Antioxidant- og anti-aldringspotentiale i en peptidformulering (Gal2-Pep) konjugeret med gallussyre Ⅱ

3. Resultater og diskussioner

3.1. Syntese og konjugation af gallussyre med peptid

De syntetiserede peptider TPPTTP, galloyl-TPPTTP (Gal-Pep) og Gal2-Pep blev opnået og oprenset ved hjælp af semi-præparativ RP-HPLC. Fig. 1a og skema 1 viser konjugationsstrategien for gallussyre med KTPPTTP som Gal2-Pep. I SPPS-metoden omfatter de urenheder, der dannes under peptidsyntese, sædvanligvis sidereagerede peptider, aminosyrebeskyttende grupper og opløsningsmidler, der anvendes til syntese og oprensning. HOBt'en, der anvendes i peptidsyntese, er kendt for at hæmme racemisering og forbedre effektiviteten af peptidsyntese.17-19 For at fjerne aminosyrebeskyttende grupper og opløsningsmidler, der blev brugt til syntese, udførte vi vask flere gange med opløsningsmidler som DMF og DCM under peptidsynteseprocessen. Selv efter det sidste vasketrin er urenheder inklusive aminosyrebeskyttende grupper stadig til stede i spormængder. For at opfylde peptidrenheden på mere end 90 procent rapporteret af flere forskere, blev 20-22 semi-prep HPLC udført som et poleringstrin for at opnå det endelige peptid på 99,2 procent renhed som et resultat af HPLC-analyse (se fig. S1†). Det oprensede peptidprodukt blev analyseret ved hjælp af Q-TOF for at bekræfte deres vellykkede syntese (fig. 1b-d).

KSL11

Klik her for at få flere oplysninger om Cistanche Treat Anti-Aging

3.2. Cellelevedygtighedsassays

For at undersøge cytotoksiciteten af de syntetiserede peptider blev HaCaT og humane dermale fibroblastceller behandlet med forskellige koncentrationer af GA, TPPTTP, Gal-Pep og Gal2-Pepi 24 timer og analyseret ved hjælp af CCK-8-assays. Det var konfirmed detde syntetiserede peptider havde ingen toksisk virkningpå de behandlede celler,med cellelevedygtighed på mindst 88 procent for alle prøver og alletestede koncentrationer (fig. 2a og b), hvilket indikerer, at TPPTTP,Gal–Pep og Gal2–Pep er velegnet til brug i kosmetikapplikationerkationer. Derudover var det konfirmed af MTT, LDH og Griessreagensanalyse, atnaal peptid forårsagede ikke toksicitet i HAog F og indFlammatisk respons i rå 264,7. (Fig. S2–S4†).

3.3. Antioxidantaktivitet af syntetiserede peptider

Mekanismerne involveret ihudens aldringomfatteROS aktivitet, mitokondrielle DNA-mutationer, afkortningen af telomerer og hormonelle ændringer, især hos kvinder.23 ROS fungerer som cellesignalmolekyler for mange cellulære processer, såsom differentieringog spredning.24 Dog kan overdreven ROS føre tilspaltningen og unormal binding af kollagen- og elastinkæderog øge ekspressionen af MMP-1, et enzym, der går i stykkerned kollagen og fremskynder dermed aldring og celleapoptose. DerFor det er det vigtigt at fjerne ROS fra hudceller for at fremme anti-agingeffekter. I denne undersøgelse konfirmed antioxidantaktiviteten afde syntetiserede peptider gennem DPPH- og DCF-DA-assays.Fig. 3a viser resultaterne af den radikalopfangende aktivitetaf de syntetiserede peptider som målt ved anvendelse af DPPH-assay.

TPPTTP havde ingen radikalopfangende aktivitet ved nogen koncentration, mens GA, Gal-Pep og Gal2-Pep udviste højere radikalopfangende aktivitet på en koncentrationsafhængig måde.

