DEL 1 Antidepressiv-lignende virkninger af Cistanche Tubulosa-ekstrakt på kronisk uforudsigelig stressrotter gennem genopretning af tarmmikrobiota-homeostase

Voksende beviser viser, at neuropsykiatriske lidelser, såsom depression, er forbundet med tarmmikrobiomet gennem tarm-hjerne-aksen.Cistanches Herbaer velkendt for behandling af "nyre-yang"-mangel i traditionel kinesisk medicin (TCM) og er blevet brugt til behandling af neurodegenerative sygdomme i de senere år. I denne undersøgelse blev den kronisk uforudsigelige stress (CUS)-induceret depressionsmodel etableret for at udforske virkningen afCistanche tubulosaekstrakt (CTE) på adfærdstests, monoamin-neurotransmittere og neurotrofiske faktorer i hippocampus og colon, tarmmikrobiotasammensætning og produktion af kortkædede fedtsyrer (SCFA'er). Desuden blev korrelationsanalyse brugt til at evaluere det funktionelle forhold mellem ændret tarmmikrobiota, ændrede neurotransmittere og neurotrofiner i hippocampus og colon og forstyrret koncentration af SCFA'er. CTE forbedrede signifikant depressionslignende adfærd hos rotter under CUS. Hjerneniveauet af 5-hydroxytryptamin (5-HT) og hjerneafledt neurotrofisk faktor (BDNF)-ekspression i CUS-rotter blev genoprettet af CTE. Den relative overflod af tarmmikrobiota og koncentrationerne af acetat og hexansyre kan også moduleres ved CTE-behandling. Vi viste yderligere, at anvendelsen af ​​CTE i CUS-rotter førte til en stærk korrelation mellem forstyrret tarmmikrobiotasammensætning, hippocampus-neurotransmitterniveauer og produktion af neuroaktive metabolit-SCFA'er. Alt i alt identificerer disse resultater CTE som en potentiel behandling af depressive symptomer ved at genoprette homeostase af tarmmikrobiota for mikrobiota-tarm-hjerneakselidelser, hvilket åbner nye veje inden for neuropsykofarmakologi.

Nøgleord: Cistanche tubulosa, antidepressiv, kronisk uforudsigelig stress, tarmmikrobiota, mikrobiota-tarm-hjerne-akse

For mere information kontakt venligst:Joanna.jia@wecistanche.com

Cistanche deserticola har mange effekter, klik her for at vide mere

INTRODUKTION

Cistanches Herba(Rou Cong-Rong på kinesisk) er officielt registreret som de tørrede saftige stængler afCistanche deserticola(YC Ma) ogCistanche tubulosa(Schrenk) i Chinese Pharmacopoeia Commission (2015). Det er en velkendt traditionel kinesisk medicin (TCM) til behandling af nyremangel, impotens, kvindelig infertilitet, sygelig leukorrhea, voldsom metroragi,

Echinacosidei cistanche kan fremmesårheling

og senil obstipation (Chinese Pharmacopoeia Commission, 2015). Tidligere undersøgelser har afsløret flere kemiske hovedbestanddele afCistanches Herba, herunder phenylethanoidglycosider (PhG'er), iridoider og iridoidglycosider, lignaner, alditoler, oligosaccharider og polysaccharider. Farmakologisk analyse har vist, at Cistanches Herba udviser en bred vifte af neurobeskyttende, immunmodulerende, antiinflammatoriske og leverbeskyttende aktiviteter (Jiang og Tu, 2009; Fu et al., 2017). PhG'er er blevet betragtet som de vigtigste aktive komponenter i Cistanches Herba, der besidder forskellige farmakologiske aktiviteter, såsom neurobeskyttende, immunmodulerende, antiinflammatoriske, hepatobeskyttende, antioxidative osv. (Jiang og Tu, 2009; Fu et al., 2017). Cistanches Herba blev oprindeligt optaget i Classic of Herbal Medicine ("Shennong Bencao Jing" på kinesisk), en velkendt bog om lægeplanter skrevet mellem omkring 200 og 250 AD, som en "høj urt", der kan regulere "fem (indvolde) ) belastninger og syv (overspisning, vrede, fugt, kulde, bekymring, vind og regn og frygt) svækkelser" (Huang, 1982). I dag er Cistanches Herba bredt accepteret som en urte-tonic til generel svækkelse (Fu et al., 2017).C. tubulosaglycosidkapsler (Memoregain®) er i brug til behandling af Alzheimers sygdom (Guo et al., 2013). Et dysfunktionelt dopaminergt system er en af ​​nøglepatogeneserne i monoaminhypotesen om depression (Duman et al., 1997; Krishnan og Nestler, 2008). Echinacoside (en af ​​PhG'erne) og PhG'er fra Cistanche salsa har vist sig at beskytte dopaminerge neuroner mod dopamin (DA) neurotoksicitet induceret af 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,{ {8}}tetrahydropyridin (MPTP), som kan øge DA-niveauer i striatum af C57-mus (Tian og Pu, 2005; Geng et al., 2007). Derudover er catalpol og geniposid to repræsentative iridoider i Cistanches Herba, og de har vist sig at lindre kronisk uforudsigelig stress (CUS)-induceret depressionslignende adfærd via genskabelse af hypothalamus-hypofyse-binyreaksen (HPA) akse dysfunktioner, og catalpol kan opregulere hjerne- afledt neurotrofisk faktor (BDNF) ekspression (Cai et al., 2015; Wang et al., 2015). Desuden giver den seneste publikation et stykke frisk bevis på, at Cistanches Herba-afkog signifikant reducerede immobilitetsperioden i musehalesuspensionstesten, hvilket kraftigt tyder på, at Cistanches Herba besidder potentielle antidepressiva-lignende kvaliteter (WangD. et al., 2017).

