Antioxidant Graphene Oxide Nanoribbon som et nyt hvidtemiddel hæmmer melanogenesemekanismen

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Hsin-Yu Chou, Hui-Min David Wang,* Chia-Heng Kuo, Pei-Hsuan Lu, Lin Wang, Wenyi Kang og Chia-Liang Sun*

ABSTRAKT:I melaninsynteseprocessen spiller oxidative reaktioner en væsentlig rolle, og det er en god strategi at hæmme melaninproduktionen ved at reducere oxidativt stress. Fulleren og dets derivater, eller komplekserne, blev betragtet som stærke frie radikaler, og vi anvendte yderligere flerlags sp2 nanocarboner for at opdagemelaninsyntesehæmmende mekanismer. I denne undersøgelse brugte vi nye nanomaterialer, såsom multiwalled carbon nanorør (MWCNTs), short-type MWCNTs, graphenoxide nanoribbons (GONRs) og short-type GONRs, som antioxidative midler til at regulere melaninproduktionen. Resultaterne viste, at GONR'er havde bedre antioxidative evner i intracellulære og ekstracellulære oxidative stressanalyseplatforme end andre. Vi foreslog, at GONR'er har iltholdige funktionelle grupper. I 2',7'-dichlordihydrofluoresceindiacetatanalysen fandt vi ud af, at GONR kunne chelatere metalioner for at opfange reaktive oxygenarter. I det molekylære indsigtssyn observerede vi, at disse nanomaterialer nedregulerede melaninsyntesen ved at reducere mikrophthalmi-associerede transkriptionsfaktor-relaterede genudtryk, og der var lignende konsekvenser i proteinudtryk. For at opsummere er GONR'er et potentielt middel som en ny antioxidant og hudblegende kosmetologisk materiale.

Cistanche er ogsåen potentiel agent som en romanantioxidantog hudblegningkosmetologisk materiale.

1. INTRODUKTION

Hud er det organ, der dækker den ydre overflade af den menneskelige krop. Da grænsefladen er i kontakt med miljøet, spiller hudlaget en vigtig rolle i at beskytte kroppen mod patogener, undgå for stort vandtab, regulere kropstemperaturen og så videre. Melanocytter vokser i den basale membran af hudens epidermis og tegner sig for 5 procent til 10 procent af celleindholdet. De er blevet karakteriseret som encellede "kirtler" med tynde, lange, streamer-lignende dendritter og forgrening. Melanocytter bevæger sig gennem epidermale celler i deres umiddelbare nærhed og skaber en konstellation af epidermale celler omkring hver melanocyt. Der er mange interne og eksterne årsager til hudens aldring, og en sådan faktor er ultraviolet (UV) stråling fra sollys.1 Under UV-eksponering øges niveauet af reaktive oxygenarter (ROS) i huden dramatisk, hvilket er kendt som oxidativt stress. Adskillige miljømæssige toksicitetsfaktorer forstærker også oxidativ stress på huden, såsom pesticider, kultetrachlorid, tungmetaller, aromatiske aminer og partikler 2,5 (PM2,5).2 I den biokemiske mekanisme genereres de intracellulære oxidanter fra de ikke- enzymsystem, der transformerer dem til ROS for at udløse melanogenese-vejen.3

Udover ROS er der mange faktorer, der påvirkermelanin produktion, herunder genekspression, inflammation, endokrine ændringer og pigmentoptagelse.1 I de første trin af melaninproduktionen spiller tyrosinase en rolle i at katalysere tyrosin til phenomelanin og eumelanin. Begge pigmentfremstillingsmekanismer ligner hinanden, som omfatter L-tyrosin-hydroxylering til 3,4-dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) og L-DOPA-oxidation til dopaquinon. I næste trin oxideres dopamin af tyrosinase-relateret protein 1 (TRP-1) og tyrosinase-relateret protein 2 (TRP-2) i melanosomet, som reguleres af den mikrophthalmia-associerede transkriptionsfaktor ( MITF) for at danne melanin. Til sidst modnes og udfældes melanin i stratum corneum.4,5 Disse trænger ind i de tilstødende keratinocytter i basallaget og beskytter deres DNA mod eventuelle UV-inducerede mutationer eller modifikationer. Det modnede melanin i melanosomer overføres til keratinocytter6−9 og fører til sidst til en langvarig pigmentering. Lentiginer, fregner og brune/sorte pletter forårsager nogle gange sociale problemer hos mænd og kvinder. Blokering af det oxidative stress eller undertrykkelse af tyrosinaseaktiviteten er en strategi til at nedregulere syndromet med hyperpigmentering og dermatologiske lidelser. Antioxidanter helbreder ROS-forårsagede hyperpigmenteringer og cellulær skade.10,11 Derfor har syntetiserede antioxidative forbindelser mange biofunktionelle anvendelser i hudplejeapplikationer.

