Antivirale zinkoxid-nanopartikler medieret af Hesperidin og i Silico-sammenligningsundersøgelse mellem antivirale phenoler som anti-SARS-CoV-2

For mere information E-mailtina.xiang@wecistanche.com

Siden januar 2020 har Elsevier oprettet et COVID-19 ressourcecenter med gratis oplysninger på engelsk og mandarin om den nye coronavirus COVID-19. COVID-19-ressourcecentret er hostet på Elsevier Connect, virksomhedens offentlige nyheds- og informationswebsted. Elsevier giver hermed tilladelse til at gøre al sin COVID-19-relaterede forskning, der er tilgængelig på COVID-19 ressourcecenteret - inklusive dette forskningsindhold - umiddelbart tilgængelig i PubMed Central og andre offentligt finansierede lagre, såsom WHO COVID-database med rettigheder til ubegrænset forskningsgenbrug og analyser i enhver form eller på nogen måde med anerkendelse af den originale kilde. Disse tilladelser gives gratis af Elsevier, så længe COVID-19-ressourcecentret forbliver aktivt.

ABSTRAKTSvært akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2), som forårsagede coronavirus (COVID-19), er den virus, der er ansvarlig for over 69.613.607 millioner infektioner og over 1.582.966 dødsfald på verdensplan. Alle behandlingstiltag og protokoller blev kun anset for at være støttende og ikke helbredende. Under denne nuværende coronavirus-pandemi har det været fordelagtigt at søge efter farmaceutisk eller traditionel komplementær og integrativ medicin til at hjælpe med forebyggelse, behandling og bedring. Disse phytopharmaceuticals og nutraceuticals kan være mere økonomiske, tilgængelige, sikre og have lavere bivirkninger. Dette er i silico sammenligning undersøgelse af ti phenoliskeantiviralmidler mod SARS-CoV-2, samt isolering af den mest aktive metabolit fra naturlige kilder. Zinkoxidnanopartikler (ZnO NP'er) blev også derefter fremstillet under anvendelse af disse metabolitter som et reduktionsmiddel. Alle testede forbindelser viste forudsagt anti-SARS-CoV-2 aktivitet.Hesperidinviste den højeste docking-score, dette får os til at isolere den fra appelsinskallerne, og vi bekræftede dens struktur ved konventionel spektroskopisk analyse. Desuden var syntesen af ​​hesperidin zinkoxid nanopartikler karakteriseret ved UV, IR, XRD og TEM. In vitro antiviral aktivitet af hesperidin og ZnO NP'er blev evalueret mod hepatitis A-virus som et eksempel på RNA-vira. ZnO NP'er og hesperidin viste imidlertid antiviral aktivitet mod HAV, men ZnO NP'er viste højere aktivitet endhesperidin. Hesperidin og dets medierede ZnO nanopartikler er således villige antivirale midler, og yderligere undersøgelser mod SARS-CoV-2 er nødvendige for at blive brugt som en potentiel behandling.

Nøgleord: SARS-CoV-2 Nutraceuticals Molekylær docking Zinkoxidnanopartikler Hesperidin

1. Introduktion

Den nuværende COVID-19-pandemi er ansvarlig for over 69 millioner infektioner og over 1,5 millioner dødsfald på verdensplan til dato, 2,3 millioner infektioner og mere end 55,000 dødsfald i Afrika og over 119,{{9} } infektioner og mere end 6000 dødsfald i Egypten [1]. Hos de fleste individer, der er inficeret med SARS-CoV-2, omfatter symptomer mild til moderat luftvejssygdom, der kan komme sig uden konsultation af en læge. Imidlertid har personer med kroniske sygdomme som hjerte-kar-sygdomme, diabetes, kroniske luftvejssygdomme eller kræft en større risiko for at udvikle akutte luftvejssymptomer. COVID-19-overførsel forhindres ved at holde social afstand, vaske hænder eller bruge alkoholsterilisering og ikke røre ansigtet. Hvor det overføres gennem dråber af spyt fra personens næse, når en inficeret person hoster eller nyser [1]. Alle foranstaltninger og protokoller blev anset for kun at være støttende, men ikke helbredende. Der er dog mange aktuelle kliniske forsøg, der evaluerer potentielle lægemidler [1]. Siden man hævdede COVID-19 som en global pandemi, var der behov for at søge efter farmaceutisk eller traditionel, komplementær og integrerende medicin for at hjælpe med forebyggelse, behandling og bedring [2].

Naturprodukter er uudnyttede kilder til forbindelser, der kan bruges til forebyggelse og behandling af forskellige sygdomme. Derudover har naturlige forbindelser ofte tjent som billigere og sikrere lægemiddelkandidater mod flere sygdomme, mange ernæringsmæssige forbindelser blev rapporteret at haveantivirale aktiviteter[3]. I det sidste årti er antallet af nyeantivirale lægemidlerudvundet fra naturlige kilder er steget markant. Naturlige produkter hjælper med at opdage antivirale lægemidler, enten direkte eller indirekte [4].