Traditionel kinesisk medicin tiltrækker sig stigende opmærksomhed som behandling af depression på grund af dens forholdsvis moderate bivirkninger (Sarris et al., 2011; Feng et al., 2016). Forskellige typer af TCM'er, såsom individuelle forbindelser fra de rå lægemidler (ginsenosid Rb1, ginsenosid Rg3 og Yuanzhi-1) (Jin et al., 2015; Kang et al., 2017; Wang GL et al., 2017 ), enkelte kinesiske medicinske materialer (Panax ginsengrod, Acorus tatarinowii rhizom og Morinda Officinalis) (Dang et al., 2009; Han et al., 2013; Xu et al., 2016) og TCM-afkog (Kai-Xin- San, Chaihu-Shu-Gan-San, Xiaoyaosan og Xiaochaihutang) (Dai et al., 2010; Su et al., 2011; Su et al., 2014; Yan et al., 2016) er blevet dybt undersøgt og vist at vende eller lindre depressionslignende symptomer. For eksempel viste det sig, at Kai-Xin-San markant lindre symptomer på CUS-inducerede depressive rotter ved at øge antallet af neurotransmittere, neurotrofiske faktorer og deres tilsvarende receptorer og fremme ekspressionen af ​​synaptotagmin og dendritisk rygsøjledensitet (Yan et al. , 2016).

Ikke desto mindre er tidligere undersøgelser af TCM afhængige af resultater i depressiv-lignende adfærdstests og fokuserer på den konventionelle farmakologiske virkningsmekanisme. Forbindelsen mellem den antidepressive virkning af oralt administreret TCM og tarmmikrobiota er ikke godt forstået. Voksende beviser understøtter, at tarmmikrobiota spiller en afgørende rolle i reguleringen af ​​hjernefunktioner, især depression og andre stress-relaterede lidelser (Foster og Neufeld, 2013; Sherwin et al., 2017). For eksempel resulterer kronisk stress i dysregulering af den mikrobielle struktur i rottens tarm med et fald i Firmicutes/Bacteroidetes-forholdet og mere specifikt fald i den relative overflod af Lactobacillus og stigning i Oscillibacter (Meng et al., 2017). Ydermere bidrog fækal transplantation af dysreguleret mikrobiota fra deprimerede patienter til bakteriefri mus en depressionslignende fænotype hos disse dyr, hvilket indikerer, at dysreguleret tarmmikrobiota forårsager adfærdsmæssige og fysiologiske symptomer på depression og angst (Kelly et al., 2016; Zheng et al. ., 2016). I dyreforsøg blev nogle mikrobiotamodulatorer som probiotika og præbiotika fundet at forbedre depressionslignende adfærd hos kronisk stressede mus ved at forbedre tarmmikrobiotaen (Bravo et al., 2011; Bharwani et al., 2017; Burokas et al., 2017 ).

I betragtning af sammenhængen mellem tarmmikrobiota og sygdomsudvikling, såvel som plasticiteten af ​​tarmmikrobiotastrukturen, besluttede vi at undersøge virkningerne af tarmmikrobiota til at mediere depression tiltrak vores opmærksomhed og blev undersøgt (Chang et al., 2017; Xu et al. ., 2017). For at opnå dette blev 16S rRNA-gensekventering kombineret Meta-statistik-analyse (White et al., 2009) udført for at analysere tarmmikrobiotasammensætning. I nærværende undersøgelse,C. tubulosablev udvalgt til at evaluere dens antidepressiv-lignende virkning, fordi den har et højere niveau af PhG'er sammenlignet medC. deserticola. En rotte CUS-induceret depressionsmodel blev etableret for at udforske virkningen afC. tubulosa ekstrakt(CTE, bestående af 48,6 procent PhG'er, 6,9 procent iridoidglycosider og 20,0 procent samlede saccharider) på adfærdsmæssige tests, monoamin-neurotransmittere og neurotrofiske faktorer i hippocampus og colon, tarmmikrobiotasammensætning og kortkædet produktion af fedtsyrer (SCFA). Desuden ændrede det funktionelle forhold mellem ændret tarmmikrobiota neurotransmittere og neurotrofiner i både hippocampus og colon, og forstyrret koncentration af SCFA'er blev undersøgt. Korrelationsanalyse blev brugt til at underbygge bevis for, at CTE retter sig mod tarmmikrobiota til behandling af depression ved at modulere mikrobiota-tarm-hjerne-aksen.

MATERIALER OG METODER

Materialer

Fluoxetin (FLX) blev købt fra Aladdin Industrial Inc. (Shanghai, Kina). 5-hydroxytryptamin (5-HT), noradrenalin (NE) og BDNF ELISA-sæt blev købt fra Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kina). Acetonitril af HPLC-kvalitet blev købt fra Merck (Darmstadt, Tyskland). Deioniseret vand blev fremstillet ud fra destilleret vand under anvendelse af et Milli-Q vandrensningssystem (Millipore, Bedford, MA, USA). Alle andre anvendte reagenser og kemikalier var af analytisk kvalitet.

