Passende træningsniveau dæmper tarmdysbiose og øget baldriansyre for at forbedre neuroplasticitet og kognitiv funktion efter operation i mus, del 4

Profilering af tarmmikrobiota

Frisk afføring fra mus blev indsamlet til profilering af tarmmikrobiota. Musene blev anbragt individuelt i et autoklaveret bur til opsamling af afføring og fik lov til at defekere frit. Afføring blev opsamlet straks i de sterile Eppendorf-rør på tøris og derefter opbevaret ved -80 grader indtil videre behandling. Bakterie-DNA blev ekstraheret med et Power Lyzer Power jord-DNA-isoleringskit i henhold til vores tidligere protokoller [11].

Nyere forskning viser, at tarmmikrobiomet har en meget vigtig indflydelse på vores hukommelse. Netop bakterier i tarmmikrobiotaen kan påvirke nervesystemet i den menneskelige hjerne og derved ændre dens hukommelsesfunktion. Dette er et overraskende fund, fordi det betyder, at vi kan forbedre vores hukommelse ved at ændre vores tarmmikrobiom.

Så, som en, der forsøger at forbedre deres hukommelse, hvad kan du gøre for at forbedre dit tarmmikrobiom? Svaret er enkelt: fokus på en afbalanceret kost. En afbalanceret kost hjælper ikke kun med at regulere balancen i din tarmmikrobiota, men forbedrer også alle aspekter af kroppens funktion.

For det første skal vi fokusere på en diversificeret kost, der er rig på kostfibre. En fiberrig kost kan hjælpe med at bevare mangfoldigheden af ​​dit tarmmikrobiom, en nøglefaktor for at fremme et godt helbred. Samtidig skal vi også sikre, at vi indtager nok protein af høj kvalitet og sunde fedtstoffer i vores måltider. Disse næringsstoffer kan fremme hukommelsesfunktion og nerveledning.

Derudover kan regelmæssig motion og stressreduktion også fremme balance og diversitet i tarmmikrobiomet. Uanset om det er dyb vejrtrækning, meditation eller yoga, er disse alle effektive måder at reducere stress på. Motion kan forbedre tarmens kontraktilitet, øge tarmens vitalitet og fremme cyklisk afgiftning og derved bidrage til at fremme balancen og mangfoldigheden af ​​tarmmikrobiota.

Alt i alt bør vi ikke kun fokusere på vores kost og fysiske sundhed, men også vores tarmmikrobiota. Ændring af vores spisevaner og reduktion af stress kan fremme balance og diversitet i vores tarmmikrobiota, hvilket kan hjælpe os med at forbedre hukommelsen og nervesystemets funktion. Så lad os være opmærksomme på vores tarmsundhed sammen og forbedre vores hukommelse og fysiske kondition!

Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola er et traditionelt kinesisk medicinsk materiale, der har mange unikke effekter, hvoraf en er at forbedre hukommelsen. Virkningen af ​​Cistanche deserticola kommer fra de mange aktive ingredienser, den indeholder, herunder garvesyre, polysaccharider, flavonoidglykosider osv. Disse ingredienser kan fremme hjernens sundhed på en række forskellige måder.

Klik på kender måder at forbedre hjernens funktion

Sekvenseringsbiblioteker af den hypervariable V3-V4-region blev forberedt i henhold til Illumina MiSeq-systeminstruktionerne. Kort fortalt blev 12,5 ng DNA anvendt som en DNA-skabelon til den første 16 S rRNA PCR. De anvendte primere var som følger: F: 5'-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3′og R: 5'-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3.
Amplikonerne blev derefter renset op med AMPure XPmagnetic beads og derefter brugt til Index PCR ved at bruge Nextera XTIndex Kit. Qubit dsDNA HS assaykit og TapeStation højfølsomhed D1000ScreenTape (Agilent, Blacksburg, VA, USA) blev brugt til at måle koncentrationerne af PCR-produkter og normalisere mængden til biblioteksforberedelse.

Sekventering blev udført på et Illumina MiSeq-instrument af MiSeq reagenskit v2 (500 cyklusser). Data blev analyseret med MiSeqReporter-softwaren Metagenomics workflow v2.5.1.3 (Illumina, San Diego, CA, USA). De parrede læsninger opnået ved dobbeltterminal sekventering blev splejset til en sekvens gennem Pandaseq-software. De lange aflæsninger med højvariable områder blev opnået.