Derfor kan screening af naturlige sammensatte biblioteker ved hjælp af computerscreeningsmetoder såsom molekylær docking spare både tid og penge i lægemiddeludvikling [3]

På den anden side har Znic (Zn)-holdige forbindelser vistantivirale egenskabermod en række vira i henhold til sådanne fysiske processer, såsom vedhæftning af virus, virusinfektion og afbelægning. Ud over hæmningen af ​​viral protease og polymerase [5]. Generelt er Zn et væsentligt element, der findes i væv i vores kroppe, såsom muskler, hjerne, hud, knogler. Det er også en væsentlig komponent i forskellige enzymsystemer involveret i metabolisme og nukleinsyre- og proteinbiosyntese [5].

Det skal bemærkes, at ZnO NP'er lettere absorberes af kroppen end zink selv. ZnO NP'er bruges i dag i fødevareindustrien som tilsætningsstoffer og i emballage. Ydermere blev ZnO kategoriseret som et sikkert stof af US Food and Drug Administration. Derfor er ZnO NP'er attraktive til brug i biomedicinske applikationer. ZnO NP'er er karakteriseret ved deres lave økonomiske omkostninger og lave toksicitet, derfor kan ZnO NP'er bruges i vid udstrækning til biomedicinske applikationer som antibakteriel, anti-cancer, antidiabetisk, anti-inflammatorisk, lægemiddellevering og sårheling [6].

Zn-holdige forbindelser blev for nylig rapporteret at udvise anti-SARS-CoV-2-aktivitet [7] Således er Zn-holdige lægemidler almindeligvis ordineret i COVID-19-beskyttelsesprotokoller. Følgelig fortjener den grønne syntese af ZnO NP'er særlig opmærksomhed.

I dette arbejde gennemgår en række fytofarmaceutiske phenolforbindelser fra almindeligt anvendte lægeplanter og fødevarer (nutraceuticals) en silicomolekylær undersøgelse for at udforske antiviral aktivitet mod SARS CoV-2 hovedprotease (Mpro) og eksperimentelt den forbindelse med højeste docking-score vil blive testet ved siden af ​​dets medierede ZnO-nanopartikler mod hepatitis A-virus (HAV), en RNA-virus, der ligner SARS−COV- 2.

2. Materialer og metoder

2.1. Molekylær docking

Hovedproteasen (Mpro) er et vigtigt enzym kodet af coronavirus-genomet, med en væsentlig rolle i virusreplikation og transkriptionsprocessen, hvilket gør det til et passende lægemiddelmål for SARS-CoV-2. At afsløre hæmningsmekanismen af ​​udvalgte polyphenoliske forbindelser såsom rutin, corilagin, diosmin, myricetin-3-O-xylosyl-(1→2)-rhamnosid, epigallocatechin-3-O-gallat,hesperidin, lyoniresinol, myricetin, naringenin og quercetin 3-O-glucuronid versus krystalstrukturen af ​​SARS-CoV-2 Mpro (6lu7) [8], som blev brugt med en opløsning på 2,1 Aᵒ. Det blev brugt til i silico molekylær docking. Dette protein er sammensat af to polypeptider kendt som protomer A og B. Denne dimer har en krystallografisk symmetri langs en todelt akse. Den indeholder tre domæner; domæne I (rest 8-101), domæne II (rest 102-184) med en antiparallel - arkstruktur, og domæne III (rest 201-303) har fem -helixer arrangeret som de antiparallelle sfæriske klynger. Hvor domæne III er forbundet med domæne II ved hjælp af en lang sløjferegion (rester 185-200). SARS-CoV-2, Mpro, har en Cys-His koblet katalytisk aktivitet, hvor substratbindingsstedet er placeret i en kløft mellem domæne I og domæne II [8] som i fig. 1. I den aktuelle undersøgelse , blev molekylære docking-procedurer udført af Swiss Dock-tjenesten [9]. Ved hjælp af EADock DSS, som udfører blind docking, og dens CHARMM-energier blev vurderet på et gitter, hvor de mest gunstige energier blev estimeret med FAKTA og grupperet. Disse klynger kan visualiseres og fortolkes ved hjælp af Chimera som rapporteret i litteraturen [10].

2.2. Plantematerialer, udvinding og isolering

Appelsinskræller (500 g) blev købt fra en lokal juicefabrik. Appelsinskaller (200 g) blev ekstraheret med 2 L varmt destilleret vand indtil udtømning. Ekstrakten blev filtreret og inddampet for at blive mere koncentreret under et vakuum. Vandekstrakten blev delt med CH2CI2 efterfulgt af butanol. Butanol-subfraktionen blev påført Whatman-filterpapirark 3 MM under anvendelse af BAW som eluent [12,11] for at give et større mørklilla bånd under ultraviolet (UV) lys. Det mørkelilla bånd blev isoleret og udblødt i methanol, derefter inddampet under vakuum under anvendelse af en rotationsfordamper. Det tørrede materiale blev påført en Sephadex LH -20-søjle under anvendelse af EtOH/H2O (1:1) som eluent for at give 120 mghesperidin.