Fulleren (C60), carbon nanorør (CNT), grafen og graphene nanoribbon (GNR) er fire slags sp2 nanocarbon, der forskes vidt omkring i verden.12 Fulleren og dets derivater eller komplekser er blevet betragtet som stærkefrie radikaleri lang tid. Yodh et al. brugt vandopløseligt C60 som et beskyttende middel mod katabolisk stress-induceret degeneration. Inject et al. konkluderede, at C60(OH)24 er en stærk antioxidantforbindelse, når det oxidative stress er for højt. Okuda et al. foreslog, at C60-komplekser kan forhindre NO-medieret celleskade.13,14 Tong et al. viste, at C60-komplekser kan være lovende kandidater til behandling af hjernerelaterede sygdomme forårsaget af øgede niveauer af superoxid. Faktisk identificerede et japansk firma fullerener med en stærk antioxidantaktivitet til kosmetisk brug i 2006. Lucente-Schultz et al. demonstreret, at funktionaliserede enkeltvæggede CNT'ers (SWCNT'ers) evne til at fjerne oxygenradikaler er næsten 40 gange større end dendritiske C60.15−19 Fenoglio et al. observerede, at flervæggede CNT'er (MWCNT'er) har en bemærkelsesværdig radikalopfangende kapacitet i kontakt med en ekstern kilde til hydroxyl- eller superoxidradikaler.20 Beregninger af densitetsfunktionsteori afslørede også en model af SWCNT'er som frie radikaler. I 2004, Novoselov et al. viste først, at grafen udviste en stærk ambipolær elektrisk effekt og kunne være lovende til elektroniske anvendelser.21 Herefter fortsatte de med at vise, at grafen har elektroniske egenskaber, der er karakteristiske for en 2D-gas af partikler beskrevet af Dirac-ligningen.22,23 Siden disse to banebrydende artikler, er der blevet givet mere og mere opmærksomhed til grafen-baseret forskning.24−30 For eksempel har Qiu et al. i 2014 viste, at grafenoxid og fålagsgrafen udviser betydelig antioxidantaktivitet og kan beskytte forskellige biomolekylære molekyler mod oxidation.31 Han et al. eksperimentelt demonstreret i 2007, at energigabet i GNR'er kan kontrolleres under litografiprocessen ved at ændre båndbredden.32 Blandt de fire nanocarboner har GNR'er fået mindst opmærksomhed. Så vidt vi ved, er der kun lidt forskning i antioxidantegenskaberne af grafenoxid-nanobånd (GONR'er).31,33 Derfor forberedte vi i denne undersøgelse omhyggeligt MWCNT'er, korte MWCNT'er, GONR'er og korte GONR'er og havde til formål at sammenligne deres antioxidantegenskaber og relaterede resultater systematisk.

