Forøgelse af anticanceraktiviteten hos Aspergillus Favus "endophyte of Jojoba" Taxol via konjugering med guldnanopartikler medieret af -bestråling

Taxol alternative kinesiske urter Cistanche

Nøgleord:Aspergillus favus · Jojoba · Endofytiske svampe · Guld nanopartikler · Taxol · -Bestråling · Ernæringsoptimering

Introduktion

Taxol er en af ​​de mest kommercialiserede bredspektredelægemidler mod kræft[1]. Aktiviteten af ​​Taxol uddyber sig ud fra dets unikke specificitet for binding med de cellulære tubulin-underenheder heterodimer, hvilket fremmer tubulin-polymerisering og dermed forstyrrer den mitotiske deling af tumorceller [2]. Taxol udviste en stærk aktivitet mod bryst-, lunge-, hoved- og halskræft, livmoderkræft og fremskredne former for Kaposis sarkom [3]. Taxol blev først fremstillet af bark fra takstræer Taxus brevifolia "familie Taxaceae" [4, 5]; dog det lavere udbytte af Taxol<0.001%, i.e., to produce 1 g Taxol, it requires~10 kg of plant bark that collected from 3 to 5 trees [6], is the main challenge. In addition, the vulnerability of this plant to unpredicted fluctuations with the environmental conditions strongly influences the Taxol yield, heterogeneity, and reproducibility [7–9]. Exploring the Taxol producing potency of the endophytic fungi inhabiting medicinal plants raises the hope for overcoming the low yield by the above-mentioned method [10, 11], due to their fast growth, cost-effectiveness, independence on climatic changes, and feasibility for genetic manipulation [12, 13]. Subsequently, a plethora of endophytic fungi with metabolic potency to produce Taxol has been reported as reviewed [1, 14–25]. However, the anticipation of these fungi for industrial production of Taxol has been challenged by the attenuation and loss of Taxol productivity by the fungal storage and multiple subculturing [21, 22, 26–28]. Thus, searching for a novel fungal isolate with affordable metabolic stability and sustainability for Taxol production is the challenge. Medicinal plants of well-known ethnopharmacological relevance and traditional pharmaceutical applications could be the repertoire of novel fungal isolates with unique features of metabolic stability for Taxol biosynthesis. Among the most common medicinal plants, jojoba "Simmondsia chinensis" is a monogenetic dioecious grey-green shrub belonging to the Simmondsiaceae family. Jojoba seeds contain up to 65% of light golden and odorless high-viscosity oily metabolites [29]. Jojoba oil has been frequently used for the relief of headaches, throat inflammation, and wound treatment [30, 31]. As well as Jojoba oil has been used as an anti-inflammatory and antimicrobial agent [30, 31]. The leaves of jojoba are rich with antioxidant flavonoid compounds that are traditionally used for treating of various disorders such as astma,betændelse, ogKræft[32]. Hovedformålet med dette arbejde var således at udforske et nyt svampeisolat fra jojobaplante med unik metabolisk stabilitet til Taxol-produktion, for at evaluere de forskellige tilgange til at maksimere deres Taxol-udbytte samt at øge den antiproliferative aktivitet af ekstraherede Taxol-forbindelser via konjugation med guld nanopartikler, medieret af gammabestråling.

Materialer og metoder

Isolering og dyrkning af de endofytiske svampe

Forskellige dele af jojoba (Simmondsia chinensis) som blade, bark, kviste og knopper blev indsamlet fra Fakultetet for Landbrug, Cairo University, og brugt som kilde til endofytiske svampe. Plantedelene blev opsamlet og vasket under rindende postevand, overfladesteriliseret med 70 procent ethanol i 1 min og derefter skyllet med sterilt vand [28]. De overfladesteriliserede plantedele blev skåret i små stykker under sterile forhold og anbragt på plader med kartoffel dextrose agar (PDA) medium, Czapek's-Dox og maltekstrakt agar medium [33-36], og pladerne blev inkuberet ved 30 grader for 10 dage. Effektiviteten af ​​overfladesterilisering af plantedelene blev vurderet ved centrifugering af skyllevandet, derefter blev 500 ul sterilt vand tilsat til bundfaldet og udpladet i PDA-medium [37]. De oprensede endofytiske svampeisolater blev podet på PDA-skråninger i 7 dage og opbevaret ved 4 grader

