Anti-melanogen virkning af ethanolekstrakt af Sorghum Bicolor på IBMX-induceret melanogenese i B16/F10 melanomceller

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Hye Ju Han, Seon Kyeong Park, Jin Yong Kang, Jong-Min Kim, Seul Ki Yoo og Ho Jin Heo

Abstrakt:For at vurdere muligheden som hudblegningsmiddel afSorghum bicolor(S. bicolor), densantioxidantaktivitet og anti-melanogen effekt på 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)-induceretmelanogenesei B16/F10 blev melanomceller undersøgt. Resultatet af totalt phenolindhold (TPC) indikerede, at 60 procent ethanolekstrakt afS. bicolor(ESB) har det højeste indhold end andre ethanolekstrakter.Antioxidantaktiviteten blev evalueret under anvendelse af 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsyre) diammoniumsalt (ABTS)/1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl (DPPH) radikalopfangende aktiviteter og malondialdehyd (MDA) hæmmende effekt. Disse resultater viste, at ESB har signifikantantioxidantaktiviteter. Inhiberende virkning mod tyrosinase blev også vurderet under anvendelse af L-tyrosin (IC50-værdi=89.25 µg/mL) og 3,4-dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA) som substrater. Derudover hæmmede ESB-behandling effektivt melaninproduktionen i IBMX-inducerede B16/F10-melanomceller. For at bekræfte mekanismen for ESBs anti-melanogene virkning undersøgte vi melanogenese-relaterede proteiner. ESB nedreguleretmelanogeneseved at reducere ekspressionen af ​​mikroftalmi-associeret transkriptionsfaktor (MITF), tyrosinase og tyrosinase-relateret protein (TRP)-1. Til sidst blev 9-hydroxyoctadecadiensyre (9-HODE),1,3-O-dicaffeoylglycerol og tricin som hovedforbindelserne af ESB analyseret ved hjælp af ultraydeevne væskekromatografi-ionmobilitetsseparation-quadrupol flyvetidspunkt/tandemmamassespektrometri (UPLC-IMS-QTOF/MS2). Disse resultater tyder på, at ESB kan have det fysiologiske potentiale til at blive brugt som hudblegningsmateriale.

Nøgleord:anti-melanogenese; B16/F10 melanomcelle; hydroxyoctadecadiensyre;Sorghumbicolor; 3-isobutyl-1-methylxanthin

Cistanche hæmmer melanindannelsen.

1. Introduktion

Melanin dannes gennem en proces, kaldetmelanogeneseinden for de intracellulære melanosomer af melanocytter, og produktionen og distributionen af ​​melanin bestemmer hud, øjne og hårfarve. Derudover spiller melanin en afgørende rolle i at beskytte huden mod forskellige molekyler og stimuli såsom ultraviolet (UV) stråling, reaktive oxygenarter (ROS), -melanocytstimulerende hormon (-MSH) og cyklisk adenosinmonophosphat (cAMP) hævemidler, herunder forskolinand IBMX [1]. Især UV-stråling skader direkte og indirekte hudceller via ROS-generationer såsom hydroxylradikaler, superoxidanioner og hydrogenperoxid [2]. Det genererede ROS forårsager enkelt- og dobbeltstrenget DNA bryder og angriber vigtige cellulære strukturelle molekyler såsom proteiner og lipider [2]. Således melanin ogantioxidantenzymer såsom glutathionperoxidase, superoxiddismutase og katalase opretholder et konstant niveau ved at fjerne den producerede ROS. Imidlertid aktiverer overdreven ROS-produktion som følge af forskellige faktorer melanogenese i huden, og den unormale melaninophobning inducerer negative hyperpigmenteringseffekter, hvilket forårsager alder eller leverpletter, pletter og fregner [3,4]. I øjeblikket anvendes naturlige forbindelser såsom kojinsyre, hydroquinon, arbutin og ascorbinsyre, der er kendt som melaninsyntesehæmmere, som tilsætningsstoffer til hudblegemidler. Imidlertid har disse ingredienser ikke kun dårlig indtrængning i huden, men forårsager også cytotoksicitet og betændelse ved langvarig administration [5]. I denne henseende er det nødvendigt at udvikle et ikke-irriterende og effektivt blegemiddel til behandling af human hudhyperpigmentering, samt at studere naturlige ressourcematerialer til dette.

Menneskelige hudceller genererer almindeligvis melanin som en fotobeskyttelsesreaktion. Melanogenese er en kompleks proces, der reguleres via en række forskellige signalveje, og alle signaler opregulerer i sidste ende MITF. Da aktiveret MITF fremmer tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP'er) udtryk,melanogenesebegynder for alvor [6]. Generelt er det første trin i melanogenese, at tyrosinase katalyserer oxidationen af ​​L-tyrosin til 3,4-dihydroxy-L-phenylalanin (L-DOPA), og efterfølgende oxiderer L-DOPA til DOPA-quinon. Og så konverterer TRP-2 DOPA-chrom til 5,6-dihydroxyindol-2-carboxylsyre (DHICA) eller 5,6-dihydroxyindol (DHI). Endelig oxideres DHICA og DHI af TRP-1, hvilket i sidste ende fører til melaninproduktion [6].

