Antioxidative, anti-inflammatoriske og anti-aldrende egenskaber af mycosporin-lignende aminosyrer: molekylære og cellulære mekanismer til beskyttelse af hudens aldring

Klik her for at få Cistanchemycosporin-lignende aminosyrer

Nøgleord:mycosporin-lignende aminosyrer; mycosporin-2-glycin; UV-absorberende forbindelse;solcreme;anti aldring; anti-oxidation; anti-inflammation; anti-protein-glykeringsaktivitet

1. Introduktion

Huden, det største menneskelige organ, er konstant udsat for det ydre miljø. Eksponering foren række miljømæssige stressfaktorer, især ultraviolet (UV) stråling i sollys, kan beskadigehud. Sollys kan opdeles i tre typer ikke-ioniserende elektromagnetisk stråling - infrarød(IR) (780-3000 nm), synlig (400-780 nm) og UV (100-400 nm). Procentdelen af ​​energi udstrålettil Jorden, i den samlede energi, der udsendes af Solen, er 53 procent IR, 39 procent synlige og 8 procent UV [1]. På denbaseret på dets fysiologiske og biologiske virkninger, UV-stråling kan yderligere opdeles i tre hovedbånd - 315-400 nm-båndet (betegnet som UV-A), 280-315 nm-båndet (betegnet som UV-B),og 100-280 nm-båndet (benævnt UV-C) [2]. Solens UV-stråling er drastisk reduceretnår det passerer gennem ozonlaget og atmosfæren; som et resultat, andelen af ​​UV-stråler isollyset, der når jordens overflade, består af 95 procent UV-A og 5 procent UV-B [1]. 

Selvom detkun udgør en lille del af den samlede UV-stråling, menes UV-B at være mere skadelig endUV-A, da UV-B er mest aktiv til at beskadige hud og øjne [3]. UV-A og UV-B er også kendtat være genotoksiske, hvilket betyder, at de kan inducere fotokemisk skade i cellulært DNA og proteiner [4,5]. Følgelig stimulerer eksponering for UV-A og UV-B hudens fotoaldring og kan være ansvarlig forinduktion af hudkræft [6]. Hudfotoældning er karakteriseret ved udvikling af pigmenterlidelser, såsom solar lentigines, fine og grove rynker og godartede, præmaligne og ondartedehudtumorer på soleksponeret hud [7]. Højenergisk UV-C-stråling har ingen biologisk betydningfordi den ikke når jordens overflade, på grund af dens fuldstændige absorption af ozonlaget ogatmosfæren [1,3]. Nedbrydningen af ​​ozonlaget i løbet af de sidste par årtier har øgetmængden af ​​sol-UV-stråling, der når jordens overflade [8], især UV-B-niveauer, da UV-A erabsorberes ikke af ozonlaget [9]. 

Mange marine organismer, der er udsat for UV-stråling, har udviklet fotobeskyttendemekanismer [10]. For eksempel i cyanobakterier, som dominerer havmiljøet, UVbeskyttelsesmekanismer har udviklet sig på det molekylære, cellulære og adfærdsmæssige niveau [11]. Cyanobakterierkan syntetisere forskellige typer "solcreme"-forbindelser, som giver beskyttelse mod UV-stråling.Mycosporin-lignende aminosyrer (MAA), Stoneman og carotenoider er kendt for at være nøgleforbindelseri cyanobakterier, der kan absorbere bølgelængder i UV-området. Disse naturlige produkter er lovendekandidatmolekyler inden for opdagelse af kosmetiske forbindelser [12]. Det har MAA'er faktiskallerede blevet kommercialiseret som Helioguard®365. Dette kosmetiske reagens indeholder liposomMAA'er, shinorine (SHI) og Porphyra-334 (P334), der oprindeligt blev udvundet af den røde algePorphyra umbilicalis, og er med succes blevet kommercialiseret som en naturlig og sikker solcremesammensat [12]. Derudover menes MAA'er at være multifunktionelle sekundære metabolitter iceller af producenter [13]. Mange MAA'er er kendt for at fungere som antioxidanter [14], mens flere nylige rapporterhar foreslået, at MAA'er har potentielle terapeutiske anvendelser til at reducere hudaldringsprocesser.Ud fra dette synspunkt er der for nylig flere reviewrapporter med særlig vægt på den potentielle anvendelseaf MAA i kosmetiske produkter, er blevet offentliggjort [15–17]. I dette papir gennemgår vi MAA'er ogderes potentiale som anti-skin-aging ingredienser, ved at beskrive en grundlæggende oversigt over deres struktur, førgår videre til en detaljeret redegørelse for de seneste eksperimentelle observationer, akkumuleret såledeslangt. De mekanismer, hvorved MAA'er kan virke for at beskytte huden mod aldring, diskuteres på, både,det cellulære og det molekylære niveau. Især den fremtrædende potentielle anti-aging aktivitetMAA mycosporin-2-glycin (M2G), som biosyntetiseres af den halotolerante cyanobakterieAphanothece halofytisk, er fremhævet.