De aflæsninger, hvis gennemsnitlige phred-score i vinduet (5 bp i størrelse, 1 bp trinlængde) var mindre end 20, blev trimmet. Aflæsninger, der indeholdt tvetydigt "N" eller med længde < 220 bp, blev kasseret. Efter kvalitetskontrol af de originale data, Højkvalitetssekvenser uden kimærer blev arrangeret i overensstemmelse med overflod fra store til små og derefter grupperet med 97% lighed i Operational Taxonomic Units (OTU). Hver OTU blev anset for at repræsentere en art. For at undgå analyseafvigelser forårsaget af de forskellige størrelser af prøvesekventeringsdata blev antallet af læsninger til OTU indtastet i henhold til det minimale sekvensnummer matchet med OTU, når sekventeringsdybden var tilstrækkelig. Alfa-diversitet blev analyseret ved tilfældig nivellering.

ARead blev ekstraheret fra hver OTU som en repræsentativ sekvens. Den repræsentative sekvens blev sammenlignet med den ribosomale database projektdatabase. Arter blev klassificeret for hver OTU, og artsoverflodstabeller blev opnået til efterfølgende analyse. OTU-plukning blev udført ved hjælp af Uclust på softwareplatformen QIIME v1.9.1.

Alfa-diversitet inklusive Chao1-indekset og varedækningsindeks blev brugt til analyse af artsdiversitet i en prøve. Beta-diversitetsanalyse blev brugt til at sammenligne forskelle i artsdiversitet blandt prøver og karakteriseret ved principal koordinatanalyse (PCoA) baseret på Bray-Curtis-afstanden. Forskellene mellem grupperne blev testet ved analyse af lighed (ANOSIM).

Plasma SCFA profilering

Plasma SCFA-koncentrationer blev kvantificeret ved hjælp af en 7890-5977 gaskromatografi-massespektrometri (GC-MS, Agilent, Blacksburg, VA, USA). Plasmaprøver blev indsamlet fra mus på tidspunkter beskrevet ovenfor, opbevaret ved -8{ {20}} grader hurtigt og derefter optøet til stuetemperatur til behandling. Kort fortalt blev en 100 µl plasmaprøve hvirvelblandet med 900 ulethanol (indeholdende 0,5 % HCI, vol/vol). Ultralydsbehandling blev påført i 40 minutter, og derefter blev prøverne centrifugeret ved 14,000 RPM i 10 minutter. Supernatanten af ​​prøver blev målt ved GC-MS-analyse på en Agilent 7890-5977 GC-MS med elektronpåvirkningsionisering og en DB-FFAP-kapillærsøjle (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm).

Kortikal baldriansyre kvantificering

Mængden af ​​baldriansyre i cerebral cortex høstet 24 timer efter den sidste intraperitoneale injektion af baldriansyre blev bestemt ved en metode svarende til den tidligere rapporterede [51, 52]. Kort fortalt blev 0,1 g cerebral cortex homogeniseret i 500 µl vandig acetonitril. Supernatanten blev ekstraheret med 8 ml ekstraktionsbuffer (hexan:diethylether=1:1) og centrifugeret ved 1800 g i 5 minutter. 7,5 ml supernatant blev opsamlet, blandet med 93 µl 20 mMKOH i methanol og tørret ved 40 grader under nitrogengas. Den tørrede rest blev rekonstitueret i 50 µl 2,5 % 18-Crown-6 i acetonitril og blev yderligere derivatiseret med 9-chlormethylantracen i acetonitril med tilsætning af oftetramethylammoniumhydroxid.

Til sidst blev 30 µl derivatiseringsopløsning fyldt på Acclaim C18-søjlen (3 µm, 4,6 × 100 mm, Thermo Scientific) og adskilt i Ultimate 3000 højtydende væskekromatografi (HPLC, Thermo Scientific) udstyret med UV-synlig detektor. Toppen af ​​derivatiseret baldriansyre blev detekteret ved en bølgelængde på 254 nm.2-Ethylsmørsyre (2-EA) blev tilsat som en intern referencekontrol. Toparealet af baldriansyre blev målt som mAU*min og dets topareal af hver prøve blev normaliseret med det for 2-EA i prøven. De endelige resultater blev præsenteret som forhold mellem valerianesyregruppen og NS-gruppen.