2.3. Kernemagnetisk resonans (NMR)

1H-kernemagnetisk resonans (NMR)-spektre blev optaget på et Bruker Avance III, 400 MHz NMR-spektrometer og 100 MHz for 13C NMR. 1H kemiske skift (δ) blev målt i ppm i forhold til TMS og 13C-NMR kemiske skift til dimethylsulfoxid-d6 og omdannet til TMS-skalaen ved at tilføje 39,5.

2.4. Syntese af zinkoxidnanopartikler (ZnO NP'er)

med 500 mg zinkacetat opløst i 50 ml bi-destilleret vand og opvarmet i kogende vandbad i 20 min. Fem dråber ammoniumhydroxid blev derefter tilsat til reaktionen for at hæve pH til 12, hvor der dannes et ZnO NPs bundfald. Blandingen henstod i en halv time for fuldstændig reduktion af zinkacetat til ZnO NP'er. Det dannede bundfald blev centrifugeret ved 8000 rpm, efterfulgt af vask to gange med bi-destilleret vand og to vask med ethanol for at give hvide pellets af ZnO NP'er efter frysetørring.

2.5. Karakterisering af metal nanopartikler

2.5.1. UV-vis spektral analyse

ZnO NPs-præparater blev undersøgt ved hjælp af et UV-spektrofotometer, Shimadzu, UV-1601 (Shimadzu Corporation, Japan). UV-spektrene blev optaget mellem 200-400 nm.

2.5.2. FT-IR analyse

De funktionelle grupper af de syntetiserede zinkoxidnanopartikler og hesperidinforbindelsen blev karakteriseret ved hjælp af et FTIR 6100 spektrometer (Jasco, Japan) i området 4000 – 400 cm-1.

2.5.3. Transmissionselektronmikroskopi (TEM)

Morfologien og partikelstørrelsen af ​​ZnO NP'er medieret af hesperidin blev bestemt ved TEM (JEOL-JEM-1011, Japan). Dråber af nanopartikelsuspensionen blev anbragt på et kulstofbelagt kobbergitter, og opløsningsmidlet blev fordampet ved stuetemperatur før optagelse af TEM-billedet.

2.5.4. Røntgendiffraktion (XRD)

ZnO NPs røntgendiffraktionsmønster optaget med PANLYTICAL røntgendiffraktometer ved anvendelse af Cu K-stråling med bølgelængde 1d706; =0.1541 nm i scanningsområdet 21d703;=20− 70∘.

2.6. Evaluering af den antivirale aktivitet

Den antivirale screening blev udført ved hjælp af plak-hæmningsassay ved Regional Center for Mycology and Biotechnology (RCMB, Al Azhar University, Cairo, Egypten).

2.6.1. Pattedyrs cellelinje

Vero-celler afledt af afrikanske grønne abe-nyrer blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA).

Vero-cellerne blev opformeret i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10 procent varmeinaktiveret føtalt bovint serum (FBS), HEPES-buffer, 1 procent L-glutamin og 50 ug/ml gentamycin. Alle celler blev dyrket ved 37 ◦C i en fugtig atmosfære med 5 procent CO2 og blev sub-dyrket to gange i 7 dage [14].

2.6.2. Cytotoksicitetsvurdering

hesperidin og ZnO NP'er blev tilsat efter 24 timers implantation. Serielle to-dobbelte fortyndinger af de testede prøver (startet fra 3000 ug/ml til 2 ug/mL) blev tilsat til konfluente cellemonolag fordelt i fladbundede mikrotiterplader med 96-brønde (Falcon, Jersey, NJ, USA ) ved hjælp af en flerkanalspipette. Mikrotiterpladerne blev inkuberet ved 37 ◦C i en befugtet inkubator med 5 procent CO2 i en periode på 2 dage. Tre brønde blev anvendt til hver koncentration af de undersøgte prøver. Kontrolceller blev inkuberet uden testprøver og med eller uden DMSO.

Efter inkubationsperioden blev det levedygtige celleudbytte bestemt ved et MTT kolorimetrisk assay [15]. Forholdet mellem overlevende celler og koncentrationen af ​​testede prøver blev plottet for at opnå overlevelseskurverne for Vero-cellelinjen efter behandling med de specificerede forbindelser. Den 50 procent cytotoksiske koncentration (CC50), den koncentration, der kræves for at forårsage toksiske virkninger i 50 procent af intakte celler, blev estimeret ud fra grafiske plots af dosis-respons-kurven for hver koncentration under anvendelse af GraphPad Prism-software (San Diego, CA. USA). Den maksimale ikke-toksiske koncentration [MNTC] af hver hesperidin og ZnO NP'er blev bestemt og brugt til yderligere biologiske undersøgelser.

2.6.3. Virusudbredelse

Den cytopatogene HAV HM175-stamme (ATCC VR-1402) af HAV blev opformeret og analyseret i konfluente Vero-celler [16]. Infektiøse vira blev opregnet ved at bestemme den infektiøse dosis på 50 procent vævskultur med otte brønde pr. fortynding og 20 μL inokulum pr. brønd ved hjælp af Spearman-Karber-metoden [17].

3. Resultater og diskussioner

Ti nutraceutiske phenolforbindelser blev udvalgt i henhold til deres tilgængelighed og spredning som farmaceutiske doseringsformer afledt af naturlige ernæringsmæssige fødekilder.

