Beta Vulgaris Rubra L. (rødbede) skrælle methanolekstrakt reducerer oxidativ stress og stimulerer celleproliferation via øget VEGF-ekspression i H2O2-induceret oxidativt stressede humane navlestrengsvene-endotelceller

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comat vide mere

Laila Naif Al-Harbi 1,*, Subash-Babu Pandurangan 1, Alhanouf Mohammed Al-Dossari 1, Ghalia Shamlan 1, Ahmad Mohammad Salamatullah 1, Ali A Alshatwi 1 og Amna Abdullah Alotiby 2

Abstrakt:Antioxidantkapaciteten af ​​polyfenoler ogflavonoidertil stede i diætmidler hjælper med at standse udviklingen af ​​reaktive oxygenarter (ROS) og beskytter glatte endotelceller mod oxidativt stress/induceret nekrose. Rødbeder (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) er en almindeligt indtaget grøntsag, der repræsenterer en rig kilde tilantioxidanter. Rødbedeskrællers bioaktive forbindelser og deres rolle i humane navlevene-endotelceller (HUVEC'er) er stadig underforsket. I nærværende undersøgelse blev rødbedeskræl-methanolekstrakt (BPME) fremstillet, og dets effekt på bioeffektiviteten, nuklear integritet, mitokondriel membranpotentiale, vaskulær cellevækst og immunreguleringsrelaterede genekspressionsniveauer i HUVEC'er med induceredeoxidativstress blev analyseret. Gaskromatografi-massespektroskopi (GC-MS) resultater bekræftede, at BPME indeholder 5-hydroxymethylfurfural (32,6 procent), methylpyruvat (15,13 procent), furfural (9,98 procent) og 2,3-dihydro{{11} },5-dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran-4-on (12,4 procent). BPM-ekstrakt forbedrede effektivt celleproliferation og blev bekræftet ved MTT-assay; den nukleare integritet blev bekræftet ved propidiumiodid (PI) farvningsassay; mitokondriemembranpotentialet (∆ψm) blev bekræftet ved JC-1farvningsassay. Annexin V-assay bekræftede, at BPME-behandlede HUVEC'er viste 99 procent levedygtige celler, men kun 39,8 procent levedygtighed blev vist i HUVEC'er behandlet med H2O2 alene. Derudover reducerede BPME-behandling af HUVEC'er i 48 timer mRNA-ekspression af lipidperoxid (LPO) og øgede NOS-3, Nrf-2, GSK-3, GPX, endotelnitrogenoxidsyntase (eNOS) ) og vaskulær cellevækstfaktor (VEGF)mRNA-ekspressionsniveauer. Vi fandt, at BPME-behandling reducerede proinflammatorisk (nuklear faktor-κ (F-κ), vævsnekrosefaktor- (TNF- ), toll-lignende receptor-4 (TLR-4), interleukin{{37} } (IL-1 )) og vaskulærbetændelse(intracellulært adhæsionsmolekyle (ICAM), vaskulært celleadhæsionsmolekyle (VCAM), EDN1, IL-1 )-relaterede mRNA-ekspressioner. Som konklusion øgede rødbedeskrælbehandling effektivt vaskulære glatte cellevækstfaktorer og udvikling af mikrotubuli, hvorimod det reducerede vaskulære inflammatoriske regulatorer. BPM kan være gavnligt for vaskulær glatcelle-regenerering, vævsreparation og anti-aldringspotentiale.