2. RESULTATER OG DISKUSSION

2.1. Morfologi af MWCNT'er og GONR'er.

Figure 1a shows the low- and high-magnification transmission electron microscopy (TEM) images of MWCNTs and short MWCNTs. Following acidic cutting under ultrasonication, the length of MWCNTs could be shortened from >10 μm til 2−3 μm. Samtidig blev det observeret, at salpetersyrebehandlingen gør de glatte røroverflader ru. Nogle hak og uregelmæssige former vises på billedet med høj forstørrelse. Yderligere opnår anvendelse af MWCNT'er og korte MWCNT'er gennem mikrobølgereaktioner henholdsvis GONR og kort GONR. Vi illustrerede også TEM-billederne med lav og høj forstørrelse af GONR og korte GONR. På grund af den store langsgående udskæring og mindre vandrette skæring ser det ud til, at GONR'er var kortere end MWCNT'er. På den anden side viste billeder med høj forstørrelse større diametre, det vil sige 0.11−0,18 μm, af GONR'er end dem af MWCNT'er, hvilket indikerer, at udpakningsprocessen var vellykket. Tilsvarende udviste korte GONR'er en kortere længde og større diameter end korte MWCNT'er. I luftkompressoren i vores nye udpakningsproces var GONR'ernes tynde lagstrukturer mindre end det, vi opnåede i den tidlige rapport for den samme mikrobølgeeffekt på 250 W, mens de tykkere centrale MWCNT'er bibeholdtes.12 Dette betød en MWCNT med en kerneskal. /GONR-heterostruktur vil mere sandsynligt dukke op i stedet for den fuldt udpakkede nanobåndstruktur gennem alle mikrobølgekræfter i den nye proces. For at sammenligne med den korte GONR i vores tidligere undersøgelser34 genererede den højere mikrobølgeeffekt flere hak på siden af ​​båndene og dannede ikke pæne, glatte båndkanter. Bemærk, at vi brugte to forskellige slags Cu-gitre i figur 1a. For MWCNT'er og GONR'er med tilstrækkelig længde blev Gu-gitteret med en lacey formvar stabiliseret med carbon (produktnr. 01881-F, Ted Pella, Inc., USA) brugt. De åbne huller i en blonde carbonfilm forhindrede et overlappende transmissionsbillede mellem nanocarboner og carbonfilmen. De mørkegrå netværk tilhører den blonde carbonfilm. Gu-gitteret med formvar stabiliseret med kulstof (produktnr. 01800-F, Ted Pella, Inc., USA) var imidlertid nødvendigt for kort MWCNT og kort GONR. Dette skyldtes, at de store huller i den blonde carbonfilm forårsagede problemer med at holde den korte MWCNT og den korte GONR effektivt. Som illustreret i figur 1 er den lysegrå kontrast under de korte MWCNT'er og korte GONR'er et let lag af kulstof. Dette kulstoflag stabiliserede formvar-filmen udsat for elektronstrålen via dens varme- og elektrisk ledende egenskaber.

2.2. Bindingskonfigurationer af MWCNT'er og GONR'er.

Raman-spektrene for de fire nanocarboner er vist i figur 1b; D-båndet af GONR'er var højere end det for MWCNT'er efter udpakningsprocessen. Dette blev tilskrevet det højere oxidationsniveau og større antal kantstrukturer af GONR sammenlignet med MWCNT'er. Dette fænomen ligner også det, vi observerede i 2011.12 På grund af det høje grafitiseringsniveau havde G-båndet af MWCNT'er det laveste antal i fuld bredde ved halvt maksimum. ID/IG-forholdene for de fire nanocarboner var {{10}}.076, 0.502, 0.483 og 0.700, henholdsvis. Kort fortalt øgede den reducerede længde og overfladeoxidation defektniveauet og gjorde dermed ID/IG-forholdene højere. D′-toppen er til stede i alle defekte grafener og ses som et mål for kvalitet.35 Som illustreret i figur 1b bliver D′-toppen i de fire spektre mere fremtrædende efter enten skære- eller udpakningsprocessen, hvilket tyder på, at de er destruktive processer, der introducerer mange defekter. Figur 1c,d viser røntgenfotoelektronspektroskopispektrene for de fire nanocarboner. Tilsyneladende er D′-toppen den klareste for korte GONR'er. Som vist i figur 1c steg O-niveauet signifikant fra 7,6 procent (MWCNT'er) til 19,9 procent (GONR'er) på grund af KMnO4's stærke oxidationsevne i et surt miljø. På den anden side steg O-niveauet lidt med 0,8 procent fra MWCNT til de korte MWCNT'er. Det er vigtigt, at det højeste O-niveau er 38,3 procent for den korte GONR, hvilket antyder, at enderne af nanobåndene ville være lettere at vedhæfte iltfunktionelle grupper end de plane sp2-overflader. Det større antal i fuld bredde-ved-halv-maksimum og skiftet til en høj bindingsenergi af C1s-toppe efter udpakningsprocessen af ​​både MWCNT'er og korte MWCNT'er er illustreret i figur 1d. For grafenoxider kunne de dekonvoluterede toppe på siden med høj bindingsenergi tildeles C−C(CC), C−O, CO og COOH-bindinger.36 Vi karakteriserede GONR (200 W) i 2013 ,37 og resultaterne lignede denne undersøgelses resultater. Denne undersøgelse konkluderede fænomenerne med Raman-spektre, hvilket betyder, at flere oxygenholdige funktionelle grupper blev genereret under rør-til-bånd-transformationen (figur 2).