Tørrede stængler afC. tubulosablev indsamlet fra Hetian County (Xinjiang, Kina). Kuponprøverne blev autentificeret af prof. Xiaobo Li og deponeret i herbariet på School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Den homogene pulveriseretC. tubulosastænglerne blev suspenderet i ti gange 70 procent ethanol og varmetilbageløbet tre gange, hver i 1 time ved 100 grader. Ekstrakterne blev filtreret under anvendelse af gaze, inddampet under vakuum ved 65 grader og lyofiliseret. Prøven blev genopløst og derefter adskilt med makroporøs harpiks D101. Efter adsorption blev fraktionen elueret med vand kasseret. CTE blev opnået efter eluering med 40 procent ethanol, derefter inddampet under vakuum ved 65 grader og lyofiliseret.

Analyse af kemisk sammensætning af CTE

Det relative indhold af PhG'er i CTE blev bestemt ved UV-spektrofotometri ved 330 nm under anvendelse af echinacosid som standard. Det relative indhold af iridoider og iridoidglycosider blev målt ved UV-spektrofotometri med dobbeltbølgelængdemetoden for at undgå den spektrale interferens fra PhG'er (237 nm blev brugt til spektroskopisk kvantificering, et isosbestisk punkt 280 nm blev brugt til referencebølgelængde), geniposid blev brugt som standard. Det totale kulhydratindhold i CTE blev bestemt ved den phenol-svovlsyre-kolorimetriske metode med glucose som standard (Chow og Landhausser, 2004).

De vigtigste kemiske bestanddele af CTE var karakteriseret ved UPLC-Q-TOF-MS. UPLC-Q-TOF-MS-analyse blev udført på et Waters ACQUITY UPLC-system (Waters Corp., Milford, MA, USA) med en ACQUITY UPLC BEH C18-søjle (100 mm x 2.1 mm id, 1,7 段m, Waters Corp., USA) ved gradienteluering under anvendelse af 0,1 procent myresyreacetonitril (A) og 0,1 procent myresyre i vand (B) ved en flowhastighed på 0,4 ml/min. Gradientprofilen var: 0-5 min (A: 5-20 procent ), 5-7,5 min (A: 20-30 procent ), 7.5-10 min ( A: 30-70 procent ), 10-11 min (A: 70-100 procent ), og holdt i 1,5 min. Gradienten blev recirkuleret tilbage til 5 procent på 0,5 minutter og holdt i 2,5 minutter til næste kørsel. Injektionsvolumenet var 3 [il. Søjleovnens temperatur blev indstillet til 35 grader.

Massespektrometri blev udført under anvendelse af et Waters Vion IMS massespektrometer (Waters Corp., Milford, MA, USA). Ionisering blev udført i negativ elektrospray-tilstand (ESI). MS-parametrene var som følger: kapillarspænding, 2.0 kV; keglespænding, 20 V; kildetemperatur, 120 grader ; desolvationstemperatur, 500 grader ; gasstrømme af kegle og desolvation, henholdsvis 50 og 1,000 L/h. Til nøjagtig massemåling blev leucin-enkephalin brugt som låsemassen til at generere en [MH]-ion (m/z 554,2615). Et MSE (Mass SpectrometryElevatedEnergy) eksperiment i to scanningsfunktioner blev udført som følger: funktion 1 (lavenergi): m/z 50-1,000, 0,25 s scanningstid, 0,02 s inter-scan forsinkelse , 6 eV kollisionsenergi; funktion 2 (høj energi): m/z 50-1,000, 0,25 s scanningstid, 0,02 s inter-scan forsinkelse, kollisionsenergirampe på 20-45 eV. Dataene blev behandlet ved hjælp af UNIFI 1.8.1-software (Waters Corp., Milford, MA, USA).

cistanchekanforbedre nyrefunktionen

Dyreforsøg

Sprague-Dawley-hanrotter (200 x 20 g) blev anskaffet fra Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Company (Beijing, Kina) og anbragt i Laboratory Animal Center i Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina). Dyrene blev anbragt i grupper under kontrolleret stuetemperatur (25 x 2 grader, 55 x 10 procent relativ fugtighed) med en lys-mørke-cyklus på 12:12 timer. Rotterne fik fri adgang til almindelig laboratorierottemad og vand i 1 uge. Dyrefaciliteterne og protokollerne blev godkendt af Animal Ethics Committee ved Shanghai Jiao Tong University (Shanghai, Kina).

Efter 1 uges akklimatisering blev 40 naive rotter udsat for en periode på 72 timers saccharosetræning og saccharosebaselinetestning. Rotter blev opdelt i fem grupper (n=8) baseret på deres saccharosepræference i saccharosebaselinetesten (Supplerende figur S1). Kontrolgruppen og CUS-gruppen fik saltvand (10 ml/kg). For de tre andre grupper, CTE ved høj dosis (CTEH) (400 mg/kg), lav dosis (CTEL) (200 mg/kg) og FLX (10 mg/kg) blev administreret intragastrisk 1 time før CUS-proceduren (8:00 til 9:00) i løbet af 4 uger.

Kronisk uforudsigelig stress blev udviklet som beskrevet tidligere (Willner, 1997; Xue et al., 2013), bortset fra den ikke-stressede kontrolgruppe, blev en række stressfaktorer påført rotterne: stroboskopisk belysning med lav intensitet natten over (120 blink/ min), hvid støj (100 dB) i 1 time, vandmangel i 24 timer, tomme vandflasker i 1 time (efter vandmangel), madmangel i 24 timer, tvungen svømning (5 min), fysisk tilbageholdenhed ({{11 }} h), snavset bur i 24 timer (200 ml vand i 100 g savsmuldsstrøelse), haleklem (1 min), 45 graders burtilt i 24 timer, stød i 30 minutter og belysning natten over (12 timer). Stressfaktorer blev påført kontinuerligt og tilfældigt i 4 uger, hvis detaljer er beskrevet i supplerende tabel S1. Mad og vand var frit tilgængeligt for de ikke-stressede kontrolrotter, som forblev uforstyrrede i et andet rum, bortset fra de 14 timers afsavn før hver saccharosetest. En rotte døde under CUS-proceduren. Forced svømmetest (FST) blev udført efter

4 dages akut administration og efter 28 dages stress blev der udført saccharosepræferencetest (SPT) (dag 29), åben felttest (OFT) (dag 31) og nyhedsundertrykt fodringstest (NSFT) (dag 33). Skitsen af ​​et design for CUS og adfærdstest er vist i supplerende figur S2.