Disse næringsstoffer var diosmin, rutin, naringenin, quercetin 3-Oglucouronide, myricetin 3-O-xylosyl-(1→2)-rhamnosid, myricetin, epigallocatechin-3-O-gallat, corilagin og lyoniresinol. Hesperidin, diosmin og rutin er bredt tilgængelige i farmaceutiske butikker under forskellige handelsnavne og kan stamme fra forskellige naturlige næringsfødevarer, der rapporteres at have antivirale egenskaber, for eksempel er hesperidin fra citrusskaller blevet rapporteret at haveantiviral aktivitet[18]. På basis af in silico-screening blev hesperidin også forudsagt at målrette mod interaktionsstedet mellem SARS-CoV-2 Spike- og ACE2-receptorer og dermed blokere virusets indtrængen i de humane lungeceller. Derfor kunne hesperidin være et lovende profylaktisk lægemiddel mod COVID-19 [19].

Derudover blev naringenin fra citrusskaller rapporteret som et antiviralt middel mod Zika-virus [20], rutin [21] viste signifikante resultater som antiviralt [19]. Grøn tes epigallocatechin-3-O-gallat harantivirale virkningermod en række DNA- og RNA-vira [22]. Corilagin forhindrer leverskader ved at hæmme HCV-replikation og modulere oxidativ stress [23]. Anti-HIV-aktivitet er blevet rapporteret for myricetin og dets glycosylerede derivater [24]. Derudover er flere lignaner blevet rapporteret at haveantiviralegenskaber [25].

3.1. Molekylær docking

I den nuværende forskning blev der gjort et forsøg på at fortolke og understøtte de eksperimentelle resultater vedrørende hæmningsmekanismen af ​​hovedproteasen COVID-19. Ti polyphenoliske forbindelser blev docket ved hjælp af Swiss Dock Server, hvor receptorbaserede tilgange blev anvendt til disse polyphenoler. Krystalstrukturen af ​​Covid-19 protease 6lu7, som antager en hjerteform med to dimerer af identiske underenheder og to aktive steder. en bredspektret inhibitor bør målrettes mod det aktive sted His 41 og Cys 148 af progenitor flagermus-coronavirus, som i PDB-indgang 4yoi. Denne undersøgelse belyste phenolforbindelsernes bindingsmåde til krystalstrukturen 6lu7 ved hjælp af molekylær docking (fig. 2). Docking-undersøgelsen bekræftede, at hesperidin kan danne elektrostatiske interaktioner med rester af THR 25, LEU 27, His 41 og Gly143, mens de danner pi-stabling interaktion med TYR 118 som angivet i tabel 1.

De fleste af de polyphenoliske forbindelser udviste inhiberingsaktivitet i spalteområdet mellem domæne II, III (rester 185-200) og i domæne I, som det ses i fig. Forholdet mellem RMSD og den oprindelige bindingstilstand (den fulde kondition (blå, venstre X-akse)) og energi (den simple kondition (rød, højre y-akse)) blev vist i fig. A, (forsyningsfil) . Docking-tilstand for hesperidin blev vist i (fig. B for SARS-CoV-2 Mpro og fig. C for HAV 3C Proteinase [26], 2HAL krystalstruktur), myricetin (fig. D,1,2), diosmin (fig. E 1,2), epigallocatechin-3-O-gallat (fig. F1,2), rutin (fig. G1,2), quercetin 3-O-glucuronid (fig. H 1,2), corilagin (fig. I1,2), myricetin (fig. J1,2), naringenin (fig. L1,2) og lyoniresinol (fig. M1,2), i den supplerende fil.

3.2. Isolering og identifikation af hesperidin

Da hesperidin viste den højeste docking-score, heri, isolerede vi det fra madaffald (appelsinhud), og dets antivirale aktivitet mod HAV (en af ​​RNA-viraene) blev evalueret.

Butanolfraktionen fra den vandige ekstrakt af appelsinskallerne blev påført Whatman-filterpapirark under anvendelse af BAW som eluent, hvorved et større mørklilla bånd af flavonoid karakter på den præparative papirkromatografi blev observeret. Eluering af det primære mørkelilla bånd med methanol førte til isolering af en ren forbindelse, hvor dens identitet blev bekræftet af 1H, 13C til at være hesperidin [27] som følger: 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6 δ 5,50 (dd, J=12,2, 3,4 Hz, 1H, H-2), 2,78 (dd, J =3,24 Hz & 17,16, 1H, H{{22} }ax), 3,26 (dd, J=17,16, 8,22 Hz, 1H, H-3ækv.), 6,14 (brs, 1H, H-6), 6,12 (brs, 1H , H-8), 4,97 (d, J =7,2 Hz, 1H, H-1′′), 4,53 (s, 1H, H-1′′' ), 1,09 (d, J=6.2, 3H, CH3 af rhamnose).13C NMR (101 MHz, DMSO-d6) δ 78,89 (C-2), 42,74(C{{64} }),197,48 (C-4), 163,50 (C-5), 96,85 (C-6), 165,60 (C-7), 96,00 (C{{79} }), 162,96 (C-9), 103,79 (C-10), 131,35 (C-1′), 118,42 (C-2′), 146,92 (C{{ 94}}′), 148,43 (C-4′), 112,50 (C-5′), 114,60 (C-6′), 56,15 (O-Me), 99,91(C{ {109}}′′), 73,45 (C-2′′), 76,73 (C-3′′), 70,06 (C-4′′), 75,98 (C{{121 }}"), 66,50 (C-6"), 101,06 (C-1"'), 70,73 (C-2"'), 71,17 (C{{133 }}"'), 72,53 (C-4"'), 68,78 (C-5"'), 18,29 (CH3 af rhamnose; C-6′′').