2. Mekanismer for den UV-inducerede hudældning
UV-stråling er vigtig for vores sundhed, da UV-B-eksponering kan inducere produktionen af ​​en afgørende faktornæringsstof, D-vitamin, i vores hud [18]. Men langvarig og gentagen eksponering for UV kan fremmehudfotoaldringsproces, herunder dannelse af hudkræft [19]. De mekanismer, hvorved UV-medieretcellulær skade er induceret er kort beskrevet i dette afsnit.

2.1. Cellulær DNA-skade

Direkte og indirekte toksiske virkningeraf UV-stråling på DNA-molekylet, medierer fotoaldring.Direkte absorption af UV-B fotoner af DNA, kan resultere i dannelse af pyrimidin dimerer,fører til defekter i DNA-strengen [20]. UV-B-stråling fører mest til dannelsen afcis-syncyclobutadipyrimidiner (CPD'er) og pyrimidin (6-4) pyrimidon fotoprodukter (6-4PP'er). 6-4PP'erkan omdannes til relaterede Dewar-valensisomerer (DewPP'er) ved UV-excitation ved 314 nm.Sådanne DNA-skader interfererer med DNA-replikation og -transskription og medfører forskellige skadelige virkningertil cellen, såsom mutation, ustabilitet af kromosomet og celledød. UV-A gør ikkeændrer direkte DNA-strukturen, da DNA ikke absorberer stråling i UV-A-området kraftigt [21]. UV-A kan dog skade DNA indirekte via en fotosensibiliseret reaktion medieret ved at genereredet radikale singlet oxygen (1O2), hvilket resulterer i purinbasemodifikationer [20]. Singlet oxygenanion

oxiderer guanindelen efterfulgt af dannelsen af ​​8-oxo-7,8-dihydroguanin (8-oxo-G) og8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosin (8-oxo-dG). Da 8-oxo-G og 8-oxo-dG kan forbindes med adenini stedet for cytosin kan der forekomme overgangsmutationer.

2.2. Generering af reaktive iltarter

Reaktive oxygenarter (ROS), initiatorer af oxidativ stress, er oxygenholdige reaktivekemiske arter, der inkluderer hydrogenperoxid (H2O2), hydroxylradikaler (·OH), superoxidanionradikale (·O2 −), og1O2. I vores hud er udsættelse for UV-stråling kendt for at være forbundet medgeneration af ROS. Disse ROS kan aktivere hudaldrende kaskader, såsom matrix metalloproteinase(MMP)-1-medieret aldring og NF-κB-TNF- -medieret, inflammationsinduceret aldring [22]. Variationenaf ROS-genereringsmekanisme ved UV, afhængigt af UV-strålingsbølgelængdeområdet. I tillæg til1O2 generation, som nævnt ovenfor, er det blevet rapporteret, at UV-A-stråling kan inducere genereringenaf·O2 − ved aktivering af intracellulært nikotinamid adenindinukleotidphosphat (NADPH)oxidase, NOX [23], og associering med avancerede glykeringsslutprodukter (AGEs) [24]. Sakurai et al.belyst, at begge dele1O2 og·O2 - blev genereret i huden på mus udsat for UV-A [25]. H2O2, ·O2 −, og·OH-arter kan dannes i AGE'er under eksponering for UV-A [24]. UV-B er også kendt forføre til produktion af H2O2, ·O2 −, og·ÅH [26]. Selvom kilden til disse UV-B-inducerede ROSforbliver uklart, for nylig blev det rapporteret, at NADPH-oxidase, NOX1, er forbundet med UV-B-induceretp38/MAPK-aktivering og cytotoksicitet, via ROS-generering i keratinocytter [26]. 