En tvungen svømmetest blev udført som tidligere beskrevet (Porsolt et al., 1978). Proceduren bestod af prætest- og testsessioner under anvendelse af samme apparatur og betingelser (diameter 20 cm, højde 45 cm, indeholdende 25 cm vand holdt ved 26 grader). Under prætest-sessionen blev rotter tvunget til at svømme i 15 minutter; 24 timer senere blev rotter anbragt i det samme apparat til 5 minutters svømmetestsession. Svømmeadfærden indeni

5 min blev observeret med et videokamera, og varigheden af ​​immobilitet blev målt og analyseret.

Til SPT blev rotter først trænet til at indtage 1 procent (v/v) saccharoseopløsning i 72 timer før SPT. Saccharose-baseline-testen før CUS-proceduren og SPT i slutningen af ​​CUS blev udført som beskrevet tidligere (Xue et al., 2013).

Open-field-test blev udført i slutningen af ​​CUS-proceduren, apparatet og metoden var de samme som tidligere beskrevet (Xue et al., 2013). Et videosporingssystem (Shanghai Mobile Datum Information Technology Co., Ltd.) blev brugt til at registrere den samlede tilbagelagte distance.

Nyhedsundertrykt fodringstest blev vurderet som tidligere beskrevet (Xue et al., 2013), og latens til at begynde at spise inden for 5 minutter blev registreret og analyseret.

Måling af neurotransmittere og neurotrofiske faktorer

Efter adfærdsmæssige tests blev der opnået mindst fire fækale pellets fra hver rotte, anbragt i sterile koniske rør og straks frosset ved -80°C til mikrobiel samfunds- og SCFA-analyse. Derefter blev der ofret rotter; hippocampus og colon blev isoleret og vejet med det samme. Vævsprøver blev vasket med saltvand, lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret i -80°C til opbevaring. Efter sekventiel optøning ved -20OC og 4OC blev vævsprøverne homogeniseret i saltvand og centrifugeret i 25 minutter ved 2.500 rpm/4OC. Den resulterende supernatant blev opsamlet og opbevaret ved 4°C indtil brug. Niveauerne af 5-HT i hippocampus og colon, NE i hippocampus og BDNF i hippocampus blev bestemt ved kommercielle ELISA-sæt i henhold til producentens protokoller (Hou et al., 2017).

Sammensætningsprofilanalyse af tarmmikrobiota

Det samlede DNA fra tarmmikrobiota fra fækale prøver blev ekstraheret som tidligere beskrevet (Wei et al., 20{{20}}4). Hver fækal prøve (0,2 g) blev blandet i 1 ml PBS og fuldstændig homogeniseret to gange, derefter centrifugering ved 200 g i 6 min. Supernatanten blev tilsat 20 x 20 procent PVP og centrifugeret ved 300 g i 6 min. Den resulterende supernatant blev derefter centrifugeret ved 12,000 g i 6 minutter, og cellepelleter blev høstet. Cellepelleter blev vasket med PBS og blev derefter resuspenderet i 300 lysater I (150 mM NaCI, 100 mM EDTA - Na2 - 2H2., pH 8,0). Suspensionen blev blandet med 100 µl lysozymopløsning (100 mg/ml) og 20 µl 1 procent RNase, 37OC varmbadet i 30 minutter, derefter tilsat 300 µl lysat II (100 mM NaCl, 500 mM Tris-base, pH 8,0) . Cellesuspensionen blev forsigtigt blandet med 50 x 20 procent SDS, isbadet i 5 min. DNA blev derefter oprenset ved sekventiel ekstraktion med 1 procent PVP, Tris-ækvilibreret phenol og chloroform-isoamylalkohol (vol/vol/vol/vol, 3,125:25:24:1) og chloroform-isoamylalkohol (vol/vol, 24) :1) efterfulgt af udfældning ved -20°C i 2 timer med to volumener ethanol og 50 [il 3 M NaAc. DNA blev opsamlet ved centrifugering, lufttørret og opløst i 100 il sterilt deioniseret vand. Nukleinsyrerenheden blev testet under anvendelse af et NanoDrop 2000c spektrofotometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Totalt genomisk DNA blev derefter underkastet PCR-amplifikation under anvendelse af primere, der er specifikke for V3-V4-regionerne af 16S rRNA-genet: forward primer 338F (5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3') og den reverse primer 806R (5 '-GGACTACHVGGGTWTCTAAT- 3'). PCR-amplikoner blev oprenset med Agencourt AMPure-perler (Beckman Coulter, Indianapolis, IN, USA) og kvantificeret ved anvendelse af PicoGreen dsDNA Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Efter det individuelle kvantificeringstrin blev amplikoner samlet i lige store mængder, og par-ende 2 x 300 bp sekventering blev udført ved hjælp af Illumina MiSeq-platformen med MiSeq Reagent Kit v3 hos Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd (Shanghai, Kina). Paired-end-aflæsninger blev samlet ved hjælp af FLASH-software (version 1.2.7), råsekvenslæsninger blev kvalitetstrimmet ved hjælp af QIIME-softwaren (version 1.8.0) for at fjerne uoverensstemmende stregkoder og sekvenser under længdetærskler. Bagefter blev de filtrerede sekvenser grupperet i operationelle taksonomiske enheder (OTU'er) med en tærskel på 97 procent sekvenslighed ved brug af QIIME med UCLUST. Beta-diversitet blev udført på QIIME til vægtet UniFrac principal koordinatanalyse (PCoA). Endelig blev Meta stats-software brugt til at sammenligne forskellene i tarmmikrobiel taksonomiske sammensætning blandt forskellige grupper.