2.3. Antioxidative egenskaber af MWCNT'er og GONR'er.

2.3.1. Bestemmelse af 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl frie radikaler-aktivitetsassays.

1,1- Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) fri-radikal-fjernende aktivitet er en antioxidantplatform, der anvendes til at detektere den antioxidative kapacitet; resultaterne for de fire nanocarboner er beskrevet i tabel 2. I DPPH-assayet blev C-vitamin i en koncentration på 100 μM brugt som positiv kontrol. For at teste de antioxidative aktiviteter af MWCNT'er, korte MWCNT'er, GONR'er og korte GONR'er blev doser på 1, 5 og 1 0 mg/L inkuberet i reaktionsopløsningen for at måle egenskaberne. MWCNT'er, korte MWCNT'er, GONR'er og korte GONR'er havde moderate hæmmende evner ved 10 mg/L (19,2 ± 0.3, 12.1 ± 0.3, 26.8 ± 0.3 og 30,0 ± 0,4 procent), mens C-vitamin havde en lignende tilstand ved 100 μM (93,4 ± 0,1 procent) for undertrykkelsen.

2.3.2. Ion-chelaterende aktivitetsanalyse.

Inden for den oxidative stress-situation kan ferrozinen udvikle et kompleks med Fe2 plus, der skal måles kvantitativt. I nærvær af chelaterende mediatorer brydes komplekset, hvilket får ferro-ionerne til at reducere fra en mørkerød farve af Fe2 plus-komplekset. Vi brugte EDTA som positiv kontrol. Tabel 2 viser, at MWCNT'er, korte MWCNT'er, GONR'er og korte GONR'er havde chelaterende aktivitet ved 10 mg/L (29,2 ± {{10}}.8, 28.7 ± 0 0,7, 69,7 ± 0,6 og 68,9 ± 0,3 procent), mens den positive kontrol havde den lignende tilstand ved 100 μM (93,4 ± 0,1 procent).

2.3.3. Ferri-reducerende antioxidant effektmåling.

Det ferri-reducerende potentialeassay er en enkel og pålidelig test, der bruges til at kvantificere Fe(III)-ferricyanidkomplekssyntesen. I dette assay blev den reducerende kraft af de fire nanocarboner, der producerer ferro-Fe(III)-TPTZ-komplekset, påvist ved ændringer i opløsningens farve fra gul til grøn og blå. Tabel 2 viser, at de reducerende kræfter af MWCNT, kort MWCNT, GONR og kort GONR var optisk tæthed (OD) 1,11, 1,13, 1,15 og 1,11 ved 10 mg/L.

2.3.4. MWCNT'er og GONR'er hæmmer intracellulær ROS-akkumulation.

Mange rapporter har vist, at ROS ødelægger den strukturelle integritet af cellemembraner, herunder cellemembraner og kernemembraner for at føre til celleskade og tab af normal funktion.38−40 Derudover er ROS også en af ​​de vigtige faktorer til at katalysere tyrosinasedannelse melanin, og inhiberingen af ​​ROS-produktion er en god strategi til at nedregulere melaninsyntesen. I denne undersøgelse brugte vi 2',7'-dichlordihydrofluoresceindiacetat (DCFDA)-farvningsassayet til at analysere det intracellulære oxidative stressniveau i MWCNT- og GONR-behandlingsceller. Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) inducerede oxidative stimuleringer i MWCNT- og GONR-grupper og blev brugt som en negativ kontrol.41 Når koncentrationen af ​​PMA var 20 ng/mL, inducerede det oxidativt stress, hvilket øgede værdien til 38 procent; efter behandling af GONR'er og MWCNT'er blev niveauerne af ROS nedreguleret til det normale niveau. Dataene viste, at begge materialer hæmmede oxidative stressniveauer, og den antioxidative effekt af GONR'er var højere end MWCNT'er (figur 3). Tabel 1 viser en lignende konsekvensliste. Vi hævdede, at der er tre grunde til vores nye resultater: For det første var rækkefølgen af ​​opløselighed af disse materialer som følger: korte GONR'er > GONR'er > korte MWCNT'er > MWCNT'er, hvilket betyder, at kontaktområdet for korte GONR'er var det største, så det var overlegen til ROS-oprensning. For det andet var GONR'er og MWCNT'er sp2-kulstofstrukturer, der kunne ødelægge ROS-elektricitet gennem adduktdannelse eller elektronoverførsel.42 Vi fandt ud af, at antioxidantvirkningerne af nanobåndstrukturerne var bedre end nanobåndsstrukturernes, så nanobånd gør det lettere at overføre elektroner end nanorør. Endelig, i figur 1b, observerer vi, at GONR sp2-kulstofstedet indeholdt flere oxygenfunktionelle grupper end MWCNT'er, carboxylsyregrupperne kunne chelatere metalioner, og hydroxylgrupperne kunne være en H-donor til at opfange ROS og hæmmer melaninproduktionen.