Høst af hjernevæv

Mus blev vejet og bedøvet med isofluran 6 timer, 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer og 7 dage efter operationen og perfunderet med 4 grader NS til hjernevævshøstning. Disse hippocampi blev brugt til ELISA-analyse eller RNA-assay. Hele hjernen ved Bregma -3 til -6 mm blev brugt til immunfluorescerende farvning. Alle dissektionsprocedurer blev udført på is.

mRNA-biblioteksforberedelse og Illumina Hiseq-sekventering

The hippocampi harvested at 24 h after surgery from the control group, surgery group, and Exe+Sur group in the first experiment were placed in liquid nitrogen for 1 h and then stored in a −80 °C freezer quickly for no >En uge. RNA-oprensning, revers transkription, bibliotekskonstruktion og sekventering blev udført på WuXi NextCODE i Shanghai i henhold til producentens instruktioner (Illumina).

De mRNA-fokuserede sekventeringsbiblioteker fra totalt RNA blev fremstillet ved hjælp af Illumina TruSeq® RNA-prøvepræparationssættet. PolyA-mRNA blev oprenset fra totalt RNA under anvendelse af oligo-dTattached magnetiske perler og derefter fragmenteret med fragmenteringsbuffer. Ved at tage disse korte fragmenter som skabeloner blev førstestrengs cDNA syntetiseret ved hjælp af revers transkriptase og tilfældige primere, efterfulgt af anden-strengcDNA-syntese. Derefter blev det syntetiserede cDNA udsat for endereparation, phosphorylering og 'A'-baseaddition i henhold til Illuminas bibliotekskonstruktionsprotokol.

Illumina-sekventeringsadaptere blev tilføjet til cDNA-fragmenterne. Efter PCR-amplifikation til DNA-berigelse blev AMPure XPBeads (Beckman) brugt til at rense målfragmenterne på 200-300 bp. Efter bibliotekskonstruktion blev Qubit 3.0 fluorometer dsDNA HS Assay (Thermo Fisher Scientific) bruges til at kvantificere koncentrationer af de resulterende sekventeringsbiblioteker, mens størrelsesfordelingen blev analyseret ved hjælp af Agilent BioAnalyzer 2100 (Agilent). Sekventering blev udført ved hjælp af et Illumina-system efter Illumina-leverede protokoller til 2 × 150 parret ende-sekventering i Shanghai, Kina, Next.

Hippocampus mRNA-ekspression ved kvantitativ polymerasekædereaktion (Q-PCR)

Hippocampus høstet 24 timer efter operationen fra kontrolgruppen, træningsgruppen, operationsgruppen, Exe+Sur-gruppen, Trans-Control+Sur-gruppen, Trans-Exe+Sur-gruppen, Exe+Sur+NS-gruppen og Exe+Sur+ Val-gruppen blev anbragt i flydende nitrogen i 1 time og derefter opbevaret i -80 graders fryser i ikke mere end 3 dage. RNA-ekstraktion, RNA-til-cDNA revers transkription og q-PCR blev udført som vi tidligere har beskrevet [49, 53]. Kort fortalt blev RNA ekstraheret med RNeasy Micro kit. Omvendt transskription blev afsluttet ved at bruge 5X All-in-One MasterMix. Endelig blev et CFX connect real-time system (Bio-Rad) brugt til kvantitativ kvantificering. Primere for qPCR var: C3ar1-F:TGGGCTGGTGCTGTGGGTAG og C3ar1-R: GATGGCGAAGGCGGTTCTCAC. Relativ genekspression for C3ar1 blev beregnet ved hjælp af den sammenlignende tærskelcyklus ΔΔCt og husholdningsgen-actin til normalisering af genetekspression. mRNA-niveauerne for målgener udtrykkes som foldstigninger i forhold til henholdsvis den relevante gruppe.