SCFAs koncentrationsanalyse

Koncentrationen af ​​SCFA'er (inklusive acetat, propionat, butyrat, isobutyrat, valerianesyre, isovalerinsyre og hexansyre) i fæcesprøver fra rotter blev bestemt med GC {{0}} gaskromatograf (Shimadzu, Japan), monteret med en DB-FFAP-søjle (30 mx 0,25 mm x {{10}},25 cm, Agilent, USA). Standardopløsninger af acetat, propionat, butyrat, isobutyrat, valerianesyre, isovalerinsyre og hexansyre blev fremstillet ved 1, 0.4, 0.2, 0.1, {{ 21}}.05, 0,01 og 0,005 mg/ml med henholdsvis ether (herunder 2- methylvalerianesyre 0,1 mg/ml som intern standard). Hver fækal prøve (0,2 g) blev blandet i 0,8 ml deioniseret vand ved vortexing og centrifugering ved 5,000 rpm i 20 minutter ved 4OC, 450 il supernatant blev tilsat med 50 il 50 procent H2SO4 og 500 il intern standard opløsning, vortex i 1 min og centrifugeret ved 12, 000 rpm i 10 min., derefter blev blandingen anbragt i 4°C i 30 min. Supernatanten blev taget til GC-analyse. Analysen af ​​SCFA'er blev udført som tidligere beskrevet (Wang et al., 2016).

Statistisk analyse

Alle data blev præsenteret som middel 土 SEM. Statistisk analyse blev udført ved hjælp af SPSS 21.0-softwaren (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) med en envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts test eller Students t-test. Data blev udelukket fra analyser, hvis der var større end to standardafvigelser fra gennemsnittet. Værdier af p < 0.05="" blev="" betragtet="" som="" statistisk="" signifikante.="" pearsons="" korrelationsanalyse="" blev="" brugt="" til="" at="" evaluere="" sammenhængen="" mellem="" den="" relative="" mængde="" af="" tarmmikrobiota,="" scfa'er,="" hippocampus="" 5-ht,="" ne="" og="" bdnf="" niveauer="" og="" kolon="">

RESULTATER

Analyse af kemisk sammensætning af CTE

Den kemiske sammensætning af CTE blev først grundigt analyseret. Som vist i tabel 1 var PhG'er hovedbestanddelen af ​​CTE med et relativt indhold på 48,6 procent, iridoider og iridoidglycosider var 6,9 procent, og det samlede antal saccharider var 20,0 procent. Disse

komponenter af CTE blev derefter karakteriseret ved anvendelse af UPLC-Q-TOF-MS. I alt 27 bestanddele blev påvist og identificeret, herunder 20 bestanddele af PhG'er, fem iridoider og iridoidglycosider og to oligosaccharider. Detaljerede oplysninger, herunder retentionstid, nøjagtige MS- og MS/MS-fragmentioner er angivet i Understøttende oplysninger (Supplerende Tabel S2). UPLC-Q-TOF-MS totalionkromatogram (TIC) af CTE er vist i supplerende figur S3.

CTE forbedrede den depressive adfærd hos CUS-rotter

Hos CUS-rotter blev den totale immobilitetstid i FST og latens til at spise i NSFT signifikant reduceret ved CTE-behandling, og saccharosepræference i SPT og total tilbagelagt afstand i OFT blev øget.

Figur 1A illustrerer de akutte virkninger af CTE på immobilitetstid i FST hos CUS-rotter. Sammenlignet med CUS-modelgruppen reducerede 3- dages akut oral administration af CTE signifikant den totale immobilitetstid i FST [envejs ANOVA, F(3,26)=4.983, s {{7} }.007]. Yderligere posthoc analyse afslørede, at administrationen

TABEL 1|kemisk sammensætning afC. tubulosaekstrakt.af CTE med højdosisgruppe (Dunnetts test, p < {{0}}.05) og lavdosisgruppe (Dunnetts test,p < 0.05) viste en markant reduktion af den totale immobilitetstid i FST .

