gennemsigtigt plastrør, som blev forseglet med bomuld, før sevofluran blev frigivet (Wang et al., 2019a; Xue et al., 2019).

Den venstre almindelige carotisarterie i hver rotte blev permanent ligeret, og mellem de to ligeringer blev arterien skåret over; hver operation blev afsluttet inden for 5 minutter. Efterfølgende vågnede rotterne upåvirket af bedøvelse og blev sat tilbage i deres mødres bure i 2 timer. Til administration af SPC blev rotterne anbragt i et gennemsigtigt kammer (Lingzhi Company, Hangzhou, Kina) forbundet med asevofluran-fordamper; den ene kanal hjalp til med ventilation, mens den anden førte gasprøven ud af kammeret til monitoren.

Kammeret blev ventileret med 30 % O2 og 70 % N2 i 2 timer for den falske gruppe, mens 8 % O2 og 92 % N2 blev administreret i 2 timer til HI-gruppen. SPC blev sat straks efter HI: 2,4 % sevofluran (1 minimum alveolarkoncentration) blev inhaleret af rotter i kammeret med en anatmosfære på 30 % O2 og 70 % N2 og en luftstrømshastighed på 2 L/min i 30 minutter. Den varme pool stabiliserede temperaturen inde i kammeret på 37 grader.

Lægemiddeladministration

Præcis 30 minutter før HI blev 1,52 ug HIF-1-hæmmer (YC1; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) injiceret i den venstre laterale ventrikel (Paxinos og Franklin, 2013) vha. en 5-μLHamilton-sprøjte (Yingweida Technology, Beijing, Kina). Som tidligere beskrevet blev YC-1 opløst i kunstig cerebralspinalvæske i en koncentration på 0,304 ug/μL (Shen et al., 2012; Na et al., 2015).

Western blot analyse

P7-rotter blev bedøvet med 2% sevofluran, og hippocampusvæv blev ekstraheret fra unger 12, 24 og 48 timer og 28 dage efter operationen. Efter ekstraktion blev væv straks anbragt på is.

Total supernatantproteiner blev isoleret ved tilsætning af et radioimmunpræcipitationsassaymiddel (Beyotime, Haimen, Kina). Proteinkoncentrationer blev bestemt med et One BCA Kit (Beyotime).

Derefter blev prøver adskilt på 12,5% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgeler og overført til nitrocellulosemembraner. Efter blokering med 5 % bovint serumalbumin (Sigma-Aldrich) ved 4 grader, blev membranen inkuberet med de passende primære antistoffer, inklusive anti-glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH; 1:2000; Kat # 5174S; CellSignaling Technology , Danvers, MA, USA), anti-DJ-1 (1:1000;Cat# ab18257; Abcam, Cambridge, UK), anti-VHL (1:5000;polyklonal; Cat# ab77262; Abcam), anti -HIF-1 (1:900;polyklonal; Kat# ab2185; Abcam), anti-neurocan (1:200;monoklonal; Kat# sc-33663; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) , anti-postsynaptisk densitetsprotein 95 (PSD95; 1:1000; monoklonalt; Kat. nr. 3409S; Cell Signaling Technology), antivækstassocieret protein 43 (GAP43; 1:2000; polyklonalt; Kat# 16971-1-AP; Proteintech Biotechnology , Chicago, IL, USA) og anti-GFAP (1:5000, polyklonalt, Kat# ab53554;Abcam).

Bagefter blev blots inkuberet med anti-kanin IgG(1:5000; Kat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao, Beijing, Kina) eller anti-muse IgG (1:5000; Kat# ZB-2301; Zhongshanjinqiao) i 2 timer ved stuetemperatur.

Proteinblots blev visualiseret med forbedrede kemiluminescensdetektionsreagenser (SuperSignal West Pico; Pierce, Rockford, IL, USA). Proteinbånd blev kvantificeret med ImageJ-software (National Institutes ofHealth). Til analyse af western blots blev data normaliseret til GAPDH.

Immunhistokemi

Otteogtyve dage efter operationen blev rotter indgivet bedøvelse under anvendelse af metoden beskrevet ovenfor, perfunderet med 4 % formalin, og deres hjerner blev fjernet for immunfluorescensfarvning.

Hjerner blev nedsænket i 4% paraformaldehyd ved 4 grader i 48 timer, efterfølgende dehydreret i en gradueret ethanolserie og til sidst indlejret i paraffin. Derefter blev paraffinindlejret væv skåret i 2.5-μm tykke sektioner med en vibratom, og de resulterende sektioner blev opbevaret ved stuetemperatur.

Hver hjerne blev sektioneret kontinuerligt, og tre diskontinuerlige hjernesektioner blev udvalgt til NeuN (neuronmarkør), GFAP (astrocyte markør) og neurocan (glial armarkør) farvning. Til dobbelt mærkning blev vævssnit inkuberet med to blandede primære antistoffer, inklusive gede anti- GFAP(1:250; polyklonalt; Kat# ab53554; Abcam), kaninantigener (1:100; Kat#12943; Cellesignalteknologi) og/eller muse-anti-neurokan (1:200; monoklonalt; Kat# sc{{ 10}};Santa Cruz Biotechnology) ved 4 grader natten over i et befugtet kammer.

Efterfølgende blev sektioner vasket med 0.1 Mphosphat-bufret saltvand og inkuberet i 2 timer ved stuetemperatur med de passende sekundære antistoffer, inklusive anti-kanin IgG konjugeret til Alexa Fluor-594 (1:200;Life) Technologies, Grand Island, NY, USA), anti-muse-IgG-konjugeret til Alexa Fluor-594 (1:200; Life Technologies), og anti-ged-IgG konjugeret til fluorescein-isothiocyanat(1:200; Life Technologies).

Modfarvning af cellekerner blev implementeret med 4′,6-diamidino-2-phenylindol (Beyotime) i 5 minutter.

Et Olympus BX51-mikroskop (OlympusCorporation, Tokyo, Japan) blev brugt til observation af farvede snit. Tre synsfelter af venstre hippocampus blev tilfældigt udvalgt fra hver skive til fotografering. ImageJ-software blev brugt til at estimere kvantitativ kolokalisering og derfor beregne Manders' overlapskoefficient.

For more information:1950477648nn@gmail.com