Nøgleord:rødbede; oxidativt stress; mitokondrier; angiogenese; betændelse

Klik venligst her for at lære mere

1. Introduktion

Angiogenese er den fysiologiske proces af vaskulogenese fra kroppens eksisterende vaskulatur [1]. Det er vigtigt ikke kun for embryonal udvikling og reproduktion, men også for cellecyklus og vævsreparation [2,3]. Imidlertid er det forbundet med patogenesen af ​​forskellige sygdomme, såsom tumorvækst, leddegigt og forskellige iskæmiske og inflammatoriske sygdomme [3-5]. Det vaskulære endotel spiller en vigtig rolle i at opretholde vaskulær hæmostase ved at regulere blodkartonus og immun- og inflammatoriske reaktioner [6,7]. Endotelceller (EC'er) er tynde monocellulære lag, der beklæder alle indre overflader af blodkar og producerer en række molekyler, der virker lokalt eller på fjerne steder [7]. Endotelet er fundamentalt for kroppens homeostase, og enhver ændring i endotelcelleresponset fører til de primære begivenheder af inflammatoriske og vaskulære sygdomsprocesser, såsom aterosklerose og hypertension [6,8,9]. Disse sygdomme forårsager oxidativ stress, som ændrer EC-strukturen og funktionsintegriteten og fører til endothelial dysfunktion [9]. Human umbilical vene EC'er (HUVEC'er) er blevet brugt i vid udstrækning som en model for humane vaskulære endothel-relaterede undersøgelser. Desuden repræsenterer de en nyttig model til at studere de vigtigste biologiske veje involveret i endotelfunktion [10]. Bioaktive forbindelser og fytokemikalier findes rigeligt i frugt, grøntsager, grønne urter og mange planter, som udviser adskillige sundhedsmæssige fordele, såsom anti-inflammatoriske, antioxidante, anticarcinogene og angiogene egenskaber [11-13]. I denne henseende hører rødbeder (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr) til Amaranthaceae-familien og er klassificeret som en af ​​de bedste kilder til høje niveauer af antioxidanter [14,15]. Specifikt indeholder det flere fytokemikalier, der er biologisk aktive, herunderbetalainsflavonoider,polyfenoler, terapeutiske enzymer, ascorbinsyre, dehydroascorbinsyre (DHAA) og uorganisk nitrat (NO3) [16-18]. Desuden giver det værdifulde essentielle næringsstoffer, såsom kalium, calcium, magnesium, natrium, jern, zink, fosfor, kobber og mangan [19]. Adskillige undersøgelser har rapporteret, at rødbedeekstrakt (rod) har adskillige gavnlige virkninger på grund af dets hypoglykæmiske, lipidsænkende, anti-inflammatoriske, antihypertensive og antiproliferative egenskaber [20-22]. Disse gavnlige egenskaber kan alle være forbundet med de bioaktive forbindelsers evne til at fjerne frie radikaler. Således er forbruget af rødbede blevet forbundet med adskillige ernæringsmæssige og sundhedsmæssige fordele. På grund af dets ernæringsmæssige værdi kan det bruges som en funktionel fødevarekilde mod oxidative stress, der inducerer kroniske stofskiftesygdomme, såsom type 2 diabetes og hjerte-kar-sygdomme [23]. Baseret på litteraturgennemgangen har Beta vulgaris potente antioxidanter, immunregulerende og angiogene egenskaber. Apigenin er fundet i roeblade; det har antiproliferative effekter i lever- og tarmceller, og det kan forbedre fedtfattig diæt-induceret fedmekomorbiditet via AMPK-aktivering [24,25]. De Silva et al., (2020) [26] identificerede, at Beta vulgaris beskytter vaskulære EC'er mod eksternt induceret oxidativt stress, hvilket kan skyldes den kombinerede virkning af flere bioaktive forbindelser til stede i denne plante. Indtil nu er den mekanistiske virkning for EC-proliferation og angiogenese-effekt af Beta vulgaris rodskrælning ikke blevet undersøgt. Derfor sigtede vi på at udføre denne undersøgelse for at undersøge vaskulær celleproliferation, udvikling af mikrotubuli, oxidativ stress og angiogenesekapacitet relateret til Beta vulgaris rodskrælning ved hjælp af cellulær morfologi og genekspressionsanalyse i HUVEC'er. De angiogene virkninger af rødbedeskræl-methanolekstrakt forbundet med nuklear integritet, udvikling af mikrotubuli, mitokondriel effektivitet og cellecyklusstimulering i menneskelige vaskulære EC'er udforskes.

2. Materialer og metoder

2.1. Tilberedning af rødbeder(Beta vulgaris rubra L.) Methanolekstrakt Prøver af friske rødbeder (Beta vulgaris var. Rubra L.; BVr.) blev oprindeligt opnået fra grøntsagsforretninger, Riyadh, Kongeriget Saudi-Arabien (KSA). De friske rødbeder blev vasket med destilleret vand for at fjerne stilke og forurenende stoffer. Den ydre hud blev skrællet for at blive fjernet og skåret i små stykker. Prøver blev tørret i en varmluftovn ved 40 ◦Kan derefter malet til pulver ved hjælp af en elektronisk blender. Derefter blev 5{{10}}0 g af pulveret ekstraheret i en steril flaske indeholdende 1 L methanol (Sigma, St. Louis, MO, USA) i 24 timer ved stuetemperatur på en shaker og gentages tre gange. Bagefter blev et Whatmanfifilter (Whatman, Clifton, NJ, USA) brugt til at filtrere ekstraktet. Til sidst, ved at reducere trykket, blev opløsningsmidlet skilt fra ekstrakten, og ekstraktet blev opsamlet som et fast tørstof efter afdampning af methanol. Den ekstraherede prøve blev opbevaret i køleskab ved 4 ◦C indtil videre brug. 2.2. Gaschromatografi og massespektroskopianalyse. Rødbedeskrællens methanolekstrakt (BPME) blev injiceret i en silicakapillærsøjle (30 m × {{60}},25 mm ID × 0 0,25 µm filmtykkelse) af GC-MS-instrument (Agilent 6890N/5973I, Californien, CA, USA) med en masseselektiv detektor til at detektere de kemiske sammensætninger. Instrumentets temperatur blev indstillet som initial 7{{90}} ◦C, holdt 2 min, til 305 ◦C ved 20 ◦C/min, efterfulgt af at holde i 1 min. Den samlede GC-driftstid blev indstillet til 45 minutter med heliumgassen (99,999 procent) som bæregas (en konstant medhastighed på 1,2 ml/min), 250 ◦C som injektortemperatur og 230 ◦C som ionkilde temperatur. Baseret på GC-MS-spektret blev den relative procentdel af den tilsvarende komponent beregnet, og massespektrene for den ukendte komponent blev identificeret ved sammenligning med de kendte 62,000-mønstre, der er tilgængelige i National Institute of Standard and Technology computerbibliotek (NIST08). 2.3. Cellekulturmaterialer og kemikalier HUVEC'er blev købt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Cellekulturmaterialer såsom Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), EDTA, trypsin og andre blev opnået fra Gibco (Paisley, UK). Penicillin-streptomycin (PS) og føtalt bovint serum (FBS) blev købt fra Hyclone Laboratories, USA. Kemikalier anvendt i det molekylære biologiske eksperiment blev opnået fra Sigma-Aldrich, især MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromid], PI og JC-1-farvning. SYBR Green PCR Master Mix og cDNA-syntesesættet blev opnået fra Qiagen (Hilden, Tyskland). 2.4. HUVEC'er HUVEC'er blev dyrket i DMEM og suppleret med 1 procent PS og 10 procent FBS-kompleks. Celler blev inkuberet i en fugtig atmosfære ved 37 ◦C, 5 procent CO2 og sub-dyrket cirka hver 3. dag. 2.5. Cellelevedygtighed og celleproliferation ved MTT-assay HUVEC'er (1 × 104 celler/brønd) blev dyrket med et vedligeholdelsesmedium og fik lov til at klæbe natten over i en 96-brøndkulturplade. Derefter blev mediet erstattet med et nyt dyrkningsmedium indeholdende stigende koncentrationer af BPME (0, 0,05, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6 og 3,2 µg/mL) i henhold til MTT-analysepladekortet og inkuberet i 24 og 48 timer. h; ubehandlede celler blev anvendt som kontroller. Efter inkubationsperioden blev de eksperimentelle celler behandlet med 20 µL/brønd af 5 mg/mL MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid, der blev opløst i dimethylsulfoxid (DMSO)) og yderligere inkuberet i 4 timer ved 37 ◦C. Derefter blev mediet kasseret, og den producerede lilla formazan blev opløst i 100 µL 100 procent DMSO. Absorbansen af ​​opløsningen blev målt under anvendelse af en mikropladelæser (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) ved 570 nm bølgelængde. Procentdelen (procent) af celleproliferation blev beregnet ved følgende ligning: (absorbans af prøven/gennemsnitlig absorbans for kontrol) x 100. 2.6. Eksperimentelt design Ifølge det foreliggende celleproliferationsassay viste testede lavere koncentrationer af BPME (0,1 og 0,2 µg/ml) prolifererende HUVEC'er og mikrotubulusmorfologi uden toksicitet. Volumener på 0,1 og 0,2 µg/mL dosis af BPME blev udvalgt og behandlet med normale HUVEC'er og 10 mM H2O2--inducerede oxidativt stressede HUVEC'er i 48 timer for at bestemme celleproliferation, antiinflammatoriske, angiogene og apoptotiske potentialer (Figur 1). Køretøjskontrol blev også opretholdt i 48 timer i begge grupper. Quercetin (10 µM) blev anvendt som referencekontrol i begge forsøgsgrupper. Efter inkubation blev de ubehandlede og eksperimentelle celler analyseret for celle- og nuklear morfologi og mitokondriemembranpotentiale ved hjælp af et BDTM MitoScreen (JC-1) Kit; apoptose blev bestemt ved den Annexin V/apoptose-baserede cellesorteringsmetode i andre cytometri. Det oxidative stress, proinflammatoriske og angiogenese-relaterede genekspressionsniveauer blev undersøgt.