Cytokiner og GDNF-bestemmelse i hippocampus

IL{{0}}, IL-6, C3 og GDNF i hippocampus blev påvist ved brug af ELISAkits. Til test af IL-1, IL,-6 og GDNF blev hjernevæv homogeniseret på is i RIPA-bufferen indeholdende 25 mM Tris-HCl med pH 7,6, 150 mMNaCl, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS og en proteaseinhibitorcocktail indeholdende 10 mg/ml aprotinin, 5 mg/ml pepstatin, 5 mg/ml leupeptin og 1 mM phenylmethansulfonylfluorid.

Til C3-testning blev hjernevæv homogeniseret på is i PTR-bufferen (leveret i sættet). Supernatanten blev opsamlet til ELISA-detektion, efter at homogenatet var centrifugeret ved 13, 000 g i 20 minutter ved 4 grader, og proteinkoncentrationen blev bestemt ved BCA-proteinassayet (Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts, UK). IL-1, IL6, C3 og GDNF i supernatanten af ​​hjernen blev påvist i henhold til producentens instruktion for ELISA, og mængden af ​​dem i hver prøve i hjernen blev normaliseret af dens totale proteinindhold og blev udtrykt som pg/ mg protein.

Vestlig blotting

Western blotting blev udført som tidligere beskrevet [49]. Kort fortalt blev proteinkoncentrationer af prøver bestemt ved hjælp af BCA-proteinassayet. Tyve mikrogram af hver prøve blev udsat for Westernblotting-analyse ved anvendelse af følgende primære antistoffer: kanin polyklonalanti-postsynaptisk densitetsprotein 95 (PSD95) ved 1:1000 fortynding, kaninpolyklonal anti-synapsin 1 ved 1:1000 fortynding og kanin anti{10}} tubulinantistof ved 1:1000 fortynding. Billeder blev scannet af en Image Master IIscanner (GE Healthcare, Milwaukee, WI, USA) og analyseret ved hjælp af ImageQuant TL software v2003.03 (GE Healthcare). Båndsignalerne fra interesserede proteiner blev normaliseret til dem for det tilsvarende tubulin og udtrykt som fraktioner af kontrolprøven fra de samme geler.

Immunfluorescerende farvning

Den immunfluorescerende mærkning og kvantificering af farvningen blev udført som vi har beskrevet før [6, 54]. Kort fortalt blev hjernen fikseret i 4 % paraformaldehyd ved 4 grader i 24 timer og derefter inkuberet i 30 % saccharose natten over ved 4 grader, før den blev frosset i optimal skæretemperaturforbindelse. Koronale 20- µm tykke sektioner blev skåret sekventielt fra Bregma −3 til −6 mm ved hjælp af en kryostat og monteret på objektglas.

Efter at være blevet vasket i Tris-pufret saltvand (TBS), blev sektioner blokeret i 10% æselserum plus 1% bovint serumalbumin (BSA) i TBS indeholdende 0,3% triton-X100 i 2 timer ved stuetemperatur og derefter inkuberet ved 4 grader natten over med følgende primære antistoffer: kanin monoklonalt anti-C3 antistof (1:50), gedemonoklonalt anti-GFAP antistof (1:200), rotte monoklonalt anti-C3ar antistof (1:50) og kanin monoklonalt anti-Iba{{ 21}} antistof (1:200).

Sektioner blev skyllet i TBS med 0.1% Triton-x 100. Æsel-anti-kanin-IgG-antistoffet konjugeret med Alexa Fluor 594 (1:200), æsel-anti-ged-IgG-antistof konjugeret med Alexa Fluor 488 (1:200) Æsel-anti-rotte-IgG-antistof konjugeret med AlexaFluor 594 (1:200) eller æsel-anti-kanin-IgG-antistof konjugeret med AlexaFluor 647 (1:200) blev inkuberet med sektionerne i 1 time ved stuetemperatur i mørke.

Sektionerne blev vasket i TBS, inkuberet med Hoechst 33342 (1:1000) til nuklear farvning, skyllet og monteret med Vectashield monteringsmedium (H-1000; Vector Labs, Burlingame, CA). Billeder af immunfarvning blev erhvervet ved z-stack med et LSM710 mikroskopisystem (ZEISS), og en negativ kontrol, der udelod inkubationen med det primære antistof, blev inkluderet i alle eksperimenter.