Virkningerne af CTE på saccharosepræference i SPT i CUS-rotter er vist i figur 1B. Otteogtyve dages stressprocedure forårsagede et signifikant fald i saccharosepræference i CUS-modelgruppen sammenlignet med kontrol ikke-stressede rotter [envejs ANOVA, F(4,34)=3.993, p {{8 }}.{{10}}09; Dunnetts test, p < 0,05],="" hvilket="" indikerer,="" at="" cus-modellen="" blev="" udviklet="" med="" succes.="" som="" den="" positive="" kontrol="" øgede="" flx-gruppen="" signifikant="" saccharosepræferencen="" hos="" cus-rotter="" [envejs="" anova,="" f(4,34)="3.993," p="0.009;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05],="" der="" viser="" den="" prædiktive="" validitet="" af="" cus-modellen.="" kronisk="" oral="" administration="" af="" cte="" i="" højdosisgruppen="" viste="" nøgleeffekter="" på="" saccharosepræference="" [envejs="" anova,="" f(4,34)="3.993,p=0.009;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,01],="" som="" genoprettede="" det="" til="" normale="" niveauer="" hos="" cus-rotter.="" cte="" med="" lavdosisgruppen="" viste="" en="" stigende="" tendens,="" men="" effekten="" var="" ikke="" statistisk="" signifikant="" (dunnetts="" test,="" p="">

Som vist i figur 1C blev den samlede afstand dækket i OFT også brugt til at evaluere virkningerne af CTE på CUS-rotter. Sammenlignet med ikke-stress-rotter viste CUS-modelgruppen en meget kortere total distance [envejs ANOVA, F(4,34)=7.845, p=0.0{{ 19}}01; Dunnetts test, p < 0.001]="" efter="" en="" 4-uges="" eksponering="" for="" cus,="" og="" den="" positive="" kontrol="" flx-behandling="" øgede="" den="" totale="" afstand="" hos="" cus-rotter="" [envejs="" anova,="" f(4,34)="7.845," s="0.0001;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05].="" daglig="" oral="" administration="" af="" cte="" med="" høj="" dosis="" og="" lav="" dosis="" viste="" en="" tydelig="" effekt="" på="" den="" totale="" afstand="" hos="" cus-rotter="" [envejs="" anova,="" f(4,34)="7.845," p="0.0001" ;="" dunnetts="" test,="" henholdsvis="" p="">< 0,01="" for="" højdosisgruppe,="" p="">< 0,001="" for="" lavdosisgruppe].="" supplerende="" figur="" s4="" viser="" aktivitetssporkortet="" i="">

Figur 1D viser virkningerne af CTE på latens til at spise i NSFT i CUS-rotter. Otteogtyve dages stressprocedure forårsagede en signifikant stigning i latens til at begynde at spise i CUS-modelgruppen sammenlignet med kontrol ikke-stressede rotter [envejs ANOVA, F(4,33)=3.434, p { {8}}.{{10}}19; Dunnetts test, p < 0,05],="" hvilket="" indikerer,="" at="" cus-modellen="" blev="" udviklet="" med="" succes.="" langvarig="" oral="" administration="" af="" cte="" med="" en="" høj="" dosis="" viste="" tydelige="" effekter="" på="" latens="" til="" at="" begynde="" at="" spise="" sammenlignet="" med="" cus-gruppen="" (students="" t-test,="" t="2.759," p="">< 0,05),="" mens="" en="" lav="" dosis="" af="" cte="" viste="" ingen="">

CTE genoprettede niveauet af neurotransmittere og neurotrofiske faktorer i CUS-rotter

Virkningerne af CTE på {{{{10}}}}HT- og NE-niveauer i hippocampus hos CUS-rotter er vist i figur 2A,B. Fire ugers stressprocedure forårsagede en signifikant reduktion af 5-HT [envejs ANOVA, F(4,34)=17.13, p=0.0{{39 }}01; Dunnetts test, p < 0.001]="" og="" ne="" [envejs="" anova,="" f(4,34)="6.376,p=0.0006;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,001]="" koncentration="" i="" hippocampus="" hos="" cus-rotter="" sammenlignet="" med="" den="" i="" kontrolgruppen,="" og="" det="" antidepressive="" middel="" flx="" genoprettede="" signifikant="" 5-ht-niveauer="" i="" hippocampus="" [envejs="" anova,="" f(4,34)="" {="" {25}}.13,="" s="0.0001;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,001].="" efter="" oral="" administration="" af="" cte="" i="" højdosisgruppe="" blev="" der="" observeret="" signifikant="" stigning="" i="" 5-ht-niveau="" [envejs="" anova,="" f(4,34)="17.13," p="0.0001" ;="" dunnetts="" test,="" p="">< 0,001],="" mens="" ne-koncentrationerne="" ikke="" blev="" ændret.="" tilsvarende="" blev="" bdnf-ekspression="" signifikant="" reduceret="" i="" cus-modelgruppen="" sammenlignet="" med="" de="" ikke-stressede="" rotter="" (students="" t-test,="" t="4.171," p="">< 0,01)="" (figur="" 2c).="" både="" langvarig="" oral="" administration="" af="" cte="" med="" høj="" dosis="" (elevs="" t-test,="" t="2.548," p="">< 0.05)="" og="" flx="" (elevs="" t-test,="" t="2.263," p="">< 0.05="" )="" øget="" bdnf-ekspression="" sammenlignet="" med="" cus-modelgruppe.="" cte="" med="" lav="" dosis="" viste="" ingen="" signifikant="" effekt="" på="">

{{0}}HT-niveauet i tyktarmen hos CUS-rotter var forskelligt fra det i hippocampus, og 4-ugens stressprocedure havde ingen indflydelse på kolon 5-HT (figur 2D ). Omvendt stimulerede oral administration af CTE med høj dosis 5-HT-niveauer i tyktarmen sammenlignet med CUS-modelgruppen (Students t-test, t=2.173, p < 0,05).="" cte="" med="" en="" lav="" dosis="" viste="" ingen="" effekt="" på="" kolon="">

CTE regulerede tarmens mikrobielle sammensætning af CUS-rotter

Virkningen af ​​CTE på den tarmmikrobielle sammensætning af CUS-rotter blev evalueret ved den 16S rRNA-gensekventeringsbaserede metode. Det blev fundet, at 28 dages oral administration af CTE ændrede tarmmikrobielle sammensætning af CUS-rotter og påvirkede forskellige

mikrobielle taksonomiske niveauer blandt rottegrupper (klasseniveau 1, ordensniveau 1, familieniveau 1, slægtsniveau 8 og artsniveau 2). Dette tyder på, at det mikrobielle samfund i tarmen kan spille en rolle i de antidepressive virkninger af CTE. Detaljeret information om signifikant ændrede tarmmikrobielle taxa på forskellige taksonomiske niveauer er vist i tabel 2.