2.7. Propidiumiodidfarvningsassay for nuklear skade Cellulære morfologier for karakteristisk nuklear skade, pyknose eller apoptotiske morfologiske ændringer efter behandling med 0.1 og 0,2 µg/mL BPME (med eller uden H2O2) i HUVEC'er blev bestemt ved anvendelse af PI-farvningsanalyse under inverteret fluorescensmikroskopi som beskrevet af Leite et al. [27].

2.8. Assay af mitokondriel membranpotentiale (∆ψm) ved JC-1 Farvefarvning Potentialet for den mitokondrielle membran (∆ψm) blev bestemt ved JC-1 assay for at vurdere mitokondriel effektivitet i vehikelkontrol og {{4} }.1 og 0.2 µg/mL BPME-behandlede HUVEC'er (med og uden H2O2). Kort fortalt blev JC-1-farvningsopløsningen blandet med et lignende volumen dyrkningsmedium og derefter tilsat til de eksperimentelle HUVEC'er og inkuberet i mørke i 20 minutter ved 37 ◦C. Derefter blev det ubundne JC-1-farvestof forsigtigt vasket to gange med 200 µL JC-1-farvningsvaskebuffer ved 4 ◦C. Bagefter blev akkumuleringen af ​​j-aggregeret mod JC-1-farvning observeret under fluorescensmikroskopi ved hjælp af et fluorescensmikroskop, og billeder blev optaget. Derudover blev mitokondriemembranens potentiale målt i flowcytometri ved hjælp af BDTM MitoScreen (JC-1) Kit.

2.9. Annexin V/apoptose-analyse ved hjælp af flowcytometri Det andre cytometri-baserede Annexin V/PI-detektionskit (Sigma Chemicals, USA) metode blev brugt til at kvantificere levedygtige, proapoptotiske, tidlige apoptotiske og nekrotiske celler. Oxidativ stress-inducerede HUVEC'er (1 × 105/brønd) blev udpladet i 24-brøndsplader og inkuberet med BPME (0,1 og 0,2 µg/mL) eller vehikelkontrol for 48 timer. Efter inkubation blev celler inkuberet i 400 µL 5 µL Annexin V-fluorescein isothiocyanat (FITC) og 5 µL PI-holdig bindingsbuffer; efter dette blev cellerne holdt i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) i mørke. Cellerne blev analyseret ved hjælp af andre cytometri (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) for at identificere apoptotiske (PI-negative og Annexin V-positive) og sene apoptotiske (PI-positive og Annexin V-positive) celler [28].