3.3. Dannelse af ZnO nanopartikler

Tilsætning af zinkacetatopløsning til hesperidinopløsning i et vandbad opvarmet til 80 ◦C efterfulgt af tilsætning af et par dråber ammoniak førte til udfældning af ZnO NP'er [13].

3.3.1. UV-analyse

Den maksimale absorptionstop for ZnO NP'er syntetiseret via hesperidin viste en top ved 335 nm (fig. 3a), hvilket bekræfter dannelsen af ​​ZnO NP'er [28]. ZnO på nanoskala har kortere bølgelængder sammenlignet med standard ZnO-absorptionsmønsteret, i overensstemmelse med rapporter om, at materialeoxider har en tendens til at have kortere bølgelængder, og at materialer i nanoskala har en tendens til at have kortere bølgelængder [29].

3.3.2. FT-IR analyse af ZnO NP'er og hesperidin

FT-IR-spektre (fig. 3b) af de fremstillede ZnO NP'er og hesperidin blev opsamlet i det spektrale breddeområde fra 400 til 4000 cm-1. Hvor viste toppe for O-H-grupper, der strækker sig af vand omkring 3546,04, 3478,29 og 3421,80 cm − 1 repræsenterer O–H-grupper af hesperidin og omkring 3382,99 cm− 1 for ZnO NP'er. Aromatiske dele blev bekræftet ved carbondobbeltbindingsstrækning ved 2918,50 cm-1. Bøjningsvibration af den alkoholiske –CO–H bekræftet af tilstedeværelsen af ​​en top på 1096,12 cm− 1. De karakteristiske bånd for ZnO NPs strækningstilstande er tildelt til 542,9 og 891,2 cm− 1 [13,30].

3.3.3.TEM-analyse

TEM-analyse blev udført på transmissionselektronmikroskoper med lav opløsning og høj opløsning og viste dannelsen af ​​de hexagonale ZnO NP'er med partikelstørrelser fra 20 til 30 nm, fig.

3.3.4. XRD analyse

Forekomsten af ​​ZnO NP'er og undersøgelse af deres strukturelle træk blev bekræftet ved røntgendiffraktion (XRD), fig. 5. ZnO NP'er medieret af flavonoid-hesperidin viste toppe med 2θ-værdier identificeret ved 31.618◦, 34.334◦, 4◦, 416.0, 35. ◦, 56.440◦, 62.727◦, 66.245◦, 67.864◦ og 68.925◦ svarende til (100), (002), (101), (102), (110), (103), (200), (112) og (201). Disse toppe blev matchet med dem på datakortet (00− 003-0888).

Krystalstørrelsen af ​​ZnO NP'er blev beregnet til at være 27,73 nm. Disse data minder meget om TEM-målinger. For at beregne krystalstørrelsen anvender vi Scherrers ligning

Krystalstørrelse {{0}} (0,9 x λ)/ (dcosθ)

Θ=2θ/2, d=den fulde bredde ved den halve maksimale intensitet af toppen (i Rad), λ =0.154060 nm

3.4. Antiviral aktivitet

3.4.1. Evaluering af cytotoksicitet mod Vero-celler

De to prøver af hesperidin og ZnO NP'er viste henholdsvis 50 procent celle cytotoksisk koncentration (CC50)=620.8 ± 34,6 og 243,7 ± 12,7 ug/mL. Som vist i fig. K. &L., suppl. fil og værdierne blev angivet i henholdsvis tabel C & D. Derefter blev disse forbindelser testet forantivirale virkningermod HAV ved den maksimale ikke-toksiske koncentration (MNTC) ved anvendelse af plakanalysemetoden illustreret i Fig. M. (supplerende fil).

3.4.2. Anti-HAV aktivitet

Flavonoider er blevet rapporteret at have antivirale aktiviteter både in vivo og in vitro [31]. Det blev rapporteret, at virkningsmekanismen af ​​nogle flavonoider mod HIV (også et RNA-virus) skyldes hæmningen af ​​phosphorylering af proteiner medieret af cytokiner. Det skal også bemærkes, at phosphoryleringssignalering medieret af cytokiner øges ved COVID-19-infektion, hvilket fører til phosphorylering af adskillige cytoskeletproteiner. Derfor kan flavonoider, som inkluderer hesperidin, hæmme proteinphosphorylering, hvilket igen fører til potent antiviral aktivitet og infektionsforebyggelse af andre celler [32]. ZnO NP'er er også blevet rapporteret at have antiviral aktivitet [32,33].