2.4. Cytotoksicitet af MWCNT'er og GONR'er behandlet i humane dermale fibroblastceller.

{{0}}(4,5-dimethylth-iazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-metoden blev anvendt til at evaluere cytotoksiske egenskaber af GONR'er på Hs68-celler (figur 3), og celler blev dyrket i forskellige doser på 1, 5 og 10 ug/ml. Vi undersøgte, at cellelevedygtigheden af ​​MWCNT var 100,7 ± 3,7, 99,8 ± 4,9 og 94,1 ± 4,7 procent ved koncentrationer på henholdsvis 1, 5 og 10 mg/L; levedygtighed for den korte MWCNT blev beregnet i samme rækkefølge og blev fundet at være 93,9 ± 2,2, 86,4 ± 3,0 og 98,9 ± 2,1 procent. Vi observerede, at B16-F10-cellerne blev inkuberet i høje koncentrationer, og celleoverlevelsen af ​​Hs68-celler var mere end 80 procent, hvilket tyder på, at MWCNT og korte MWCNT ikke havde nogen toksisk virkning på humane dermale fibroblastceller. Cellelevedygtighederne for GONR og kort GONR var 86,24 ± 2,1, 90,87 ± 3,5, 88,58 ± 2,5, 89,03 ± 3,6, 90,71 ± 2,8 og 90,64 ± 2,5 procent. Det er også påpeget i figur 4a, at GONR og kort GONR ikke havde en mærkbar cytotoksisk virkning på HS68-celler. I tidligere rapporter kunne brugen af ​​utestede nanomaterialer til kosmetiske formål betragtes som tvivlsom,43,44 og det skyldtes sædvanligvis angrebet af DNA, efter at nanopartiklerne trængte ind i cellerne. Efter cytotoksicitetstest fandt vi ud af, at vores materialer ikke forårsagede toksicitet for normale hudceller. Vi konkluderede, at efter at nanomaterialer kom ind i cellerne, hæmmer nanomaterialerne bare melaninproduktionen ved at reducere det oxidative stress og chelaterende metalioner og beskadiger ikke mitokondrierne eller DNA, hvilket betyder, at MWCNT'er og GONR'er var sikre at blive brugt.

2.5. To typer MWCNT'er og GONR'er i B16−F10 cellulær tyrosinaseaktivitet og melaninindhold.

I melaninsyntesevejen spiller tyrosinase en kritisk rolle. Tyrosinase oxiderer og danner eumelanin og pheomelanin gennem en række biokemiske reaktioner. For at bestemme, om GONR'er og MWCNT'er hæmmer aktiviteterne af tyrosinase og forårsager et fald i melaninproduktionen, analyserede vi tyrosinaseaktiviteten i B16-F10-celler. Vi fandt ud af, at MWCNT'er og korte MWCNT'er hæmmede tyrosinaseaktivitet med cirka 17,1 procent og 23 procent ved 10 mg/L. GONR'er og korte GONR'er havde en bedre virkning til at undertrykke tyrosinaseaktiviteten ved de samme koncentrationer sammenlignet med en anden GONR. De var også på en dosisafhængig måde og hæmmede 49,8 procent og 44,7 procent af tyrosinaseaktiviteten, som vist i figur 4b.