2.10. Kvantitativ realtids-PCR-analyse Fastlane® Cell til cDNA-kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) blev brugt til at ekstrahere totalt RNA og syntese af cDNA fra vehikelkontrol, BPME-behandlede HUVEC'er (med og uden H2O2) ved hjælp af en kvantitativ PCR (qPCR) semiautomatiseret instrument (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ekspressionsniveauer af oxidativt stress, herunder (lipidperoxid, NOS-3), antioxidant (Nrf-2, GSK-3 og GPx), proinflammatorisk (nuklear faktor-κ (NF-κ), tumornekrosefaktor- (TNF-), interleukin-1 (IL-1), vaskulær cellevækstfaktor (VEGF), toll-lignende receptor-4 (TLR-4)) , og vaskulær inflammation (intracellulært adhæsionsmolekyle (ICAM), vaskulært celleadhæsionsmolekyle (VCAM), EDN1 og endotel nitrogenoxidsyntase (eNOS))-relaterede gener og referencegenet, -actin, blev analyseret i HUVEC'er og kvantificeret ved metoden af Yuan et al. [29]. Amplifikationsværdierne (∆Ct) blev beregnet ved forskellen mellem Ct (behandlet) og Ct (kontrol). Genekspression blev plottet under anvendelse af ekspressionen af ​​2−∆∆Ct-værdien.

2.11. Statistisk analyse Alle eksperimenter blev tredoblet, og de resulterende data blev udtrykt som middelværdier ± standardafvigelse (SD). Den statistiske analyse af forskelle mellem grupperne blev udført ved en-vejs variansanalyse (ANOVA) ved brug af SPSS-software (Version 28.5, SAS Institute Inc., Cary, NC, USA). Derefter blev Tukeys multiple sammenligningstest udført, hvis der blev fundet signifikante forskelle. Alle resultaterne blev præsenteret som middelværdien ± SD for seks replikationer i hver gruppe. En p-værdi < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" signifikant="">

Cistanche til forbedring af immunitet

3. Resultater

3.1. Bioaktive molekyler i BPME De kemiske bestanddele af BPME blev bekræftet ved anvendelse af GC-MS (Turbomass, PerkinElmer). Den kemiske sammensætning af rødbedeskrælekstrakt blev bestemt ved at sammenligne de tilgængelige massespektre med National Institute of Standard and Technology (NIST) Spectral-database. GC-MS-resultaterne bekræftede, at BPME indeholdt hydroxyacetone (8,18 procent), 5-hydroxymethylfurfural (32,6 procent), methylpyruvat (15,13 procent), beta-d-allopyranose (1,48 procent), furfural (9,98 procent), 2-hydroxy-gamma-butyrolactone (1,32 procent) og 2,3-dihydro-3,5-dihydroxy- 6-methyl-4H-Pyran -4-én (12,4 procent; figur 2a, tabel 1). 3.2. Celleproliferation In vitro-celleproliferationspotentialet af BPME mod HUVEC'er er vist i figur 2b. Ingen signifikant cellevækstinhibering blev observeret i forsøgsgrupperne sammenlignet med vehikelkontrollen. Det blev bekræftet af denne undersøgelse, at en stigning i koncentrationen af ​​BPME behandlet med HUVEC'er resulterede i øget celleproliferation og levedygtighed efter 48 timer (112 procent) sammenlignet med 24 timers (103 procent) behandling. Derudover bekræftede lysmikroskopiske billeder af BPME-behandlede HUVEC'er efter 48 timer de normale celler med den ensartede form af adhærent cellemorfologi, øget antal prolifererende (replikations) celler uden nogen skade var tydeligt (figur 2c). 3.3. Analyse af celle- og nuklear morfologi, mikrotubulidannelse og JC-1-farvning i HUVEC'er. Figur 3 viser morfologien af ​​mikrotubulusudvikling i FL-fluorescensmikroskopiske billeder. H2O2--inducerede oxidativt-stressede HUVEC'er viste dårlig proliferation og uregelmæssig morfologi af adhærente celler sammenlignet med kontrol-HUVEC'er. Normale HUVEC'er behandlet med 0,2 µg/mL BPME viste prolifererende celler via replikation eller neogenese med mikrotubulusmorfologi. I mellemtiden viste 0.1 µg/mL dosis af BPME-behandlede celler 100 procent adhærente celler med tidlige stadier af mikrotubuli. Oxidativ-stressede HUVEC'er behandlet med 0,2 µg/ml BPME identificerede prolifererende nye celler med mikrotubulusmorfologi og nedsat oxidativ cellulær skade. Derudover øgede 0,1 µg/ml BPME også den normale vaskulære cellemorfologi med prolifererende celler.

Figur 4a viser den normale morfologi af den nukleare struktur, med en sfærisk form, i kontrol- og BPME (0.1 eller 0.2 µg/mL)-behandlede HUVEC'er. Figur 4b viser billederne for PI-farvning af normale og HUVEC'er med oxidativ stress induceret af H2O2. H2O{{10}}behandlede HUVEC'er viser kerner med uregelmæssige former, der udviser kondensering og pyknose efter 30 min. Imidlertid viste 0,2 µg/mL BPME-behandling for HUVEC'er under oxidativ stress cirkulære kerner med normal morfologi. Sammenlignet med 0,2 µg/mL BPME-ekstrakt havde 0,1 µg/mL BPME en mindre beskyttende effekt mod H2O2--induceret oxidativ stress i HUVEC'er.

Figur 2. Resultater for GC-MS-kromatogram af rødbedeskræl-methanolekstrakt (a), in vitro-celleproliferation (b) og lysmikroskopibilleder for cellemorfologi (c) i HUVEC'er, behandlet med stigende koncentration af rødbedeskræl-methanolekstrakt (BPME) ) (ensartet form af klæbende og prolifererende celler nævnt med rød pilespids). Alle værdier er middelværdier ± SD (n=6). * p Mindre end eller lig med 0.05 sammenlignet med køretøjskontrol.