For at forhindre hudskader induceret af overskydende UV-induceret ROS og regulere epidermal homeostase,hudceller har en antioxidativ funktion, der fungerer som et endogent forsvarssystem [20]. Dette systembestår hovedsageligt af seks enzymer - superoxiddismutase (SOD), katalase (CAT), glutathionperoxidase(GPX), glutathionreduktase (GR), thioredoxinoxidase (TRXR) og peroxiredoxin (PRDX) (figur1). SOD og CAT eliminerer·O2 − og H2O2, henholdsvis og i sidste ende konvertere·O2 − til H2Åh, hvorimodGPX, GR, TRXR og PRDX eliminerer H2O2ved regulering af redoxbetingelserne for glutathionog thioredoxin. Ud over dette enzymatiske system, ikke-enzymatiske molekyler, såsom C-vitamin(ascorbinsyre), vitamin E ( -tocopherol), glutathion og urinsyre, spiller en stor rolle som antioxidanteri huden [27]. Disse små molekyler opfanger og neutraliserer frie radikaler ved at give en ekstraelektron for at danne et elektronpar.

Figur 1.Fjernelse af reaktive oxygenarter (ROS) af et antioxidantforsvarssystem bestående afsuperoxiddismutase (SOD), katalase (CAT), glutathionperoxidase (GPX), glutathionreduktase(GR), thioredoxinoxidase (TRXR) og peroxiredoxin (PRDX). GSHred og GSSGox indikerer reducerethenholdsvis glutathion og oxideret glutathion. TRXred og TRXox indikerer reduceret thioredoxinog oxideret thioredoxin, henholdsvis

Udsættelse for UV-stråling fremkalder betændelse ved at udløse kemiske reaktioner i huden. Distinktmønstre af inflammation er forårsaget af eksponering for specifikke bølgelængder af lys.De tre grupper, UV-A,UV-B og UV-C er blevet klassificeret, baseret på disse forskelligemønstre af inflammation [28]. Eryteminduceret i huden, efter eksponering for UV-B-stråling karakteriseres som solskoldning. Inflammatoriskreaktioner induceret af UV-B opnås for det meste gennem en række forskellige mediatorer, herunder salpeteroxid (NO), inducerbar NO-syntase (iNOS), prostaglandin E2 (PGE2), cyclooxygenase-2 (COX-2),tumor nekrose faktor- (TNF- ), og andre cytokiner, såsom interleukin-1 (IL-1) og interleukin-6(IL-6) (Figur2). Disse molekyler er overvejende reguleret af nuklear faktor-kappa B (NF-κB), og produceres for det meste i keratinocytter, som er den dominerende celletype i epidermis [29]. Det harblevet rapporteret, at ekspressionen af ​​COX-2-proteinet, som er ansvarlig for PGE2 produktion, eropreguleret, efter eksponering for UV-B, i både human hud og i dyrkede humane keratinocytter [30]. ROS er også kendt for at være forbundet med det inflammatoriske respons, da det er blevet observeret, atCOX-2 udtryk blev induceret af ROS i forskelligecelletyper [31]

Figur 2.UV-B-induceret inflammatorisk respons. Nitrogenoxid (NO), inducerbar NO-syntase (iNOS),prostaglandin E2 (PGE2), cyclooxygenase-2 (COX-2), tumornekrosefaktor- (TNF- ), og andrecytokiner, såsom interleukin-1 (IL-1) og interleukin-6 (IL-6), vises som mediatorer