Melanin er et uundværligt pigment i menneskekroppen, men overekspression af melanin udløser ofte en række sygdomme. I tidligere undersøgelser har Xiao et al. brugte et lignende materiale, Radical Sponge, en fullerennanopartikel, som et anti-melaninmiddel.45 Der var nogle gode resultater; omkring 20 procent af melaninproduktionen kunne hæmmes. For at forbedre dets effektivitet forbedrede vi yderligere testmaterialet for at måle inhiberingshastigheden af ​​melanin og dets molekylære mekanisme, som vist i figur 4c og 5. MWCNT'er og korte MWCNT'er reducerede melaninindholdet med 17,6 ± 5,5 og 13,2 ± {{ 16}},2 procent ved 10 mg/L og på en dosisafhængig måde. GONR'er og korte GONR'er nedregulerede kraftigt værdierne til 32,0 ± 2,3 og 35,3 ± 3,4 procent ved 10 mg/L. De eksperimentelle resultater antydede, at alle fire typer kunne hæmme syntesen af ​​melanin og GONR'er havde en stærkere effekt. På den anden side har vi også observeret, at den korte GONR har en bedre effekt til at hæmme melaninproduktionen. Vi konkluderer, at de korte GONR'er har flere funktionelle grupper og effektivt kan forhindre metalion-katalyseret tyrosinase, hvilket yderligere hæmmer produktionen af ​​melanin (figur 2). I tabel 1 observerer vi, at indsatsen af ​​metalion-chelaterende kort type er højere end den normale type; dette betyder, at disse korte GONR'er potentielt kan anvendes i det kosmetiske område som hudplejemidler.

2.6. Mekanisme af MWCNT'er og GONR'er hæmmede B16−F10-cellulært melaninindhold.

Celler reagerer på det eksterne oxidative stress ved at regulere proteinekspressionen. B16−F10-celler øger c-myc-genekspression og opregulerede AMPK for at reducere oxidative niveauer,46 og i dette arbejde er MITF en specifik transkriptionsfaktor af tyrosinase til at regulere den molekylære melaninsyntese signalvej.47−49 I figur 5a, nedregulerer MWCNT'er og GONR'er den mikroftalmi-associerede transkriptionsfaktor ved at reducere det oxidative stress, og derefter blev downstream-genet TRP-1 og TRP-2 også nedreguleret. For proteinniveauet blev der fundet et lignende fænomen, hvor MWCNT'er og GONR'er nedregulerede den MITF-relaterede melanogenese-vej og derefter til sidst reducerede melaninindholdet (figur 5b).

3. EKSPERIMENTELLE MATERIALER OG METODER

3.1. Udarbejdelse af MWCNT'er og GONR'er.

Den relevante proces til fremstilling af GONR'er blev rapporteret i et tidligere papir.12 MWCNT (0.05 g) blev suspenderet i 9:1 H2SO4/H3PO4 og behandlet med en mikrobølgereaktor (CEM-Discover) med effekten indstillet til 250 W i 2 min. Efter tilsætning af KMnO4 (0,25 g) til opløsningerne blev opløsningerne behandlet med den samme mikrobølgeeffekt ved 65 grader i 4 min. Her bruges luftkompressoren til at styre temperaturen på mikrobølgereaktoren under processen. Mikrobølgeeffekten blev sat til 250 W i de indledende test.

3.2. Udarbejdelse af korte MWCNT'er og korte GONR'er.

Den relevante proces til fremstilling af korte GONR'er blev rapporteret i vores tidligere papir.34 Den sure behandlingstid blev valgt til 8 timer. Mikrobølgeeffekten blev sat til 250 W, hvilket er det samme som for at få GONR'er.

3.3. DPPH Radical Scavenging Activity.

DPPH blev ofte brugt til at bestemme prøvernes opfangningskapacitet og antioxidationsegenskaberne.50 DPPH er et lilla reagens, der ændrer farven fra lilla til gult, hvis det frie radikal overføres til analytten. Positive antioxidative prøver med passende koncentrationer blev tilsat til opløsningen, og prøverne blev analyseret ved 517 nm i 30 min. Vi brugte procenterne af den resterende DPPH udover testprøverne til at måle mængden af ​​antioxidant, der kræves for at reducere de tidligere DPPH-radikaler. Vitamin C ved 100 μM blev brugt som den positive kontrol. Opfangningsaktiviteten (procent) blev målt som

Opfangningskapacitet ( procent )=(Asample − Ablank) / (Acontrol − Ablank) × 100 procent (1)

3.4. Metal-chelaterende aktivitet.

Metalion er den faktor, der forårsager lipidoverdreven oxidation, og Fe2 plus er en af ​​de mest påvirkende ioner.50 Forskellige koncentrationer af nanobiomateriale (1 μL) blev fyldt i en 96-brøndsplade, som indeholdt 2 mM FeCl2·4H2O (10 μL), og derefter fyldt i ferrozin (5 mM, 20 μL). Blandingen blev fuldstændig blandet med 69 μL menthol og holdt ved stuetemperatur i 10 min. Derefter blev prøvereaktionsopløsningen observeret ved 562 nm. EDTA blev brugt som en positiv kontrol ved 100 μM, og beregningsformlen for metalchelaterende aktivitet var baseret på ligning 1.