Figur 3. Analyse af mikrorørdannelse baseret på fluorescensmikroskop i vehikelkontrol, 0.1 og 0.2 µg/mL dosis af rødbedeskræl-methanolekstrakt (BPME) behandlet normal og H2O{{6} }inducerede oxidativt stressede HUVEC'er efter 48 timer. Efter 48 timer viste H2O2-inducerede oxidativt stressede HUVEC'er ændret morfologi sammenlignet med vehikelkontrol. Mængder på 0.1 og 0,2 µg/mL af rødbedeskræl-methanolekstrakt (BPME)-behandlede HUVEC'er viste normal morfologi med vaskulære mikrotubuli med prolifererende celler, der lignede den almindelige morfologi af glatmuskelcelleadfærd.

Figur 4. Propidiumiodid (PI)-farvningsanalyse for nuklear morfologi i vehikelkontrol, 0.1 og 0.2 µg/mL af rødbedeskræl-methanolekstrakt (BPME)-behandlet normal (3a) og H2O2-induceret oxidativt stressede (3b) HUVEC'er efter 48 timer. Ved PI-farvning viste vehikelkontrol, at kernen så ud til at være normal uden tegn på krympet, pyknose eller apoptotisk kerne. I H2O2 alene viste behandlede celler en polariseret nuklear membran efter 48 timer. Behandling med 0.2 µg/mL BPME normaliserede den H2O2-inducerede kernemembranpolarisering sammenlignet med 0.1 µg/mL BPME eller Quercetin 10 µM.

Figur 5a viser JC-1-farvningsresultaterne for HUVEC'er, inklusive kontrol- og BPME-behandlede celler; figuren illustrerer raske celler med aktive mitokondrier, som bekræftet af den negativt ladede mitokondrieoptagelse af den ekstramitochondriale lipofile kationiske JC-1 (grøn farve) og J-aggregater omdannet med rød farve intramitochondrielt. Figur 5b viser JC-1-farvningsresultaterne for 0.2 µg/mL BPME administreret til HUVEC'er med oxidativ stress induceret af H2O2; resultaterne bekræftede, at næsten 94 procent af negativt ladede mitokondrier konverterede den lipofile kationiske JC-1 (grøn farve) til røde farve J-aggregater sammenlignet med 0,1 µg/ml BPME (61,4 procent) behandling eller H2O{{20}}induceret oxidativ stress i HUVEC'er (2 procent). Det mitokondrielle membranpotentiale (MMP) blev observeret at være højere i BPME-behandlede celler sammenlignet med referencelægemidlet quercetin. 3.4. FACS-assisteret mitokondriel membranpotentiale (∆ψm; BD MitoScan) og Annexin V/apoptoseanalyse i HUVEC'er Figur 6 viser mitokondriel membranpotentialekapacitet i BD MitoScan-analyse efter 0.2 µg/mL HUVEC-behandling af normal BPME-behandling og HUVEC'er med oxidativ stress induceret af H2O2. Vi fandt, at 0,2 µg/mL BPME-behandling øgede MMP (∆ψm) til 92,7 procent ± 3,7 procent sammenlignet med HUVEC'er behandlet med H2O2 alene (27,9 procent ± 7,2 procent). I modsætning hertil viste quercetin-behandlede celler en 41,4 procent ± 1,6 procent procentdel af øget MMP (∆ψm) sammenlignet med HUVEC'er behandlet med BPME og H2O2 eller H2O2 alene.

Figur 5. Analyse af mitokondrielt membranpotentiale ved brug af JC-1-farvning til vehikelkontrol, 0.1 og 0.2 µg/mL rødbedeskræl-methanolekstrakt (BPME) behandlet normalt (a ) og H2O2-induceret oxidativt stressede (b) HUVEC'er efter 48 timer. JC{{10}}flfluorescensbilleder, der viser flettede billeder af farvestoffets røde og grønne signaler, svarende til JC-1 i J-aggregater vs. monomer form. Vi fandt færre J-aggregater H2O2 alene behandlede HUVEC'er. I 0.2 µg/mL BPME-behandlede HUVEC'er, der viser høje j-aggregater, der direkte repræsenterer (høj MMP, ∆ψm) højt mitokondriemembranpotentiale sammenlignet med 0,1 µg/mL BPME eller 10 µM Quercetin.