Kvantificeringen blev udført som beskrevet tidligere [6, 54]. Kort fortalt blev hele dentate gyrus (DG)-regionen, der var dækket af 2-3 ikke-overlappende felter fra hver af de seks sekventielle hippocampus-sektioner af en mus, afbildet. Antallet af pixels perimage med intensitet over et forudbestemt tærskelniveau blev betragtet som et positivt farvet område for en interesseret markør og kvantificeret ved hjælp af theImage-pro plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, USA) og præsenteret som en procentdel af positivt areal i det samlede areal. Seks målinger pr. mus blev derefter beregnet som gennemsnit for at afspejle niveauet af positiv farvning. Alle kvantitative analyser blev udført på en blind måde.

BrdU-administration og immunfluorescerende farvning

Syv dage efter operationen fik mus 7 på hinanden følgende intraperitonea-lektioner af 80 mg/kg 5'-brom-2'-deoxyuridin (BrdU) ved middagstid én gang dagligt som tidligere beskrevet [14]. Mus blev aflivet 5 dage senere for at høste hippocampus. Hippocampus blev fikseret i 4 % paraformaldehydein 0.1 M phosphatbufret saltvand ved 4 grader i 24 timer og indlejret inparaffin. Fem mikron tykke koronale hjernesektioner blev skåret sekventielt fra Bregma -2 til -4 mm. Antigenhentning blev udført ved at inkubere sektioner med natriumcitratbuffer indeholdende 1 0 mM natriumcitrat, 0,05 % Tween 20 (pH 6,0) ved 95-100 grader i 20 min.

DNA-denaturering blev udført ved at inkubere med 1 N HCl på is i 3 minutter, 2 N HCL ved stuetemperatur i 3 minutter og ved 37 grader i 6 minutter. Sektioner blev blokeret med 5 % æselserum i phosphatpufret saltvand (PBS) indeholdende 0,5 % triton-X 100 i 2 timer ved stuetemperatur. Sektionerne blev derefter inkuberet natten over ved 4 grader med følgende primære antistoffer: rottemonoklonalt anti-BrdU-antistof (1:100) og gedemonoklonalt anti-GFAP-antistof (1:200). Sektionerne blev inkuberet med æsel anti-rotte IgGantibody konjugeret med Alexa Fluor 594 (1:200) eller æsel anti-ged IgGantibody konjugeret med Alexa Fluor 488 (1:200) i 1 time ved stuetemperatur i et mørkt rum. Efter at være blevet vasket i PBS, blev sektioner modfarvet med Hoechst 33342 (1:1000), skyllet og monteret med Vectashield monteringsmedium (Vector Labs).

Billeder blev optaget med et fluorescensmikroskop med et ladningskoblet enhedskamera (High MagOlympus BX51) og et LSM710 konfokalmikroskopisystem (ZEISS). Anegativ kontrol, der undlod inkubationen med det primære antistof, var inkluderet i alle eksperimenter. For hver musehjerne blev seks sekventielle hippocampale sektioner brugt til celletælling. Antallet af alle celler, der var positivt farvet for en interesseret markør eller kombinationen af ​​to markører i den sub-granulære zone af DG'et i hver sektion blev talt. De kvantitative analyser blev udført på en blind måde.

Golgi plet

Golgi-farvning blev udført ved hjælp af FD Rapid GolgiStainTM Kit. Nitten dage efter operationen blev hjernen fra 6 mus i hver gruppe nedsænket i imprægneringsopløsningen (opløsning A og B: 1:1) i 2 uger og derefter overført til opløsning C i 3 dage. Koronale hjernesektioner i en tykkelse på 100 μm og omkring -2,7 mm fra bregma blev skåret på en vibratom (Microslicer® 10110, Ted Pella, Inc. Californien, USA).