KSL02

Iisær, Gal2–Pep viste den mest effektiveantioxidantaktivitet; ved en koncentration på 10mM, GA, Gal–Pep og Gal2–Pephavde en radikal opfangningsaktivitet på 13,6 procent, 24,23 procent og 26.0 procent,henholdsvis. Dette indikerer, at bindingen af TPPTTP til GA gørikke hæmmer den radikale opfangende aktivitet. Fig. 3b coNFIrms denstabilitet af prøverne som konfirmed ved at vurdere deres radikalerensende aktivitet ved opbevaring ved stuetemperatur. GA bibeholdtdets radikale rensende aktivitet i op til en uge, men enfteh to uger, denne aktivitet faldt med mere end 60 procent . På den andenhånd, Gal–Pep og Gal2–Pep opretholdt deres rensende aktiviteti over to uger. Især Gal2–Pep havde et radikalt skavengagerende aktivitet på 50 procent selv i sin fjerde uge. Disse resultatertyder på, at binding af GA til TPPTTP stabiliserer dets radikale fjernelseaktivitet. Nogle undersøgelser har vist, at ascorbinsyre er stabiliseretved at binde det med peptider.12,25 Vi mener, at GA kan være stabived at binde det med et peptid på samme måde.

Detpeptidernes antioxidante virkningblev også testet ved hjælp af DCF DA-assays i nærvær af intracellulært oxidativt stress induceret af H2O2 (fig. 4). Efter 24 timers behandling af prøverne på cellerne i en koncentration på 100 mM blev DCF-DA påført cellerne, og cellerne blev derefter behandlet med H2O2 i 30 minutter, og fluorescensintensiteten af DCF blev observeret ved en excitation bølgelængde på 485 nm og en emissionsbølgelængde på 535 nm. Celler udsat for oxidativ stress med 1 mM H2O2 udviste fluorescensintensitet, der var mere end tre gange højere end den negative kontrol; Imidlertid producerede Gal2-Pep-behandling en fluorescens, der kun var 67 procent af den, der blev produceret af celler, der kun var behandlet med H2O2. I nærvær af TPPTTP, som ikke udviste radikal opfangende aktivitet (fig. 3a), blev ROS-stress forårsaget af H2O2 reduceret med omkring 20 procent, hvilket understøtter tidligere forskning, der har rapporteret, at TPPTTP nedsætter ROS-niveauer i celler.24 Når cellerne blev kun behandlet med GA, var der ingen signifikant ændring i ROS-niveauer. Tilsammen tyder disse resultater på, at Gal2-Pep, som kombinerer to GA-molekyler med et peptid, er en stabil og effektiv antioxidant.

3.4. Effekt af syntetiserede peptider på mitokondriernes membranpotentiale

I denne undersøgelse blev JC-1 farvestof brugt til at undersøge virkningen af de syntetiserede peptider på MmP (DJm). MmP fungerer som en vigtig parameter for mitokondriel funktion og er kendt for at være forbundet med adskillige sygdomme, såsom Alzheimers og Huntingtons sygdom.26 JC-1 farvestof producerer en rød skjorte fra grønne emissioner ved at akkumulere i mitokondrier og danne J-aggregater. Efter behandling af HaCaT- og fibroblastcellerne med de syntetiserede peptider i 24 timer, blev cellerne udsat for JC-1 farvestof i 10 minutter, og derefter blev fluorescensintensiteten målt ved hjælp af en mikropladelæser (grøn lEx ¼ 475 nm og lEm ¼ 530 nm, rød lEx ¼ 475 nm og lEm ¼ 590 nm). Forholdet mellem den røde og grønne fluorescens blev udtrykt som fold-ændringen sammenlignet med den negative kontrol (fig. 5). HaCaT-celler behandlet med GA og peptidet uafhængigt udviste ikke nogen signifikant ændring sammenlignet med den negative kontrolgruppe, mens Gal2-Pep udviste en signifikant forskel, hvilket steg 1.45- gange sammenlignet med kontrollen. Fibroblastcellerne behandlet med Gal2-Pep også signifikant

øget 1.12-fold sammenlignet med den negative kontrol. Stigningen i MmP med Gal2-Pep-behandling indikerer klart, at Gal2-Pep er et biomolekyle, der kan anvendes i anti-aging kosmetik.

cistanche anti-aging

Fig. 4 Intracellulære antioxidantaktivitetsassays under anvendelse af DCF-DA ved gallussyre- og peptidkoncentrationer på 100 mM. Efter 24 timers behandling blev H2O2 tilsat og inkuberet i 30 minutter, efterfulgt af måling af DCF-fluorescensintensitet. Stjerner indikerer statistisk signifikante forskelle (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).

cistanche anti-aging

Fig. 5 Måling af mitokondriemembranpotentialet ved anvendelse af JC-1-farvestof i (a) HaCaT-celler og (b) dermale fibroblaster. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (*p < 0.05, **p < 0,005, ***p<0.001)

cistanche anti-aging

Fig. 6 Måling af elastaseaktiviteten i dermale fibroblaster ved gallussyre- og peptidkoncentrationer på 100 mM. Stjerner angiver statistisk signifikante forskelle (*p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,001).