4. Diskussion

Ved ekstracellulært eller intracellulært stress overhaler biotilgængeligheden af ​​reaktive oxygenarter (ROS) antioxidantforsvaret, og oxidativt stress forstyrrer redoxsignalering og kontrol [31]. Udviklingen af ​​oxidativt stress er forbundet med patogeneserne af kroniske lidelser, såsom neurodegenerative sygdomme, diabetes og aterosklerose. Såsom oxidativ stress initierer endotel dysfunktion og fremmer systemisk inflammation og rekruttering af makrofager [32]. Aktiverede immunceller migrerer ind i vaskulaturen og frigiver cytokiner og kemokiner forbundet med vasokonstriktion og remodellering af glatte muskelcellers blodkar og inflammation, der påvirker vaskulære glatte muskelceller og den vaskulære væg [33]. Øget vaskulær oxidativ stress ender med vaskulær skade, glatte muskelcellers stivhed og strukturelle elastin-abnormiteter. Derudover er vaskulært oxidativt stress blevet stimuleret under andre patologiske tilstande, såsom visceral fedme eller aterosklerose, på grund af øget NADPH-oxidase (NOX-2) aktivitet i perivaskulært fedtvæv [34]. Vaskulært oxidativt stress forårsager vigtigste epigenetiske ændringer, der opstår under aldring, og det ender med en tidlig aldringsproces [35]. Udvikling af ROS-produktion og oxidativ stress i det biologiske system afhænger i høj grad af mitokondriel dysfunktion, foruden NOX-2, endotelial xanthinoxidase, ukoblet eNOS og lipoxygenase [36]. Antioxidantegenskaber af diætmidler kan neutralisere ROS-generering via øget antioxidantkapacitet [26]. Ginkgo Biloba-ekstrakt beskytter mod udviklingen af ​​åreforkalkning ved at reducere ROS-generering og lipoxygenaseaktivitet i OxiLDL-induceret endoteldysfunktion [37]. Derudover forskellige phenolforbindelser ogflavonoider fraspiselige planter og korn har egenskaben til at fjerne ROS og lipidperoxidation [38]. Rødbedeskræl (Beta vulgaris) methanolisk ekstrakt har antioxidantpotentiale på grund af tilgængeligheden af ​​høj fiber, anthocyaniner og flavonoider såsom vitexin og betanin [39]. I den nuværende undersøgelse blev BPME udvalgt til at identificere den mitokondrieafhængige mekanistiske tilgang for at opdage dens effekt på mitokondriemembranpotentialet, LPO-slukning og inhibering af vaskulær inflammation-relaterede mRNA-ekspressionsniveauer. MTT-assay bekræftede, at BPME signifikant øgede celleproliferationen, som bekræftet af den øgede nukleare integritet i PI-farvning med den effektive dosis på 0,2 µg/mL BPME versus testet 0,1 µg/mL af BPME. Identifikation af effektiv dosis med lav koncentration og højeste aktivitet kan betragtes som fysiologisk sikker. Vi fandt FL-fluorescensmikroskopisk farvning af JC-1, og mitokondriemembranpotentialet blev genoprettet både i normal og H2O{{10}}-induceret eksternt stimulerede oxidativt-stressede HUVEC'er efter 0,2 µg/mL BPME behandling. Mitokondriel dysfunktion ændrer oxidativ phosphorylering, som ikke formår at omdanne oxygen (O2·−) radikaler til H2O2 og H2O af glutathionperoxidase. På grund af utilstrækkelig ROS-afgiftning eller ukontrolleret ROS-produktion er øget mitokondriel oxidativ stress forbundet med åreforkalkning [40]. Rødbedeskrælekstrakter genoprettede effektivt mitokondriemembranpotentialet, hvilket med succes øgede ROS-afgiftning og H2O2-generering. Annexin V/PI-farvningsanalyse bekræftede, at BPME-behandling bibeholdt procentdelen af ​​levedygtige celler og forbedrede celleproliferationsstadiet både i normale HUVEC'er og HUVEC'er med oxidativ stress induceret af H2O2. I denne sammenhæng har Choo et al. [41] bekræftede, at efter generering af overdreven ROS eller eksogen H2O2 på det iskæmiske sted, kan transplanterede mesenkymale stamceller (MSC'er) svække selvproliferation og multi-lineage kapacitet. I regenerativ medicin er vaskulære glatte muskelceller de vigtigste regulatorer af de kontraktile tonusarterier via opretholdelse af arteriel perifer modstand, blodtryksregulatorer, blodkammerater og reparation af arterier [42]. Derudover er aldersinduceret fænotypemodulation af EC'er forbundet med nedsat cellulær kontraktilitet og øget celleældning. Ved kontinuerlig stress eller på grund af reduceret mekanosensitivitet identificeres nedsat tilpasning af mikromiljøsignaler i gamle glatte muskelceller [43]. De nuværende resultater bekræftede, at BPME-behandlingen opretholdt den levedygtige cellepopulation, som det fremgår af angiogenesekapaciteten. Den identificerede spredningskapacitet af BPME på HUVEC'er er blevet understøttet af reduktionen i LPO-ekspression og øgede antioxidant-genekspressioner. ROS og LPO genereres oprindeligt fra mitokondriekomplekset (I og III) og NOX-4 under celleproliferation eller -differentiering [44]. Overdreven ROS reagerer og beskadiger biomolekylerne, især ændrer integriteten af ​​genomisk DNA, som er kritisk for cellulær spredning og funktioner [45]. Det er dog blevet bekræftet, at kostens indtagelse af antioxidante polyfenoler, såsom epigallocatechin og tocopherol, beskytter cellerne mod oxidativt stress og øger spredningskapaciteten [46]. I vores undersøgelse faldt mRNA-ekspressionsniveauerne af LPO, og NOS-3, Nrf-2 og eNOS blev fundet at være øget to gange i HUVEC'er med oxidativt stress induceret af H2O2. eNOS er den dominerende isoform af NOS, ansvarlig for de fleste NO·produkter i glatte muskelceller og vaskulært væv. NO· udvider alle typer vaskulære kar og beskytter blodpladeaggregation og leukocytadhæsion i EC'er [47]. Hidtil har der været mange modstridende rapporter om kardiovaskulære risikofaktorer, og endoteldysfunktion har været forbundet med nedsat eller øget eNOS-ekspression [48]. Forhøjet ekspression af eNOS observeret ved vaskulær sygdom, hvilket sandsynligvis er en konsekvens af den overskydende produktion af H2O2. O2·−, et dismutationsprodukt, kan øge eNOS-ekspression gennem transkriptionelle og post-transkriptionelle mekanismer [49]. Patogenese af den vaskulære sygdom er ledsaget af en accelereret nedbrydning af NO· efter reaktion med O2·− og endelig ONOO−form, hvilket fører til eNOS-afkobling og NOX-enzymdysfunktion [50]. Oxidativt stress er blevet undertrykt af antioxidantenzymer, og mRNA-niveauer af GSK-3 og GPX er blevet øget efter BPME-behandling. BPME indeholder flere fytokemikalier, der er biologisk aktive, herunder betalainer, flavonoider, polyphenoler, terapeutiske enzymer, ascorbinsyre, dehydroascorbinsyre (DHAA) og uorganisk nitrat (NO3), og disse kan være involveret i opreguleringen af ​​antioxidantkapaciteten i HUVEC'er. I denne sammenhæng har Cha et al. (2014) [51] rapporterede, at chlorogensyre effektivt beskytter mod oxidativ stress-induceret DNA-skade i humane keratinocytter. Endothelin-1 (Edn-1), en endotelafledt vasokonstriktor, udfører glatmuskelcellemigration og fungerer som en antiapoptotisk faktor i celler med nitrogenoxid-induceret stress [52,53]. Processerne med vaskulær ombygning, migration, proliferation og ekstracellulær matrixakkumulering er blevet stimuleret af både Edn-1 og NO [54,55]. Vi observerede øget Edn-1-ekspression efter BPME-behandling i HUVEC'er med oxidativt stress. Ved oxidativ stress eller LPO-akkumulering er det tidlige stadie af vaskulær inflammation adhæsionen af ​​leukocytter til glatte endotelceller, det er fremtrædende for de kritiske begivenheder af iskæmi og åreforkalkning [56]. Det medieres af VCAM- og ICAM-udtryk; det er blevet stimuleret af mange af kemokinerne og kemotaksemidlerne, såsom NF-KB, IL-1 og TNF-ekspressioner [57]. Inhibering af IL-1-aktivering efterfulgt af adhæsionsmolekyleekspression er blevet opnået af den diætetiske phenolforbindelse ellaginsyre [58]. Behandling med BPME til eksternt stimulerede HUVEC'er med oxidativt stress reducerede signifikant de vaskulære cellespecifikke proinflammatoriske faktorer, såsom VCAM, ICAM, NF-KB, IL-1 og TNF-ekspressionsniveauer. I denne sammenhæng har Crespo et al. [59] rapporterede, at kaempferol og quercetin hæmmede pro-inflammatoriske gener, såsom henholdsvis VCAM, ICAM, NF-KB og IL-1 udtryk. Samlet set begunstigede inhiberingen af ​​oxidativ stress og vaskulær inflammation-relateret genekspressionspotentiale af BPME ekspressionen af ​​vaskulære cellevækstfaktorer og hjalp potentielt vaskulær celleproliferation og vækst.