Screening, ekstraktion og kvantificering af taxol fra endofytiske svampe

De genvundne endofytiske svampe, der beboer jojoba, blev screenet for Taxol-produktion ved at dyrke på kartoffel dextrose bouillon (PDB) [38]. En prop af hver af de 7 dage gamle fungal-isolater blev inokuleret i 100 ml PDB/250 ml Erlenmeyer-opgaver, inkuberet i 15 dage ved 30±1 grad, under rysteforhold (120 rpm). Efter inkubation blev kulturerne filtreret, og filtratet blev ændret med 0,2% natriumbicarbonat for at udfælde fedtsyrer. Taxol er blevet ekstraheret med dichlormethan, og den organiske fase blev opsamlet og inddampet til tørhed, og resterne blev genopløst i methanol [17, 39]. Taxol blev separeret og identificeret ved TLC under anvendelse af Merck 1 mm (20×20 cm) præcoatede silicagelplader (TLC Silicagel 60 F254, Darmstadt, Tyskland), detekteret ved UV-belysning ved 254 nm [39]. De formodede pletter af Taxol blev skrabet af fra TLC-silicagelpladerne og opløst i methanol, hvirvlet kraftigt i 10 minutter og centrifugeret ved 1000 rpm i 5 minutter. De udfældede silicapartikler blev fjernet, og supernatanten blev taget til Taxol kvantificering og renhedskontrol ved HPLC (YOUNG In, Chromass, 9110 plus Quater nary Pump, Korea) af C18 omvendt fase kolonne (Eclipse Plus C18 4.6 ×150 mm, 3,5 μm, Kat. # 959.963–902). Den anvendte mobile fase var methanol/acetonitril/vand (25:35:40, v/v/v) med en strømningshastighed på 1,0 ml/min i 20 minutter [40], og taxolfraktioner blev målt ved 227 nm, og deres kemisk identitet og koncentrationer blev bekræftet fra retentionstiden og absorptionsspidsarealet sammenlignet med autentisk prøve.

Morfologisk og molekylær identifikation af de genvundne endofytiske svampe

De endofytiske svampeisolater blev identificeret til deres artsniveauer baseret på deres makro- og mikromorfologiske egenskaber ved at dyrke på PDA, Czapek's-Dox og maltekstraktmedier i henhold til referencens nøgler [33-36]. Identiteten af ​​de mest potente Taxol-producerende svampeisolater blev yderligere molekylært bekræftet baseret på sekvensen af ​​intern transskriberet spacer (ITS) [41, 42]. Svampe genomisk DNA (gDNA) blev ekstraheret ved at pulverisere myceliet (~0,2 g) i flydende nitrogen og derefter dispensere i 1 ml CTAB ekstraktionsbuffer (2 procent CTAB, 2 procent PVP40, { {21}},2 procent 2-mercaptoethanol, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl i 100 mM Tris-HCl, pH 8,0). PCR-primersættene var ITS4 5′-GGAAGTAAAAGTCGT AACAAGG-3′ og ITS5 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′. PCR-reaktionen indeholder 10 µl 2×PCR-masterblanding (i-Taq™, kat.nr. 25027), 2 µl gDNA, 1 µl af hver primer (10 pmol/ul) og afsluttet til 20 µl med steril destilleret vand. PCR'en blev programmeret til initial denaturering ved 94 grader i 2 minutter, denaturering ved 94 grader i 30 sekunder, annealing ved 55 grader i 10 sekunder, forlængelse ved 72 grader i 30 sekunder i 35 cyklusser og endelig forlængelse ved 72 grader i 2 min. PCR-amplikonerne blev analyseret med 1,5 procent agarosegel i 1×TBE-buffer (Ambion Cat# AM9864), under anvendelse af 1 kb DNA-stige (Kat. # PG010-55DI) og visualiseret ved geldokumentationssystem. Amplikonerne blev oprenset og sekventeret af Applied Biosystems Sequencer, HiSQV Bases, Version 6.0 med de samme primersæt. De opnåede sekvenser blev BLAST-søgt ikke-redundant på NCBI-databasen, importeret til MEGA 6.0-software og justeret med Clustal W-muskelalgoritmen [43], og det fylogenetiske træ blev konstrueret med nabosammenføjningsmetoden af ​​MEGA 6.0 [44].