3.5. Elastaseinhiberende aktivitet

Elastase fremmer hudens aldring ved at nedbryde kollagen eller elastin i huden, så det kan forhindre hudens aldring ved at hæmme elastase.27 Fig. 6 viser elastaseaktivitet i CCD-1064Sk-cellerbehandlet med hver prøve. TPPTTP har en sjælden effektpå elastasehæmning. Men behandling med gallussyre, Gal–Pep, ogGal2–Pep viste elastaseaktivitet med 69 procent, 84 procent og 76 procent,henholdsvis. Gal2–Pep hæmmede elastase med 7 procent mindre endGA. Men når man overvejer resultaterne af måling afantioxidant virkning, langtidsstabilitet og mitokondriemembranpotentiale, Gal2–Pep var mere effektivend GA som enanti-aldringsmiddel.

cistanche anti-aging

3.6. Ekspression af type I collagen, MMP-1 og PGC-1a gener

Fig. 7 viser RT-qPCR-data for type I collagen, MMP-1 og PGC-1genekspression. Type I kollagen, en vigtig bestanddel af kollagenfamilien, der findes i huden, falder med aldringskrider frem.28 Da Gal2–Pep blev brugt til at behandlefibroblaster til8 timer og 24 timer steg ekspressionen af type I kollagenca. henholdsvis 1.19- og 1.21-fold. Med GA ogGal–Pep, der var ikke noget væsentligtændre after 2 timer og 8 timer, mentype I kollagenekspression steg 1.16- og 1.26-fold efter 24h, henholdsvis. Med TTPTTP behandling dog udtrykøget med 1.24-fold ififørste 2 timer og derefter gradvister faldet. ENfter 24 timer, var ekspressionsniveauet det samme som forden negative kontrol (fig. 7a). For MMP-1, udtryksniveauer på{{0}}.43, 0.44 og 0.68-fold blev observeret enfter 24 timer med GA, Gal–Pep og Gal2–Pep-behandling hhv. Hertil kommerekspressionsniveauer med GA-behandling steg med 1.46-fold efter 2h. Med TPPTTP faldt MMP{{0}} udtryk 0.87-fold efter 2h, men blev efterfølgende lig den negativestyring. Samlet set genoprette kollagenniveauer, som ellersaftager med aldring, hjælper med at forbedre rynker.28

cistanche anti-aging

Fig. 7 Genekspressionsanalyse i dermale fibroblaster ved anvendelse af RT-qPCR: (a) type I kollagen, (b) MMP-1 og (c) PGC-1a.

Ekspressionen af PGC-1a var højest efter 8 timer for alle behandlinger, med ekspressionshastigheder for GA, TPPTTP, Gal–Pep og Gal2–Pep stigende 2.06-, 1.{{6} }, henholdsvis 1.07- og 2.05-fold. Men i modsætning til de andre behandlinger øgede Gal2-Pep PGC-1et udtryk 1.27-fold efter 24 timer. PGC-1aregulerer syntesen og antioxidantvirkningerne af mitokondrierog indberettes tilfalde med aldring.29–32 Derfor har Gal2–Pep potentialet til at blive brugt som en effektiv antioxidant, der effektivt kan beskytte mod ROS.

Alt sammen øgede Gal2-Pep ekspressionen af PGC-1a og kollagen sammenlignet med virkningerne af GA og TPPTTP alene, mensudtryk for MMP-1 havde en tendens til at falde, hvilket illustrerer dets potentiale til brug ianti-aging kosmetik.

KSL26

4. Konklusion

I denne undersøgelse udviste Gal2-Pep, som blev udviklet ved at kombinere GA og peptidet TPPTTP, fremragendeantioxidant aktivitetog mitokondriel aktivering i hudceller. Cellelevedygtighedsresultaterne indikerede klart, at Gal2-Pep ikke har nogen cytotoksisk effekt på hudceller. Gal2-Pep viste også dosisafhængig antioxidant- og frie radikal-fjernende aktivitet,med ROS-opfangningsaktivitet på over 50 procent selv efterr opbevaring tilfire uger ved stuetemperatur. Det påvirkede også positivt MmP og øgede udtrykket af PGC-1a, hvilkenregulerer mitokondriesyntesen og har en antioxidant f.eksffectved at fjerne frie radikaler i huden. Gal2–Pep ogsåøget ekspressionen af type I kollagen og nedsat elastaseaktivitet og udtrykket for MMP-1, hvilket beviser, at det holderløfte om brug i anti-aging kosmetik.