Som beskrevet før[55, 56] blev mere end 10 godt individualiserede neuroner i DG-regionen af ​​hippocampus tilfældigt udvalgt fra hver mus, og sekventialoptiske flerlags scanningsbilleder blev taget med et interval på 2,0 μmal langs z-aksen (3DHISTECH, Pannoramic MIDI, Ungarn) med 20 ×mål. De flerlags scanningsfiler blev overlejret for at blive en klar scanningsfil, der kan ses med Caseviewer (3DHISTECH, Ungarn) på en computer. Det samlede grennummer og dendritiske længde blev målt af Fiji-software (Fiji-win64, NIH, USA). Kompleksiteten af ​​samlede dendritiske træer (skæringspunkter) blev estimeret ved hjælp af Sholl-analyse. Til måling af rygsøjlens tæthed blev 5 neuroner udvalgt fra hvert dyr.

Fem tilfældigt udvalgte mikroskopiske felter ved de apikale eller basale dendritter blev fotograferet fra scanningsfilerne. Rygsøjlens tal i 40 μm-segmenter blev talt af en observatør, der var blind for gruppetildeling. Resultaterne blev udtrykt som antallet af rygsøjler/10 μmsegmenter. Dataene for dendritiske grental, længde og skæringspunkter samt rygsøjlens tæthed fra én mus blev beregnet som gennemsnit for at afspejle musens niveau.

Statistisk analyse

Prøvestørrelsesberegning for hvert eksperiment blev ikke udført. Bestemmelsen af ​​prøvestørrelse var for det meste baseret på vores erfaring: større prøvestørrelser blev brugt til eksperimenter, der testede læring og hukommelse end dem til biokemiske undersøgelser. Alle data, der blev indsamlet, blev inkluderet i analyser. Manglende data omfattede de dyr, der opfyldte forudbestemte eksklusionskriterier for træningstræning, og dyr, der døde inden den tilsigtede observationsperiode. Antallet af dyr, der bidrog med data til analyse for hver forsøgstilstand, er angivet i legender.

Resultater præsenteres som middel ± SD (normalfordelingsdata) eller median ± interkvartilområde (ikke normalfordelingsdata) med præsentation af individuelle dyredata i søjlediagrammet og middelværdier ± SD i linjeplottene. Data fra træningssessionerne i BarnesMaze blev analyseret ved to-vejs gentagen variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukeys test.

Tarmmikrobiotadata blev analyseret som beskrevet i afsnittet Tarmmikrobiotaprofilering. De andre data blev analyseret ved en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey-testen, hvis dataene var normalfordelt, ved envejs ANOVA på rang efterfulgt af Tukey-testeren Student-Newman-Keuls-metoden, hvis dataene ikke var normalfordelte, ved to-vejs ANOVA , ved t-test eller rangsumtest. En signifikant forskel blev defineret som P < 0.05 baseret på tosidet hypotesetestning.

Der blev ikke foretaget justeringer for flere sammenligninger. Alle statistiske analyser blev udført med SigmaStat (Systat Software, Inc., Point Richmond, CA, USA).

REFERENCER

1. Møller JT, Cluitmans P, Rasmussen LS, Houx P, Rasmussen H, Canet J, et al. Langsigtet postoperativ kognitiv dysfunktion i den ældre ISPOCD1-undersøgelse. ISPOCD-efterforskere. International undersøgelse af postoperativ kognitiv dysfunktion. Lancet.1998;351:857-61.

2. Monk TG, Weldon BC, Garvan CW, Dede DE, van der Aa MT, Heilman KM, et al. Forudsigere for kognitiv dysfunktion efter større ikke-kardial kirurgi. Anæstesiologi. 2008;108:18-30.

3. Newman MF, Kirchner JL, Phillips-Bute B, Gaver V, Grocott H, Jones RH, et al. Longitudinel vurdering af neurokognitiv funktion efter koronar-arterie bypasskirurgi. N. Engl J Med. 2001;344:395-402.

4. Hall M, Schwartzman A, Zhang J, Liu X. Ambulatorisk kirurgi data fra hospitaler og ambulatoriske kirurgiske centre: 2010. National Health Statistics Report 2017.

5. Li Y, Chen D, Wang H, Wang Z, Song F, Li H, et al. Intravenøse versus flygtige æstetiske effekter på postoperativ kognition hos ældre patienter, der gennemgår laparoskopisk abdominal kirurgi. Anæstesiologi. 2021;134:381-94.

For more information:1950477648nn@gmail.com