Kemisk struktur af den ekstraherede taxol

De formodede pletter af Taxol blev skrabet af fra TLC silicagelpladerne og renset, og renheden og koncentrationen blev bestemt ved UV-Vis analyserne ved λ 227 nm (RIGOL, Ultra-3000 Series) sammenlignet med autentisk Taxol [39]. Blanke medier under de samme betingelser blev brugt som en negativ baseline for de spektrofotometriske analyser. FT-IR-spektrum af de oprensede Taxol-prøver blev analyseret med JASCO FT-IR 3600 spektrofotometer. Taxol-prøven blev malet med KBr-pellets, presset til skiver under vakuum, og absorptionen blev målt i området 400 til 4000 cm−1 [3], sammenlignet med den autentiske. Den kemiske struktur af ekstraheret Taxol blev bekræftet fra HNMR-spektroskopi (JEOL, ECA-500II, 500 MHz NMR) sammenlignet med autentisk Taxol. Prøverne blev opløst i CDCl3, kemiske skift er angivet i ppm (δ-skala), og koblingskonstanterne er udtrykt i hertz (Hz).

Effekt af forskellige typer medier på Taxol-produktion

To agarpropper (9 mm) fra 7 dage gamle kulturer af hvert svampeisolat blev inokuleret i tre eksemplarer i 100 ml medium/250 ml Erlenmeyer-kolbe med kartoffeldextrose (PDB), Czapek's-Dox (CZD), M1D og maltekstrakt (ME) ) bouillonmedier. Ikke-inokulerede kontroller fra hvert medium, der er fri for svampesporer, blev anvendt som en negativ kontrol, inkuberet ved 30 grader i 15 dage under de samme betingelser. Efter inkubation blev svampekulturer filtreret, og Taxol blev ekstraheret og bestemt som nævnt ovenfor.

Bioprocesoptimering af ernæringsbetingelserne for at maksimere taxoludbyttet

Optimering af mediumsammensætningen for at maksimere Taxol-udbyttet af det potente fungal-isolat blev udført ved hjælp af responsoverflademetodologi ved brug af Placket-Burman-design efterfulgt af centralt kompositdesign [17-20, 45]. Ud fra RSM-designerne blev de positive og signifikante variabler, der påvirker Taxol-produktionen af ​​det potente svampeisolat, vurderet ved hjælp af den statistiske softwarepakke af Design-Expert 7.0 (Stat Ease Inc., Minneapolis, USA). Hvert forsøg blev kørt i tre biologiske replikater, og middelværdierne blev taget i betragtning. Efter inkubation ved de ønskede betingelser blev svampebiomasse filtreret, og Taxol blev ekstraheret og kvantificeret ved TLC og HPLC som beskrevet ovenfor.

Placket-Burman Design

Placket-Burman-designet er ofte blevet brugt til optimering af mediekomponenten til svampevækst og produktion af bioaktive sekundære metabolitter, ved at evaluere de signifikante variabler, der påvirker Taxol-produktionen [18, 20, 46]. Valget af faktor var baseret på medier anvendt i kvalitativ og kvantitativ screening. Elleve faktorer er inkluderet; maltekstrakt, pepton, saccharose, soytone, glutamin, oksekødekstrakt og temperatur, pH, inkubationstid og rystehastighedsværdier og faktorer blev varieret over to niveauer, og minimums- og maksimumniveauområderne blev valgt. Den statistiske Design-Expert 7.0 blev brugt til at generere et sæt af 12 eksperimenter. For hvert eksperiment blev Taxol-produktionen bestemt i tre biologiske replikater, og gennemsnittet af Taxol-udbyttet blev taget i betragtning.