Zn-holdige forbindelser rapporterede at påvirke forskellige stadier af virale replikationscyklusser, såsom virusinaktivering, inhibering af viral uncoating, viral genomtransskription, viral proteintranslation og polyproteinbehandling. Det skal også bemærkes, at aktiviteten afhænger af typen af ​​virus og koncentrationen af ​​zinkholdige forbindelser [34].

I vores undersøgelse blev de sammenflydende monolag af Vero-celler inficeret med faste fortyndinger af HAV-virus. Efter inkubation blev podestoffet fjernet og erstattet med serumfrit MEM indeholdende 1,5 procent carboxymethylcellulose. Cellerne blev derefter inkuberet, hvilket tillod virussen at danne plaques. Cellerne blev fikseret i 2 timer ved 25 ◦C med formaldehyd, der blev tilsat direkte til mediet til en koncentration på 5 procent. Faste celler blev grundigt vasket med vand, før de blev farvet med en opløsning indeholdende 1 procent krystalviolet og 10 procent ethanol i 30 minutter. Efter skylning med vand blev antallet af plaques talt, og virustitere (tællinger) blev beregnet. De antivirale virkninger af de to testede prøver, hesperidin og ZnO NP'er mod HAV ved den maksimale ikke-cytotoksiske koncentration (MNCC) er vist i tabel B (supplerende fil). Zinkoxidnanopartiklerne viste højere aktivitet end hesperidin ved relativt lave koncentrationer på grund af det høje overfladeareal og lille partikelstørrelse, hvilket øgede aktiviteten af ​​zinkoxidnanopartikler. Fra tabel B, fig. T, (supplerende fil). Både hesperidin og ZnO NP'er viste antiviral aktivitet mod hepatitis A-virus (HAV) med procenter på 44,75 og 58,83 procent ved maksimal ikke-cytotoksisk koncentration og EC50s svarende til henholdsvis 72,4 og 176,3 ug/mL, som vist i tabel A og B (supplerende fil).

4 konklusioner

Den nuværende pandemiske sygdom COVID-19 er ansvarlig for en masse sygelighed og dødelighed på verdensplan. Nutraceuticals og phytopharmaceuticals phenoliske forbindelser under vores undersøgelse udviser gode docking-scores, og det kunne være et ideelt mål til behandling af SARS-CoV-2. Hesperidin, som er isoleret fra madaffaldsappelsinskal, udviste den højeste docking-score (-8.84 Kcal/mol) mod SARS-CoV-2 hovedprotease blandt de andre testede forbindelser. Hesperidin er i stand til at reducere zinkioner for at fremstille ZnO NP'er med hexagonal form og partikelstørrelse omkring 25 nm. Hesperidin-medierede ZnO NP'er udviser mere antiviral aktivitet end hesperidin selv med procenter på 44,75 og 58,83 procent ved maksimal ikke-cytotoksisk koncentration. Flere undersøgelser bør udføres for hesperidin, andre nutraceutiske stoffer, fytofarmaceutiske forbindelser og deres ZnO NP'er for at finde sikre, billige og potentielle behandlinger for SARS-CoV-2 pandemisk sygdom.

Forfatternes bidrag Gouda H. Attia, Yasmin S. Moemen, Mahmoud Youns, Ammar M. Ibrahim, Randa Abdou, Mohamed A. El Raey Gouda H. Attia og Mohamed A. El Raey designer manuskriptet. Gouda H. Attia, Ammar M. Ibrahim og Mohamed A. El Raey udførte den kromatografiske adskillelse og udførte strukturbelysningen af ​​den rene isolerede Hesperidin Gouda H. Attia, Randa Abdou og Mohamed A. El Raey udførte den grønne syntese af ZnO NP'er og beskriv dens funktioner. Yasmin S. Moemen udførte alle de molekylære docking undersøgelser og Mohamed A. El-Raey foreslår proteinet.

Mahmoud Youns og Randa Abdou udførte de antivirale og cytotoksiske assays og deres dataanalyse. Alle forfattere var ansvarlige for at udarbejde og skrive den endelige version af manuskriptet og godkende det endelige manuskript.

Finansiering

Der er ikke modtaget støtte til dette arbejde.

Forskningsetik

Vi bekræfter endvidere, at ethvert aspekt af arbejdet, der er dækket af dette manuskript, der har involveret menneskelige patienter, er blevet udført med den etiske godkendelse fra alle relevante organer, og at sådanne godkendelser er anerkendt i manuskriptet.

IRB-godkendelse blev opnået (kræves for undersøgelser og serier på 3 eller flere sager)

Skriftligt samtykke til at offentliggøre potentielt identificerende oplysninger, såsom detaljer om sagen og fotografier, blev indhentet fra patienten/patienterne eller deres juridiske værge.

Erklæring om konkurrerende interesse

Forfatterne rapporterer ingen interesseerklæringer.

Anerkendelser

Vi er taknemmelige over for dekanatet for videnskabelig forskning, Najran University, KSA, for at give midlerne til at udføre dette projekt (NU/MID/18/024).

Bilag A. Supplerende data

Supplerende materiale relateret til denne artikel kan findes i onlineversionen på DOI:https://doi.org/10.1016/j.colsurfb.2021.111724.