MiSeq-sekventeringen gav i alt 2.132.980 rå læsninger efter kvalitetskontrol, denoising og kimærefjernelsesproces. Derefter blev aflæsningerne grupperet i OTU'er, som blev tildelt taxa fra phylum til artsniveau. Undersøgelsen af ​​beta-diversitetsanalyse blev udført for at udforske ligheden mellem bakterielle samfundsmønstre blandt de fem rottegrupper. PCoA baseret på vægtede UniFrac-afstande af tarmmikrobiota fra de fem rottegrupper i undersøgelsen er vist i figur 3A. Beta-diversitetsanalyse af PCoA viste en klar adskillelse af det mikrobielle samfund fra kontrolgruppen og CUS-modelgruppen, mens CTE med højdosisgruppen havde tendens til at være tættere på kontrolgruppen sammenlignet med CUS-gruppen.

Metastatic analysis was used to investigate the differences in gut microbial taxonomic composition among different groups. At the phylum level, the most dominant microbial taxa in the five rat groups were Firmicutes and Bacteroidetes (Figure 3B). Lactobacillus, Ruminococcus, Blautia, Bacteroides, and Prevotella were the most highly abundant microbial taxa at the genus level (Figure 3C). The two dominant phyla, Firmicutes and Bacteroidetes, accounted for a combined relative abundance of >90 procent. Som vist i supplerende figurer S5A, B forårsagede 4 ugers stressprocedure en ikke-signifikant tendens i retning af et øget niveau af Firmicutes og et ikke-signifikant fald i Bacteroidetes i CUS-modelgruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Efter daglig administration af CTE med høj dosis og lav dosis vendte den relative mængde af Firmicutes og Bacteroidetes tilbage til tilsvarende niveauer i kontrolgruppen, dog uden statistisk signifikans. Og selvom lignende ændringer blev observeret for Firmicutes/Bacteroidetes-forholdet blandt rottegrupperne, blev der ikke vist nogen statistiske forskelle (Supplerende figur S5C). En ikke-signifikant tendens i retning af et reduceret niveau af phyla Cyanobacteria blev fundet i CUS-modelgruppen sammenlignet med kontrol-ikke-stressede rotter; hvorimod administration af CTE med en høj dosis resulterede i en signifikant stigning i den relative overflod af cyanobakterier sammenlignet med CUS-gruppen (Supplerende figur S5D).

På slægtsniveau var Bacteroides og Ruminococcus to af de mest udbredte mikrobielle taxaer, der tegnede sig for cirka 30 procent relativ overflod i alle fem rottegrupper. Fire ugers stressprocedure forårsagede en signifikant reduktion i den relative overflod af Bacteroides og en signifikant stigning af Ruminococcus i CUS-modelgruppen sammenlignet med kontrol-ikke-stressede rotter (figur 4A, B). Langvarig administration af CTE resulterede i en signifikant stigning i mængden af ​​Bacteroides såvel som et signifikant fald i Ruminococcus sammenlignet med CUS-rotterne. Derudover viste seks slægter af Parabacteroides, Butyricimonas, Deinococcus, Weissella, Trichococcus og Brachybacterium statistisk signifikante forskelle mellem CUS-modelgruppen og kontrolgruppen (figur 4C-H). Efter 28 dages behandling af CTE blev den relative overflod af de ovennævnte seks slægter henholdsvis ændret til niveauer svarende til kontrolgruppen.

Lav forekomst af Deinococcus i forskellige taksonomiske niveauer, herunder klasseniveau (Deinococci), ordensniveau (Deinococcales), familieniveau (Deinococcaceae) og slægtsniveau (Deinococcus) blev påvist i CUS-rottegruppen, mens det ikke kunne påvises i kontrollen gruppe og administrationsgrupperne (figur 5A-D).

På artsniveau var Weissella beninensis meget lavere i CUS-gruppen end i kontrolgruppen, og en signifikant stigning i relativ overflod blev observeret efter administration af CTE med en høj dosis (Figur 5E). Omvendt vendte CTE-administration den signifikante stigning i den relative mængde af Brachybacterium-konglomerat observeret i CUS-rotterne (figur 5F).

CTE-modulerede SCFA'er i CUS-rotter

SCFA-koncentrationerne (herunder acetat, propionat, butyrat, isobutyrat, valerianesyre, isovalerinsyre og hexansyre) i fæcesprøver fra rotter blev analyseret ved GC og er vist i figur 6. Acetatniveauerne [envejs ANOVA, F( 4,32)=2.721, s=0.0467; Dunnetts test, p < 0.05]="" og="" hexansyre="" [envejs="" anova,="" f(4,30)="3.028," p="" {{15="" }}.0328;="" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05]="" var="" signifikant="" øget="" i="" cus-modelgruppens="" rotter="" sammenlignet="" med="" kontrolgruppen.="" efter="" langvarig="" administration="" af="" cte="" med="" høj="" dosis,="" acetat="" (students="" t-test,="" t="2.182," p="">< 0,05)="" og="" hexansyre="" [envejs="" anova,="" f(4,30)="3" .028,="" p="0.0328;" dunnetts="" test,="" p="">< 0,05]="" koncentrationer="" var="" overvejende="" faldet="" sammenlignet="" med="" cus-gruppen,="" hvilket="" indikerer,="" at="" cte="" kunne="" udøve="" sin="" antidepressive="" aktivitet="" via="" modulering="" af="" den="" forstyrrede="" neuroaktive="" metabolit="" scfa'er.="" administration="" af="" cte="" med="" lavdosisgruppe="" viste="" en="" faldende="" tendens,="" men="" ingen="" bemærkelsesværdig="" effekt="" på="" acetat-="" og="">