3.5. Reducerende kraft.

Beregningen af ​​reducerende effekt er baseret på en tidligere undersøgelse.50 Først blev 2,5 μL grafenmaterialer blandet med PBS-buffer (67 mM, pH 6,8) og K3Fe(CN)6 (2,5 μL, 20 procent) og derefter inkuberet ved 50 grader i 20 min. Derefter blev 10 procent trichloreddikesyre (160 μL) blandet med reagenserne ved 300 g centrifugeret i 20 minutter. Absorptionslængden blev bestemt ved 700 nm efter at være blevet blandet med 25 μL FeCl3 (2 procent). Butyleret hydroxyanisol (BHA) blev anvendt ved 100 μM.

3.6. Celleproliferationsundersøgelser.

Den humane dermale fibroblastcellelinje HS68 blev anvendt til at analysere forholdet mellem celleproliferation. HS68 blev inkuberet i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM) indeholdende 10 procent føtalt bovint serum og 1 procent penicillin og streptomycin blandet.50,51 Efter at være blevet behandlet med forskellige koncentrationer af prøver påførte vi MTT for at påvise celleproliferationsforholdet. 8000 celler blev podet i 96-brøndsplader og behandlet med prøver i 24 timer. Supernatantopløsningen blev fjernet, og vi brugte MTT-opløsningen til dyrkning i 2 timer ved 37 grader. Efter inkubation fjernede vi det MTT-holdige medium og opløste det med dimethylsulfoxid (DMSO). Opløsningen blev aflæst ved OD 590 nm, og hastigheden blev beregnet ved eq 1.

3.7. Vurdering af cellulært melaninindhold.

Vi brugte en metode med mindre modifikationer baseret på det tidligere assay.52,53 Cellepelleter af B16−F10 fra Bioresource Collection and Research Center (BCRC, CRL 6323, Hsinchu, Taiwan) blev opløst i en blanding af 2,0 N NaOH og 10% DMSO. Prøven blev efterfølgende opvarmet i 1 time ved 90 grader og centrifugeret ved 10,000g i yderligere 10 minutter for at opnå den klarede supernatant. Melanintallet blev bestemt ved at overvåge OD af supernatanten ved 475 nm.

3.8. B16−F10 Cellulær tyrosinaseaktivitet.

For den cellulære B16−F10-tyrosinaseaktivitet henviste vi til det tidligere arbejde med nogle modifikationer.50 Celler blev dyrket i 12-brøndsplader med 105 celler hver brønd. Efter behandlinger med prøver blev celler lyseret i 1 procent Triton X-100/PBS og 2 mM L-tyrosin (50 μL) i 3 timer. Efter inkubationen fjernede vi mediet og aflæste absorbansen ved OD 590 nm. Tyrosinaseaktivitetsformlen blev beregnet ved lign. 1.

Cistanche er en tyrosinasehæmmer.

3.9. Påvisning af ROS ved DCFDA-farvning.

Med henvisning til den tidligere undersøgelse,54 1.2 1.105 B16−F10-celler blev podet i 6-brøndsplader og behandlet med forskellige koncentrationer af prøver. Celler blev suspenderet i PBS og derefter fyldt med DCFDA (5 μM) i ikke-phenolrød DMEM i 30 minutter ved 37 grader. Flowcytometeret (Guava, Merck, Tyskland) blev brugt til at detektere det fluorescerende signal fra DCFDA. Excitations- og emissionsbølgelængder af DCFDA var henholdsvis 488 og 535 nm.