Gouda H. Attiaa,b , Yasmine S. Moemenc , Mahmoud Younsd , Ammar M. Ibrahime ,  Randa Abdouf,g , Mohamed A. El Raeyh, *  

a Department of Pharmacognosy, College of Pharmacy, Najran University, Najran, Saudi-Arabien
b Institut for Farmakognosi, Det Farmaceutiske Fakultet, Kafr El-Shiekh Universitet, Kafr El-Shiekh, Egypten
c Klinisk patologisk afdeling, National Liver Institute, Menoufia University, Menoufia, Egypten
d Institut for Biokemi og Molekylær Biologi, Det Farmaceutiske Fakultet, Helwan University, Cairo, Egypten
e Applied Medical Sciences College, Najran University, Najran, Saudi-Arabien
f Institut for Farmakognosi, Det Farmaceutiske Fakultet, Umm Al-Qura University, Mekka, Saudi-Arabien
g Institut for Farmakognosi, Det Farmaceutiske Fakultet, Helwan University, Cairo, Egypten
h Institut for Fytokemi og Plantesystematik, Pharmaceutical Division, National Research Center, Dokki, Cairo, Egypten

Referencer

[1] Verdenssundhedsorganisationen, WHO Coronavirus Disease (COVID-19), 2020 (Adgang 22. oktober 2020), https://www.worldometers. info/coronavirus/#lande.

[2] J. Hunter, S. Arentz, J. Goldenberg, G. Yang, J. Beardsley, D. Mertz, S. Leeder, Rapid review protocol: zink til forebyggelse eller behandling af COVID-19 og andre coronavirus-relaterede luftvejsinfektioner, Integr. Med. Res. 9 (2020), 100457. [3] GJ Kotwal, Antivirale nutraceuticals from granatæble (Punica granatum) juice, i Handb. Nutraceuticals, bind. I, CRC Press, 2009, s. 338–346.

[4] L.-T. Lin, W.-C. Hsu, C.-C. Lin, Antivirale naturprodukter og naturlægemidler, J. Tradit. Komplement. Med. 4 (2014) 24-35.

[5] A. Kumar, Y. Kubota, M. Chernov, H. Kasuya, Potential rolle af zinktilskud i profylakse og behandling af COVID-19, Med. Hypoteser (2020), 109848.

[6] J. Jiang, J. Pi, J. Cai, Fremrykningen af ​​zinkoxidnanopartikler til biomedicinske anvendelser, Bioinorg. Chem. Appl. (2018), https://doi.org/10.1155/2018/ 1062562.

[7] AJW Te Velthuis, SHE van den Worm, AC Sims, RS Baric, EJ Snijder, MJ van Hemert, Zn2 plus hæmmer coronavirus og arterivirus RNA-polymeraseaktivitet in vitro og zinkionoforer blokerer replikationen af ​​disse vira i cellekultur, PLoS Pathog. 6 (2010), e1001176.

[8] Z. Jin, X. Du, Y. Xu, Y. Deng, M. Liu, Y. Zhao, B. Zhang, X. Li, L. Zhang, C. Peng, Struktur af M pro fra SARS- CoV-2 og opdagelse af dets inhibitorer, Nature (2020) 1-5.

[9] A. Grosdidier, V. Zoete, O. Michielin, SwissDock, en protein-lille molekyle docking-webservice baseret på EADock DSS, Nucleic Acids Res. (2011), https://doi.org/ 10.1093/nar/gkr366.

[10] A. Kucukelbir, FJ Sigworth, HD Tagare, Quantifying the local resolution of cryo-EM density maps, Nat. Methods 11 (2014) 63-65.

[11] HH Barakat, M. El-Raey, SA Nada, I. Zeid, M. Nawwar, Constitutive phenolics and hepatoprotective activity of Eugenia supra-axillaris leaves, EJ Chem. 54 (2011) 313-323.

[12] SM Osman, WA El Kashak, M. Wink, MA El Raey, Nye isorhamnetin-derivater fra Salsola imbricata Forssk. Blade med tydelig anti-inflammatorisk aktivitet, Pharmacogn. Mag. 12 (2016) S47.

[13] GH Attia, HS Alyami, MAA Orabi, AH Gaara, MA El Raey, Antimikrobiel aktivitet af sølv og zink nanopartikler medieret af auberginegrøn Calyx, Int. J. Pharmacol. 16 (2020) 236-243.

[14] P. Vijayan, C. Raghu, G. Ashok, SA Dhanaraj, B. Suresh, Antiviral aktivitet af medicinske planter af Nilgiris, indiske J. Med. Res. 120 (2004) 24-29.

[15] T. Mosmann, Hurtig kolorimetrisk assay for cellulær vækst og overlevelse: anvendelse på proliferation og cytotoksicitet assays, J. Immunol. Methods 65 (1983) 55-63.

[16] W. Randazzo, J. Piqueras, J. Rodríguez-Díaz, R. Aznar, G. S´anchez, Improving efficiency of viability-qPCR for selektiv detektion af infektiøs HAV i mad- og vandprøver, J. Appl. Microbiol. 124 (2018) 958-964.