Korrelationsanalyse af tarmmikrobiota, neurotransmittere og neurotrofiner i Hippocampus, 5-HT i tyktarm og SCFA'er

For at udforske det funktionelle forhold mellem ændret tarmmikrobiota i slægtsniveau, ændrede neurotransmittere og neurotrofiner i hippocampus og colon og den forstyrrende koncentration af SCFA'er, blev Pearsons korrelationskoefficienter udviklet (Meng et al., 2017). Korrelationer mellem dem (r > 0.4 eller r < -0.4,="" p="">< 0.05)="" er="" vist="" i="" figur="" 7.="" koefficienterne="" indikerede="" stærke="" korrelationer="" mellem="" ændret="" tarmmikrobiotasammensætning="" i="" slægtsniveau,="" koncentrationen="" af="" syv="" typer="" scfa'er="" og="" depressionsrelaterede="" monoamin-neurotransmittere="" (5-ht="" og="" ne).="" forekomsten="" af="" ​​ruminococcus="" viste="" en="" signifikant="" negativ="" korrelation="" med="" en="" 5-ht-koncentration="" i="" hippocampus,="" hvilket="" betyder,="" at="" cus-proceduren="" fører="" til="" en="" stigning="" i="" den="" relative="" forekomst="" af="" ruminococcus="" og="" et="" fald="" i="" 5-ht-koncentrationer.="" efter="" behandling="" med="" cte="" blev="" den="" relative="" mængde="" af="" ruminococcus="" reduceret="" til="" kontrolgruppens="" niveau,="" og="" 5-ht-niveauerne="" blev="" fundet="" at="" være="" forbedret.="" yderligere="" var="" den="" relative="" mængde="" af="" bacteroides="" positivt="" korreleret="" med="" et="" 5-ht-niveau="">

hippocampus og negativt forbundet med koncentrationen af ​​butyrat, isobutyrat, valerianesyre, isovalerinsyre og hexansyre; forekomsten af ​​Parabacteroides viste en signifikant positiv korrelation med et 5-HT-niveau i hippocampus og propionatkoncentration, mens det viste en negativ korrelation med isobutyrat- og isovalerinsyrekoncentrationer; en signifikant positiv sammenhæng mellem den relative mængde af Butyricimonas og NE-niveau i hippocampus blev også observeret, og den relative mængde af Deinococcus var positivt korreleret med acetatkoncentrationen. Dette viste, at CTE kunne udøve sin antidepressive aktivitet ved at ændre sammensætningen af ​​tarmmikrobiotaen, forstyrre hippocampus neurotransmitterniveauer og genoprette neuroaktive metabolitter SCFA'er. Detaljerede data for korrelationsanalyse er vist i supplerende tabel S3.

cistanchekan behandlediabetes

DISKUSSION

Identifikation af anti-depression aktivitet af CTE og dens kliniske fordele

Denne undersøgelse evaluerede den antidepressive aktivitet af CTE i CUS-rotter, bekræftede effektiviteten af ​​in vivo-modeller såsom FST, SPT, OFT og NSFT og bekræftede den antidepressive aktivitet afC. tubulosai CUS-rotter, som ofte bruges til behandling af nyremangel, impotens og kvindelig infertilitet ved TCM. I øjeblikket er de mest almindeligt ordinerede antidepressiva serotonin- og noradrenalin-genoptagelseshæmmeren (SNRI) venlafaxin, efterfulgt af den selektive serotonin-genoptagelseshæmmer (SSRI) FLX (Thase et al., 2001; Mcintyre, 2017). Imidlertid har disse antidepressiva vist sig at have alvorlige bivirkninger, herunder hjertetoksicitet, blodtryk, seksuel dysfunktion og søvnforstyrrelser (Ferguson, 2001; Jin et al., 2015). Blandt alle klasser af antidepressiva er SSRI og SNRI korreleret med den højeste forekomst af seksuel dysfunktion (Montejogonzalez et al., 1997; Clayton et al., 2014). Særligt bemærkelsesværdigt er den samlede forekomst af seksuel dysfunktion, som er på 59,1 procent (604/1.022), når alle antidepressiva betragtes som en helhed; og omkring 40 procent af patienterne udviser lav tolerance over for seksuel dysfunktion, hvorfor lægemiddelcompliance er alvorligt påvirket (Clayton, 2001). I lyset af ulemperne ved den nuværende depressionsbehandling viser Cistanches Herba et stort potentiale for klinisk anvendelse, ikke kun på grund af dets potente antidepressiv-lignende aktivitet, men også fordiCistanches Herbaer traditionelt blevet brugt til at behandle impotens, hvilket i det mindste burde fjerne én bekymring for de mest almindelige bivirkninger forårsaget af andre antidepressiva (Fu et al., 2017). Derudover viser Cistanches Herba ingen tegn på toksicitet og behandlingsrelaterede ændringer