3.10. Kvantitativ realtids polymerasekædereaktion.

Vi fulgte metoderne ifølge Lin et al. (2018).1 Kvantitativ revers transkription-polymerase-kædereaktion i realtid (qRT-PCR) bestod af en eksklusiv primerprobe til at generere fluorescens. Den brugte en fluorescensdetektionsteknik, der registrerer hver cyklus ved hjælp af et 7500 qRT-PCR-system (Applied Biosystems, USA). Den detekterede cyklussen baseret på mængden af ​​frigivet fluorescens, og derefter blev produktet af hver cyklus beregnet for det genererede indhold, hvilket resulterede i opnåelse af kvantitative realtidsformål. Trizol (Invitrogen, USA) blev brugt til at ekstrahere et komplet RNA af lungevævet i henhold til anvisningen givet af producenten. Efterfølgende blev et revers transkriptionskit (Takara, Japan) brugt til at generere DNA. I qRT-PCR'en under anvendelse af primere, anført i tabel 1, blev prøven først opvarmet til dannelse af en enkelt DNA-streng; derefter fandt en primerbinding sted til dannelse af et dobbeltstrenget DNA (dsDNA), hvorefter SYBR Green dsDNA blev kombineret, hvortil SYBR green plus reagenskit (Roche, Basel, Swiss) blev brugt, hvilket resulterede i frigivelse af fluorescens. Det resulterende produkt blev ført gennem et fluorescensdetektionssystem. Detektionen af ​​fluorescerende signaler fandt sted under forlængelses- eller annealingsfasen af ​​hver cyklus; efter detektionen blev prøveindholdet skubbet tilbage af de detekterede fluorescensintensiteter.55 Ekspressionsniveauerne af målgener blev normaliseret til -tubulinniveauer ved hjælp af 2−ΔΔCt-metoden.

myricetin

3.11. Western Blot Test.

B16-F10-celler blev lyseret ved 4 grader natten over med en radioimmunpræcipitationsassaybuffer (Thermo Scientific Co., USA), som indeholder proteasehæmmere. Bicinchoninsyre-proteinassay-kittet (BCA, Sigma-Aldrich Corp., USA) blev brugt til at kvantificere proteinmængden. Prøveproteiner blev separeret på 10 procent natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgel og overført til en polyvinylidendifluorid (PVDF) membran (PALL Life Science, Ann Arbor, MI, USA). PVDF-membranen blev blokeret med en blokerende buffer (Thermo Scientific) i 1 time og inkuberet med det specifikke primære antistof natten over ved 4 grader. Derefter blev membranen vasket med Tris-bufret saltvand-Tween 20-buffer to gange og inkuberet med sekundære antistoffer i 1,5 time. Derefter blev membranen dyppet i kemiluminescensdetektionsreagenser (Thermo Scientific) og analyseret af en MiniChemi Chemiluminescence imager (Beijing Sage Creation Science, Kina). Kilder til antistoffer omfattede kanin anti-MITF, kanin anti-TRP-1, kanin anti-TRP-2 og -actin (Thermo Scientific).

3.12. Materialeanalyse.

TEM (JEOL JEM-1230, 100 kV) blev brugt til at observere morfologien af ​​nanocarbonerne. Et mikro Raman-spektrometer (PTT, RAMaker) blev anvendt for at kontrollere resonanstilstandene for nanocarbonerne. Røntgenfotoelektronspektroskopi (XPS, Kratos Axis Ultra DLD) målinger blev også udført for at bestemme sammensætningsanalysen.12,34

3.13. Statistisk analyse.

Alle prøverne og standardeksperimenterne blev gentaget mindst tre gange. Vi anvendte Elevens t-test til at sammenligne og udtrykke gennemsnittet af middelværdierne ± standardafvigelse statistisk.

4 KONKLUSIONER

For at opsummere observerede vi, at den korte GONR var potentielt materiale til hudplejeprodukter på grund af dets mange biofunktionelle egenskaber (figur 6). Resultaterne viste, at nanocarbonerne spillede en rolle som en ekstracellulær og intracellulær antioxidant. I mellemtiden hæmmede nanocarbonet tyrosinaseaktiviteten og melaninindholdet og forårsagede ikke nogen alvorlig skade på pigmentceller. Dette arbejde etablerede anti-melanogenese funktionerne af fire typer nanocarboner; fremtidige undersøgelser vil blive undersøgt mekanismen af ​​disse forbindelser på specifikke gen- og proteinekspressioner relateret til melaninmodning, transport og akkumulering.

Cistanche forbedrer blegning.

Klik venligst på billedet og få flere detaljer.