5. Konklusioner

De nuværende resultater bekræfter, at den øgede ekspression af antioxidantgener var forbundet med dæmpning af oxidativt stress, hvilket hjalp med at overvinde svækkelsen af ​​HUVEC-proliferation og angiogenese. Sort hvidløg indeholdende hydroxymethylfurfural undertrykker den inflammatoriske virkning af TNF-induceret monocytcelleadhæsion til HUVEC'er og undertrykker yderligere ROS-generering, VCAM-1-ekspression og NF-KB-aktivering [60]. Derudover har He et al. [61] bekræftede, at hydroxymethylfurfural har potentialet til at beskytte EC'er mod hypoxi. Rødbedeskræller er også blevet identificeret til at omfatte flavonoider, furan og antioxidantkomponenter, såsom 5-hydroxymethylfurfural, methylpyruvat, furfural og 2,3-dihydro-3,5- dihydroxy-6-methyl-4H-Pyran-4-on; disse komponenter er ansvarlige for den forbedrede antioxidantkapacitet og undertrykkelse af proinflammatoriske vaskulære glatmuskelcelleadhæsionsmolekyler. Rødbedeskræl er blevet brugt som et stimulerende middel til antioxidantpuljer for at slukke den ydre stimulus eller indre patologiske stimulus af peroxidativt cellulært stress. Vores resultater viste, at rødbedekomponenterne hjælper med at reducere metabolisk stress og inflammation i HUVEC'er, hvilket kan være gavnligt for vaskulær celleproliferation og angiogenese.

Forfatterbidrag:

Konceptualisering, LNA-H. og S.-BP; metode, LNA-H. og S.-BP; software, GS; validering, LNA-H. og S.-BP; formel analyse, S.-BP, AMA-D., AAA (Ali A Alshatwi) og GS; undersøgelse, LNA-H., S.-BP og AMA-D.; ressourcer, LNA-H.; datakurering, S.-BP og LNA-H.; skrivning — originalt udkast til forberedelse, LNA-H. og S.-BP; skrivning – gennemgang og redigering, LNA-H., AMS, GS og AAA (Amna Abdullah Alotiby); visualisering, S.-BP og AAA (Ali A Alshatwi); supervision, LNA-H. og S.-BP; projektadministration, LNA-H.; finansieringsopkøb, LNA-H. Alle forfattere har læst og accepteret den offentliggjorte version af manuskriptet. Finansiering: Forfatterne takker dekanatet for videnskabelig forskning ved King Saud University for at finansiere dette arbejde gennem forskningsgruppe nr. RG-1442-432. Erklæring fra institutionel revisionsråd: Ikke relevant. Erklæring om informeret samtykke: Ikke relevant. Erklæring om datatilgængelighed : Dataene præsenteret i denne undersøgelse er tilgængelige på anmodning fra den tilsvarende forfatter. Interessekonflikter: Der er ingen interessekonflikt for denne undersøgelse.