Regressionsanalyse af dataene blev udført ved hjælp af statistisk software. Effekten af ​​hver variabel blev beregnet (Biometrika, 2020) ved hjælp af følgende ligning:

hvor E er effekten af ​​en testvariabel, M plus og M− er Taxol-koncentrationen af ​​forsøg ved, at parameteren var på henholdsvis højere og lavere niveauer, og N er antallet af eksperimenter, der blev udført. Effekten af ​​hver variabel på produktionen blev bestemt ved at beregne deres respektive E-værdier.

Hvor Tot høj er de samlede svar på det høje niveau, Tot lav er de samlede svar på det lave niveau, og Nej er antallet af forsøg.

Centralt sammensat design og interaktioner mellem faktorer, der påvirker Taxol-produktion

De mest signifikante positive faktorer, der påvirker Taxol-produktionen af ​​den valgte svampeisolering, blev optimeret ved hjælp af et eksperimentelt design af responsoverfladetypen CCD-model [47]. Ved at bruge CCD blev koncentrationerne af mediekomponenterne optimeret, og deres undersøgte interaktioner blev brugt til at generere i alt 20 eksperimenter for de tre variable. For at bestemme de optimale niveauer af variablerne for Taxol-produktion fra det potente svampeisolat blev tredimensionelle (3D) responsoverfladekurver plottet for at studere interaktionen mellem de forskellige faktorer og for at bestemme den variable tilstand af hver faktor, der påvirker Taxol-produktionen. 3D-graferne blev udført ved at holde tre faktorers konstanter på et ideelt niveau og plotte den opnåede respons af Taxol-udbytte for varierende niveauer af de to andre faktorer.

Effekt af gammabestråling på taxoludbytte

De potente endofytiske isolater, der producerede Taxol, blev udsat for -bestråling med 60koboltkilde (gammacelle 4000-A-Indien) ved forskellige gammastrålingsdoser (0.25-3.0 kGy) sammenlignet til kontrol af den ikke-bestrålede kultur; en dosishastighed på 1,2 kGy/h på forsøgstidspunktet. De optimerede medier blev inokuleret af den bestrålede kultur under standardkulturbetingelser sammenlignet med den ikke-bestrålede spores inokulum som kontrol. Kulturerne blev inkuberet ved 30±2 grader i 15 dage på en roterende ryster (120 rpm). Efter inkubation blev kulturerne filtreret, og Taxol blev ekstraheret, oprenset og kvantificeret ved TLC og HPLC som beskrevet ovenfor.

Syntese og karakterisering af guldnanopartikler (AuNP'er); Konjugering med Taxol

Anticancer aktivitet af Taxol

Aktiviteten af ​​de oprensede Taxol- og Taxol-PVP-AuNPs-konjugater mod levercarcinom (HPG2) og brystcarcinom (MCF7) blev bestemt ved 3- (4,5-dimethylthiazol- 2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay [48]. 96-brøndspladen blev podet med 103 celler pr. brønd og inkuberet natten over ved 37 grader, derefter blev forskellige koncentrationer af lægemidlet tilsat, og pladerne blev re-inkuberet i 48 timer. MTT-reagenset (25 ul) blev tilsat og inkuberet i 2 timer, og den lilla farve af det udviklede formazankompleks blev målt ved λ570 nm. IC50-værdien blev udtrykt ved mængden af ​​lægemiddel, der reducerede væksten af ​​50 procent af et initialt antal tumorceller, der normaliserede til positiv kontrol.