[17] RM Pinto, JM Diez, A. Bosch, Anvendelse af coloncarcinomcellelinjen CaCo-2 til in vivo amplifikation og påvisning af enteriske vira, J. Med. Virol. 44 (1994) 310-315.

[18] Z. Ding, G. Sun, Z. Zhu, Kort kommunikation Hesperidin dæmper influenza A-virus (H1N1) induceret lungeskade hos rotter gennem dets anti-inflammatoriske virkning, Antivir. Ther. 23 (2018) 611-615.

[19] C. Wu, Y. Liu, Y. Yang, P. Zhang, W. Zhong, Y. Wang, Q. Wang, Y. Xu, M. Li, X. Li, Analyse af terapeutiske mål for SARS- CoV-2 og opdagelse af potentielle lægemidler ved hjælp af beregningsmetoder, Acta Pharm. Synd. B (2020).

[20] AHD Cataneo, D. Kuczera, AC Koishi, C. Zanluca, GF Silveira, TB de Arruda, AA Suzukawa, LO Bortot, M. Dias-Baruffi, WA Verri, Citrusflavonoiden naringenin hæmmer in vitro-infektionen hos mennesker celler af Zika-virus, Sci. Rep. 9 (2019) 1-15.

[21] Y.-J. Lin, Y.-C. Chang, N.-W. Hsiao, J.-L. Hsieh, C.-Y. Wang, S.-H. Kung, F.-J. Tsai, Y.-C. Lan, C.-W. Lin, Fisetin og rutin som 3C-proteaseinhibitorer af enterovirus A71, J. Virol. Methods 182 (2012) 93–98.

[22] K. Kaihatsu, M. Yamabe, Y. Ebara, Antiviral virkningsmekanisme af epigallocatechin-3-O-gallat og dets fedtsyreestere, Molecules 23 (2018) 2475.

[23] BU Reddy, R. Mullick, A. Kumar, G. Sharma, P. Bag, CL Roy, G. Sudha, H. Tandon, P. Dave, A. Shukla, A natural small molecule inhibitor corilagin blokerer HCV-replikation og modulerer oxidativt stress for at reducere leverskader, Antiviral Res. 150 (2018) 47-59.

[24] JT Ortega, AI Su´arez, ML Serrano, J. Baptista, FH Pujol, HR Rangel, Rollen af ​​glycosyldelen af ​​myricetinderivater i anti-HIV-1 aktivitet in vitro, AIDS Res. Ther. 14 (2017) 1-6.

[25] RB Teponno, S. Kusari, M. Spiteller, Nylige fremskridt inden for forskning i lignaner og neolignaner, Nat. Prod. Rep. 33 (2016) 1044-1092.

[26] J. Yin, MM Cherney, EM Bergmann, J. Zhang, C. Huitema, H. Pettersson, LD Eltis, JC Vederas, MNG James, En episulfidkation (thiiraniumring) fanget i det aktive sted af HAV 3C proteinase inaktiveret af peptid-baserede ketonhæmmere, J. Mol. Biol. 361 (2006) 673-686.

[27] VM Chari, M. Jordan, H. Wagner, PW Thies, En 13C-NMR undersøgelse af strukturen af ​​en acyl-linarin fra Valeriana wallichii, Phytochemistry 16 (1977) 1110-1112.

[28] N. Srinivasan, C. Rangasami, JC Kannan, Syntesestruktur og optiske egenskaber af zinkoxidnanopartikler, Int J Appl Eng Res. 10 (2015) 343-345.

[29] S. Fakhari, M. Jamzad, H. Kabiri Fard, Grøn syntese af zinkoxidnanopartikler: en sammenligning, Green Chem. Lett. Åb. 12 (2019) 19-24.

[30] N. Bala, S. Saha, M. Chakraborty, M. Maiti, S. Das, R. Basu, P. Nandy, Grøn syntese af zinkoxidnanopartikler ved hjælp af Hibiscus subdariffa bladekstrakt: effekt af temperatur på syntese, anti -bakteriel aktivitet og anti-diabetisk aktivitet, RSC Adv. 5 (2015) 4993-5003.

[31] H. Zakaryan, E. Arabyan, A. Oo, K. Zandi, Flavonoider: lovende naturlige forbindelser mod virusinfektioner, Arch. Virol. 162 (2017) 2539-2551.

[32] M. Bouhaddou, D. Memon, B. Meyer, KM White, VV Rezelj, MC Marrero, BJ Polacco, JE Melnyk, S. Ulferts, RM Kaake, The global phosphorylation landscape of SARS-CoV-2 infektion, Cell 182 (2020) 685-712.

[33] H. Ghaffari, A. Tavakoli, A. Moradi, A. Tabarraei, F. Bokharaei-Salim, M. Zahmatkeshan, M. Farahmand, D. Javanmard, SJ Kiani, M. Esghaei, Inhibition of H1N1 influenza virusinfektion af zinkoxidnanopartikler: en anden ny anvendelse af nanomedicin, J. Biomed. Sci. 26 (2019) 1-10.

[34] SA Read, S. Obeid, C. Ahlenstiel, G. Ahlenstiel, The role of zinc in antiviral immunity, Adv. Nutr. 10 (2019) 696-710.