Referencer

1. Abdolmaleki, Z.; Arab, H.-A.; Amanpour, S.; Muhammadnejad, S. Antiangiogene virkninger af ethanolekstrakt af Artemisia sieberi sammenlignet med dets aktive stof, artemisinin. Rev. Bras. Farmacogn. 2016, 26, 326-333. [CrossRef]
2. Yoo, SY; Kwon, SM Angiogenese og dens terapeutiske muligheder. Medit. Inflflamm. 2013, 2013, 127170. [CrossRef] [PubMed]
3. Folkman, J. Angiogenese i cancer, vaskulære, reumatoide og andre sygdomme. Nat. Med. 1995, 1, 27-31. [CrossRef]
4. Hoeben, A.; Landuyt, B.; Highley, MS; Wildiers, H.; Van Oosterom, AT; De Bruijn, EA Vaskulær endotelvækstfaktor og angiogenese. Pharmacol. Rev. 2004, 56, 549-580. [CrossRef]
5. Ferrara, N.; Alitalo, K. Kliniske anvendelser af angiogene vækstfaktorer og deres inhibitorer. Nat. Med. 1999, 5, 1359-1364. [CrossRef]
6. Galley, HF; Webster, NR Endotelets fysiologi. Br. J. Anaesth. 2004, 93, 105-113. [CrossRef]
7. Onat, D.; Brillon, D.; Colombo, PC; Schmidt, AM Humane vaskulære endotelceller: Et modelsystem til undersøgelse af vaskulær inflammation i diabetes og aterosklerose. Curr. Diabetes Rep. 2011, 11, 193-202. [CrossRef] [PubMed]
8. Packard, RR; Libby, P. Inflammation i åreforkalkning: Fra vaskulær biologi til biomarkøropdagelse og risikoforudsigelse. Clin. Chem. 2008, 54, 24-38. [CrossRef]
9. Esper, RJ; Nordby, RA; Vilariño, JO; Paragano, A.; Cacharrón, JL; Machado, RA Endothelial dysfunktion: En omfattende vurdering. Cardiovasc. Diabetol. 2006, 5, 4. [CrossRef]
10. Baudin, B.; Bruneel, A.; Bosselut, N.; Vaubourdolle, M. En protokol til isolering og dyrkning af humane navlevene-endotelceller. Nat. Protoc. 2007, 2, 481-485. [CrossRef] [PubMed]
11. Cao, Y.; Cao, R. Angiogenese hæmmes ved at drikke te. Nature 1999, 398, 381. [CrossRef] [PubMed]
12. Yen, G.-C.; Duh, P.-D.; Tsai, H.-L. Antioxidant og pro-oxidant egenskaber af ascorbinsyre og gallussyre. Food Chem. 2002, 79, 307-313. [CrossRef]
13. Dhalaria, R.; Verma, R.; Kumar, D.; Puri, S.; Tapwal, A.; Kumar, V.; Nepovimova, E.; Kuca, K. Bioaktive forbindelser af spiselige frugter med deres anti-aldringsegenskaber: En omfattende gennemgang for at forlænge menneskets liv. Antioxidanter 2020, 9, 1123. [CrossRef] [PubMed]
14. Baião, DdS; da Silva, D.; Del Aguila, EM; Paschoalin, VMF Ernæringsmæssige, bioaktive og fysisk-kemiske egenskaber af forskellige rødbedeformuleringer. Madmisbruger. 2017, 6. [CrossRef]
15. Lalonde, R.; Roitberg, B. Om udviklingen af ​​parringsadfærd i træer: Predation eller vejr? Er. Nat. 1992, 139, 6. [CrossRef]
16. Silva, D.; Baiao, DDS; Ferreira, VF; Paschoalin, VMF Betanin som multipath oxidativ stress- og inflammationsmodulator: Et rødbedepigment med beskyttende virkning på kardiovaskulær sygdomspatogenese. Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 2020, 1-16. [CrossRef]
17. Baiao, DDS; Silva, D.; Paschoalin, VMF Bemærkelsesværdig grøntsag: Dens nitrat- og fytokemiske indhold kan justeres i nye formuleringer til gavn for sundheden og støtte behandlinger af hjerte-kar-sygdomme. Antioxidanter 2020, 9, 960. [CrossRef] 18. Abd El-Ghaffar, EA; Hegazi, NM; Saad, HH; Soliman, MM; El-Raey, MA; Shehata, SM; Barakat, A.; Yasir, A.; Sobeh, M. HPLC-ESI- MS/MS analyse af roer (Beta vulgaris) blade og dets gavnlige egenskaber hos type 1 diabetiske rotter. Biomed. Pharmacother. 2019, 120, 109541. [CrossRef]
19. Singh, B.; Nathan, BS Kemisk sammensætning, funktionelle egenskaber og forarbejdning af rødbeder - en gennemgang. Int. J. Sci. Eng. Res. 2014, 5, 679.
20. Ninfali, P.; Angelino, D. Ernæringsmæssige og funktionelle potentiale af Beta vulgaris cicla og rubra. Fitoterapia 2013, 89, 188-199. [CrossRef]