2.4. Induktion af matrixmetalloproteinaser

UV-stråling opregulerer ekspressionen af ​​matrixmetalloproteinaser (MMP'er) i huden. MMP'er, som er kendt for at være ansvarlige for ødelæggelsen af ​​ekstracellulære matrix (ECM) proteiner, såsom kollagen, som spiller en vigtig rolle i at opretholde hudens homeostase og hudens aldring (32). MMP'er udskilles af keratinocytter og dermale fibroblaster som reaktion på flere stimuli, herunder oxidativ stress og cytokiner, udover UV-stråling. Den gentagne induktion af disse kollagen-nedbrydende enzymer på lang sigt menes at forårsage kollagenskader, hvilket er en af ​​årsagerne til fotoældning. Selvom adskillige MMP'er udtrykkes i pattedyrs hud, er det blevet foreslået, at MMP-1 er det vigtigste kollagen-nedbrydende enzym, der er ansvarligt for kollagenødelæggelse, i flere fotobeskadigede huder (33). Opreguleringen af ​​MMP-ekspression stimuleres af aktivatorproteinet-1(AP-1), som er kendt for at være en UV-inducerbar transkriptionsfaktor (34 Faktisk det AP-1-regulatoriske element eksisterer i den 5'-flankerende region af MMP-gener. Transformerende vækstfaktor-beta (ICF-P) og NF-KBare er også kendt for at være involveret i induktionen af ​​MMP'er i huden (34).

2.5. Induktion af proteinglykering

Proteinglykering (ikke-enzymatisk glykosylering), også kendt som det første trin i Maillard-reaktionen,involverer dannelsen af ​​kovalente bindinger mellem proteiner og reducerende sukkerarter. En kondensationsreaktionmellem de frie aminogrupper i proteiner og carbonylgrupperne i sukkerarter, resulterer i dannelsen af ​​enSchiff base, efterfulgt af et Amadori produkt. Overskydende produkter oxideres og dehydreres til dannelsestabile, molekylære, tværbindende produkter, kaldet avancerede glycation slutprodukter (AGE'er) [35]. Proteinglycation påvirker de fysiske og funktionelle egenskaber af et protein, da det forårsager konformationelændringer i proteinstrukturen [36]. I hud er det blevet rapporteret, at glykering af kollagen type I erforbundet med udvikling af sløvhed i huden og nedsat hudelasticitet [37]. AGE er ogsåinvolveret i genereringen af ​​ROS. Masaki et al. rapporterede, at eksponering af AGE'er for UV-A-bestrålingin vitro, resulterede i generering af ROS, som f.eks·O2 −, H2O2, og·Åh, som nævnt ovenfor [24]. Hos mennesker kan hudautofluorescens, en biomarkør for AGE'er, fungere som en endogen fotosensibilisatorder inducerer ROS-generering efter eksponering for UV-A-stråling [35]. Altså en glykeringsreaktionefterfulgt af AGE-dannelse menes at være en af ​​de grundlæggende mekanismer forbundet med hudaldring, under miljøforhold, især UV-stråling [24]. 

3. Naturlige forbindelser, der forhindrer UV-stråling (UVR)-induceret fotoskader

Bølgelængdeafhængighed er afgørende for at bestemme fotobiologiske effekter. Kortbølget UV-Cer den mest skadelige type UV, men fordi den er filtreret fra ozonlaget, er det kun UV-B ogUV-A anses for at være af biologisk betydning. I betragtning af deres påvirkning er det kun UV-A, der forårsagerindirekte DNA-skader, via generering af·O2 −, en initiativtager til vigtige ROS (se afsnit2.2). UV-A trænger dybt ind i hudens dermis. Langvarig UV-A eksponering kan føre til fotoældningog undertrykkelse af immunsystemet. Direkte DNA-skader er dog forårsaget af UV-B, viadannelse af CPD'er og 6-4PP'er. UV-B forårsager også hudskader og transformation, f.eks.ved at påvirkehudstrukturer og forårsager rynker (et tegn på fotoældning), ruhed og for tidligtaldring, og endda fører til ondartede hudsygdomme og dødelige sygdomme, såsom hudkræft [38]. For at forhindre eller lindre disse negative virkninger, blokering af overdreven UV eller lindrekaskade af UV-induceret fotoskader er afgørende. Solcrememidler (enten fysiske blokkere eller kemiskemidler) påføres ofte huden for at blokere for kraftig UV. På det seneste har der været en stigende efterspørgselat kunstige kemiske solcremer skal erstattes med naturlige. Dette er på grund af det negativeeller bivirkningeraf kunstige kemiske solcremer og på grund af miljøhensyn. Naturligsolcremer og naturlige forbindelser, der besidder egenskaber, der modstår UV-induceret fotoskader, er,derfor af stor interesse. Nogle naturlige forbindelser kan føre til væsentlige forbedringer i hudensundhed og ydeevne.Naturlige forbindelser, der kan give beskyttelse mod UVR-induceret fotoskader kan værekategoriseret på basis af disse mekanismer—(1) blokering af UV-fotoner; (2) involvering iDNA reparation system; (3) antioxidantaktivitet; (4) anti-immunomodulerende aktivitet; (5) anti-inflammatoriskaktivitet; og (6) har en hæmmende virkning på den cellulære matrix [39]. I dette afsnit beskriver vide naturlige forbindelser fra planteekstrakter og en klasse af sekundære metabolitter, som harfarmakologisk relevans som overlegne solcremeforbindelser, kaldet mycosporin-lignende aminosyrer (MAA'er).