Antimikrobiel aktivitet af Taxol og Taxol-AuNPs konjugater

Den antimikrobielle aktivitet af Taxol- og Taxol-AuNPs-konjugater blev vurderet mod forskellige bakterieisolater; Bacillus subtilis ATCC 6633 og Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og Enterobacter agglomerans, foruden Candida albicans. De testede bakterieceller blev suspenderet i sterilt peptonvand til opnåelse af standardpodestof på ~0.5 McFarland (1-1.5)× 1{{10}}8 CFU/ml ved λ6{{18 }}0 nm. Vækstinhiberingen (mm) af mikrobielle patogeners vækst blev vurderet ved hjælp af agardisk-difusionsmetode. Sterile standard antibiotikumskiver med en diameter på 6,0 mm blev brugt som positive kontroller. Sterile antibiotikaskiver (6,0 mm) blev fyldt med 20 µl methanol og amoxicillin-clavulansyre (AMC) som en negativ og positiv kontrol. Diske blev fyldt med den samme koncentration af Taxol, Taxol-PVP-AuNP'er og AuNP'er (1,0 ug/ml). Tre biologiske replikater blev fremstillet. Pladerne blev inkuberet ved 37 grader i 24 timer, og inhiberingszonerne blev målt. Amoxicillin clavulansyre (AMC) og nystatin blev brugt til at normalisere Taxols antimikrobielle aktivitet. Inhiberingszonen for vækst blev bestemt ved hjælp af en nonier-skydelære (mm).

Statistiske analyser

Morfologisk og molekylær identifikation af de potente taxolproducenter

Morfologiske træk ved det potente svampeisolat, der producerer Taxol, blev undersøgt i henhold til de makroskopiske og mikroskopiske beskrivende nøgler, som beskrevet i Materialer og metoder, og afslørede dets morfologiske nærhed med A. favus (fig. 2). Svampeisolatet blev dyrket på PDA ved 30 grader i 10 dage, og de makroskopiske og mikroskopiske træk afslørede dets identitet som f.eks. konidiale hoveder, forgreningsmåde, identiteten af ​​stigmatisering og konidial ontologi og dannelse af frugtlegemer, ifølge den universelle morfologiske nøgler [33], og blev fundet at være identiske med Aspergillus favus. Det potente Taxol-producerende isolat A. favus blev yderligere identificeret baseret på deres ITS-sekvenser ved at anvende gDNA som skabelon. PCR-amplikonerne (~550 bp) af A. favus blev opløst, oprenset og sekventeret (fig. 2). ITS-sekvensen af ​​A. favus var ikke-redundant blast-søgt på NCBI-databasen, der viste 99 procent lighed med A. favus, med nul E.-værdier og 95 procent forespørgselsdækning. Ud fra de mikroskopiske og molekylære analyser blev målisolatet således bekræftet som A. favus og deponeret på GenBank med adgangsnummer MW485934.1, ligesom isolatet er blevet deponeret på Assiut University Mycological Center (AUMC), Egypten med en deponeringsnummer AUMC13892. Det nuværende isolat havde 99 procent lighed med A. favus isolater MW485934, MT446145, KJ863514, MW522551,

Fig. 1 Et morfologisk billede af jojobaplante. B Pladekulturer af de potente Taxol-producerende endofytiske svampe; A. favus Bd1 (13), A. niger Lv1 (21), Penicillium polonium (23) og A. oryzae Bd (25) på PDA efter 8 dages inkubation ved 30 grader. Svampeisolaterne blev dyrket på PDB og inkuberet ved standardbetingelserne, og Taxol blev ekstraheret og kontrolleret ved TLC (C). D HPLC-kromatogram af Taxol fra de potente svampeisolater. E Udbytte af Taxol som kvantificeret fra HPLC. F, UV-Vis spektral analyse af ekstraheret Taxol fra svampeisolaterne. G FT-IR-analyse af ekstraheret Taxol sammenlignet med autentisk

Fig. 2 A Makromorfologiske træk ved A. favus en endofyt af jojoba efter 3, 5 og 8 dages vækst på PDA. Mikromorfologiske træk, konidiehoved af A. favus ved 400X forstørrelse. C PCR-amplikon af A. favus ITS-region på 500 bp, normaliseret til 1 kb stige (Kat.nr. SM0312). D Fylogenetisk analyse af ITS A. favus ved maximum likelihood-metode [44]