Interessekonflikt

Der er ingen konflikter at erklære.

Anerkendelser

Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Korea Industrial Complex Corp. (KICOX, NTIS nr. 1415165722) og Inha University Research Grant.

Referencer

1 P. Brenneisen, H. Sies og K. Scharfffetter-Kochanek, Ann. NY Acad. Sci., 2002, 973, 31-43.

2 A. Trifunovic, A. Wredenberg, M. Falkenberg, JN Spelbrink, AT Rovio, CE Bruder, M. Bohlooly-Y, S. Gldl¨of, A. Oldfors,R. Wibom, J. T¨ornell, HT Jacobs og NG Larsson,

Nature, 2004, 429, 417-423.

3 SB Khan, CS Kong, JA Kim og SK Kim, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2010, 15, 191-198.

4 H.-J. Kim, K.-W. Kim, B.-P. Yu og H.-Y. Chung, fri radikal biol. Med., 2000, 28, 683-692.

5 M. Erden Inal, A. Kahraman og T. Koken, Clin. Exp.Dermatol., 2001, 26, 536-539.

6 HS Jin, SY Park, JY Kim, JE Lee, HS Lee, NJ Kang og DW Lee, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2019, 24, 240-249.

7 H. Masaki, J. Dermatol. Sci., 2010, 58, 85-90.

8 TSA Thring, P. Hili og DP Naughton, BMC komplementær alternativ. Med., 2009, 9, 27.

9 L. Quiles-Carrillo, S. Montava-Jord a, T. Boronat, C. Sammon, R. Balart og S. Torres-Giner, Polymers, 2019, 12, 31. 10 DH Park, DH Jung, SJ Kim, SH Kim og KM Park,

BMC Biochem., 2014, 15, 4-10.

11 YJ Cheng, GF Luo, JY Zhu, XD Xu, X. Zeng, DB Cheng, YM Li, Y. Wu, XZ Zhang, RX Zhuo og F. He, ACS Appl. Mater. Interfaces, 2015, 7, 9078–9087.

12 H. Lee, ATE Vilian, JY Kim, MH Chun, JS Suh, HH Seo, SH Cho, IS Shin, SJ Kim, SH Park, Y.-K. Han, JH Lee og YS Huh, RSC Adv., 2017, (48), 30205-30213.

13 Y. Kong, C. Xu, ZL He, QM Zhou, J. Bin Wang, ZY Li og X. Ming, Peptides, 2014, 53, 70-78.

14 H. Kim, JS Kim, YG Kim, Y. Jeong, JE Kim, NS Paek og CH Kang, Biotechnol. Bioprocess Eng., 2020, 25, 421-430.

15 MA Frezzini, F. Castellani, N. De Francesco, M. Ristorini og S. Canepari, Atmosphere, 2019, 10(12), DOI: 10.3390/atmos10120816.

16 A. Rengaraj, P. Puthiaraj, NS Heo, H. Lee, SK Hwang,S. Kwon, WS Ahn og YS Huh, Colloids Surf., B, 2017,160, 1-10.

17 T. Miyazawa, T. Otomatsu, Y. Fukui, T. Yamada og S. Kuwata, J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1988, 419-420.

18 SM Mali, M. Ganesh Kumar, MM Katariya og HN Gopi, Org. Biomol. Chem., 2014, 12, 8462-8472. 19 T. Michels, R. D ¨olling, U. Haberkorn og W. Mier, Org. Lett., 2012, 14, 5218-5221.

20 P. Song, W. Du, W. Li, L. Zhu, W. Zhang, X. Gao, Y. Tao og F. Ge, Nanomater. Nanotechnol., 2020, 10, 1-10.

21 M. De Zotti, B. Biondi, Y. Park, K.-S. Hahm, M. Crisma, C. Toniolo og F. Formaggio, Aminosyrer, 2012, 43, 1761-1777.

22 Z. Zhai, K. Xu, L. Mei, C. Wu, J. Liu, Z. Liu, L. Wan og W. Zhong, So Matter, 2019, 15, 8603–{{4 }}.

23 DJ Tobin, J. Tissue Viability, 2017, 26, 37-46.

24 M. Schieber og NS Chandel, Curr. Biol., 2014, 24, 453-462.