3.1. Planteekstrakter

Databasen over naturlige forbindelser (NC'er) indeholder mere end 320,000 forbindelser, rapporteret iSuper Naturlig II. Af disse blev der opnået mere end 50,000 forbindelserfra planteekstrakter er indsendt til databasen. Den største klasse af naturlige planteekstrakter, som har vist sig at have de mest relevanteaktivitet og de mest gavnlige virkningermod UV-B-induceret fotoskader rapporteret til dato er desom virker via hæmmende effekterpå signalvejene (f.eks. NF-κB, MARK og AP-1),og biomarkørproteiner fra målsignalvejene (f.eks. COX-2 i inflammatorisksignalering). Hæmmende virkningerpå disse signalveje modulerer cellulære signalmål yderligereog antioxidantegenskaber, for at udtømme ROS-generering. For eksempel har granatæble frugtekstrakt væretvist sig at hæmme UV-B-medieret phosphorylering af NF-κB- og MARK-veje, i almhumane epidermale keratinocytter (NHEK) [40]. Hæmning af UV-B-induceret aktivering af MARK ogNF-κB af proanthocyanidiner, en klasse af polyphenoler isoleret fra vindruekerner, polyphenoler fragrøn te og quercetin fra løg er blevet rapporteret [41]. Resveratrol, en klasse af naturlige phenoleropnået fra vindrueskall, tranebær og jordnødder, har evnen til at reducere NF-κB aktivering [42]. COX-2, et biomarkørprotein i den inflammatoriske kaskade, hæmmes af phenoliske forbindelser, såsom koffeinsyre fra hvide druer [43], kaempferol fra druer [44], og curcumin fra gurkemeje [45]. Omfattende undersøgelser af naturlige plantemidler, der kan beskytte mod UVB-induceret fotoskaderer blevet opsummeret i tidligere revisionspapirer [46–48].

3.2. Mycosporin-lignende aminosyrer

Mycosporin-lignende aminosyrer (MAA'er) blev først opdaget i svampe og forbundet med enfysiologisk rolle i lysstimuleret sporulering. I 1993 en direkte effektsom fotobeskyttende middelblev tydeliggjort af forbindelsens evne til at blokere fotoner. Det blev afsløret, at MAA'er kunneforhindre 3 ud af 10 fotoner i at ramme et cytoplasmatisk mål i cyanobakterier [49]. Denne evne har førtMAA er kendt som primær solcreme.Akkumulerende beviser har vist, at nogle MAA'er har yderligere gavnlige funktioner. Deresudtalt foto-beskyttende potentiale blev først bemærket, da de blev bevist at være ROS-fjernere,en evne, der er opstået via deres antioxidantevne [14,50]. Yderligere har forskellige biologiske funktionersiden blevet bevist, herunder DNA-skadebeskyttelse, anti-inflammatorisk aktivitet og hæmmendehandling over for AGE'er. Disse mange gavnlige funktioner gør MAA'er meget interessante biomolekyler.Flere detaljer om disse naturlige forbindelser vil blive gennemgået yderligere i næste afsnit.

4. Molekylære egenskaber af MAA'er

I dette afsnit er den nuværende grundlæggende forståelse af MAA'er opsummeret i tre dele - en generelbeskrivelse af MAA'er, deres kemiske struktur og deres biosyntetiske veje.

4.1. Generel beskrivelse

'Mycosporin' er en almindelig betegnelse for svampe-UV-absorberende metabolitter, der har væretsubstitueret med aminosyrerester [51]. Siden 1960'erne har mycosporinderivater, grupperet som MAA'er,er blevet fundet og identificeret fra en lang række organismer, herunder marine organismer som f.ekssom røde alger, havstjerner, koraller, dinoflagellater, cyanobakterier og laver [12,52]. MAA'er omfatter encyclohexenon eller cycloheximidring, da deres kernekromoforringstruktur er substitueret medaminosyrerester eller iminoalkoholer eller nogle yderligere modifikationer (figur3). For eksempel istrukturen af ​​P334, threonin og glycin binder til C1- og C3-positionerne af kernekromoforenhenholdsvis struktur.MAA'er anses for at være de mest effektiveUV-A-absorberende forbindelser i naturen [53]. MAAsudviser en maksimal absorbans inden for UV-A og UV-B området (fra 310 til 362 nm), med højmolære ekstinktionskoefficienter (ε = 28,100–50,000 M−1 cm−1 ). I organismer, der akkumulerer MAA,disse forbindelser menes at bidrage til undertrykkelse af UV-induceret stress ved at sprede sigoverskydende energi i form af varme, uden at generere ROS, efter at have absorberet UV-stråling. MAA ermeget vandopløselige forbindelser, på grund af deres zwitterioniske egenskaber, afledt af deres aminosyresubstitutioner, og derfor akkumuleres de generelt i det cytosoliske rum. Det er blevet rapporteretMAA'er kan fungere som multifunktionelle forbindelser i celler. Udover deres UV-beskyttende rolle, en andenvigtig biologisk rolle for MAA er deres antioxidantegenskaber [14]. Andre egenskaber ved MAA,foreslået indtil videre, omfatter DNA-beskyttende aktivitet [54], anti-inflammatorisk aktivitet [55,56], aktivitet tilfremme osmotisk ligevægt [57,58], og involvering i celle-celle interaktioner [13].

Figur 3.Kemiske strukturer af de udvalgte mycosporin-lignende aminosyrer (MAA) - mycosporinglycin, shinorin, porphyra-334, mycosporin-2-glycin, palythine og euhalothece-362

4.2. Kemisk struktur

MAA'er kan groft opdeles i to grupper - mono-substituerede MAA'er og di-substituerede MAA'er. I mono-substituerede MAA'er er C3-positionen på cyclohexenonstrukturen substitueret med en aminoforbindelse. En af de mono-substituerede MAA'er, mycosporin-glycin (MG), som er et almindeligt mellemprodukt til bioproduktion af di-substituerede MAA'er, er blevet foreslået at være en vigtig beskyttelse mod sollysskader i marine organismer via eliminering af'O, (591. Absorptionsmaksimum for MC er rapporteret at være 310 nm. På den anden side varierer absorptionsmaksima for di-substituerede MAA fra 320 til 362 nm, afhængigt af typen af ​​substituent eksempel, absorptionsmaksima for P334 ( C1: Thr; C3: Gly), palythin (C1: -NH; C3: Glyand M2G (C1: Gly; C3: Gly) er henholdsvis 334, 320 og 331 nm [14]. I di-substitueret, MAAsa protoneret nitrogenatom på imingruppen, resulterer i dannelsen af ​​en zwitterion efterfulgt af konjugation og delokalisering af den positive ladning på nitrogenatomet, over kerneringstrukturen. Denne konjugation stimulerer UV-absorption af MAA'er. Omfanget af resonansdelokalisering kan påvirke ekstinktionskoefficienten og absorptionsmaksimum for hver MAA (14) Yderligere modifikation af substituenterne i MAA ved kondensation, dehydrering, decarboxylering, oxidation, reduktionssulfonering eller glycosylering kan også påvirke dem. Til dato er mere end 30 forskellige MAA'er blevet identificeret. For at identificere og karakterisere disse MAA'er er der blevet brugt en række eksperimentelle teknikker, såsom højtydende væskekromatografi (HPLC) analyse, massespektrometri (MS) analyse inklusive væskekromatografiLC)-MS, aminosyreanalyse, infrarød (IR) spektroskopisk analyse , kernemagnetisk resonans (NMR-analyse og gaskromatografi (GC-MS-analyse. En passende kombination af disse analytiske teknikker, sammen med teknologiske forbedringer i analytiske instrumenter, har været effektiv til at hjælpe med at karakterisere strukturen af ​​MAA'er (12).) T forberede MAA-materialer til analyse, præparative væskechromatografiske teknikker er ofte blevet brugt efter ekstraktion af MAA fra organismer ved hjælp af organiske opløsningsmidler, såsom methanol og ethanol (60].