IBMX og andre methylxanthiner stimulerer melanogenese ved at hæmme phosphodiesterase og derved øge niveauet af cAMP [7]. cAMP aktiveret af IBMX phosphorylaterer ekstracellulær signalreguleret kinase (ERK) og phosphoinositide 3-kinaser/proteinkinase B (PI3K/Akt) signalveje og fører i sidste ende til aktivering af MITF i melanogeneseprocesser [7]. Derfor kan nedreguleringen af ​​disse proteiner betragtes som en vigtig faktor for anti-blegningseffekten.

Sorghum bicolor(S. bicolor), som tilhører familien Poaceae, betragtes som en vigtig afgrøde i intropiske områder, herunder Afrika, Mellemamerika og tørre områder, og er den fjerde vigtigste kornafgrøde i verden efter hvede, ris og majs [8 ]. Nylige undersøgelser har vist, at S. bicolor er gavnligt for mennesker, fordi det indeholder fytokemikalier såsom phenolforbindelser, tanniner og anthocyaniner [9]. Disse fytokemikalier har fået øget opmærksomhed på grund af deresantioxidant, anti-fedme, anti-diabetes og anti-inflammatoriske virkninger [10-14]. Mens der er forskellige forskningsresultater, er undersøgelser af S. bicolors hudblegningseffekt endnu ikke blevet udført. Derfor havde nærværende undersøgelse til formål at undersøge antioxidantaktiviteten og anti-melanogene virkninger afS. bicolorog at undersøge deres virkninger på IBMX-induceretmelanogenesei B16/F10 melanomceller.

2. Materialer og metoder

2.1. Kemikalier

Folin-Ciocalteus reagens, L-DOPA, L-tyrosin, L-ascorbinsyre, arbutin, acarbose, dimethylsulfoxid (DMSO), bovint serumalbumin, -glucosidase, svampetyrosinase, bovint serumalbumin,3-(4,{ {6}}dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) og IBMX blev købt fra Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). MITF (bsm-51339M) og tyrosinase (bs-0819R) blev købt fra Bioss (Beijing, Kina). TRP-1 (sc-166857) og -actin (sc-69879) blev købt fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, USA). Sekundære antistoffer (anti-kanin og anti-mus) blev opnået fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA).

2.2. Prøveforberedelse

S. bicolor(20 g) blev ekstraheret med forskellige ethanolkoncentrationer (0, 20, 40, 60, 80 og 95 procent; 1 L) ved 40 grader i 2 timer under anvendelse af en tilbagesvaler. Ekstrakterne blev filtreret under anvendelse af filterpapir (WhatmanInternational Limited, Kent, UK) og koncentreret under anvendelse af en vakuumfordamper (N-1000; EYELA Co., Tokyo, Japan). Efter at ekstrakterne var lyofiliseret under anvendelse af en vakuumfrysetørrer (Il Shin Lab Co., Ltd., Yangju, Korea), blev de tørrede ekstrakter opbevaret ved -20 grad indtil brug.

2.3. In vitro antioxidant aktivitet

2.3.1. Samlet phenolindhold (TPC)

Det samlede phenolindhold blev undersøgt ud fra princippet om, at Folin-Ciocalteus reagens blev reduceret til et blåt reaktionsprodukt under alkaliske forhold. En prøve (1 mL) blandet med Folin-Ciocalteus reagens og 7 procent natriumcarbonat. Blandingen blev aktiveret i 2 timer, og derefter blev absorbansen målt ved 760 nm ved anvendelse af et spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). TPC blev beregnet ud fra standardkurven for gallussyre, og resultaterne blev udtrykt som GAE g−1.

2.3.2. Radikal rensningsaktivitet

ABTS radikalkationopløsning blev fremstillet ved at blande 2,45 mM kaliumpersulfat og 7 mMABTS med 10{{10}} mM kaliumphosphatbuffer (pH 7,4) indeholdende 150 mM og tillade de skal reagere i 24 timer ved stuetemperatur. ABTS-opløsningen blev derefter fortyndet med destilleret vand for at opnå en absorbans på 0,700 ± 0,020 ved 734 nm. Prøven fik lov til at reagere med 980 µL af ABTS-opløsningen i 10 minutter ved 37 grader, og derefter blev absorbans ved 734 nm målt ved hjælp af et spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan). DPPH-radikalopløsning blev fremstillet af opløsning af 0,1 mM DPPH i 80% methanol. DPPH-opløsningen blev fortyndet til en absorbans på 1,000 ± 0,020 ved 517 nm. 50 µL af prøven blev blandet med 1,45 ml af DPPH-opløsningen og reageret i 30 minutter i mørke. Efter omsætning blev blandingen bestemt ved 517 nm.

2.3.3. Hæmmende effekt på lipidperoxidation

For at måle den hæmmende effekt på lipidperoxidation i hjernevæv blev metoden med thiobarbitursyre (TBA)-reaktivt stof brugt. Hjernevæv blev homogeniseret i 20 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,4) og centrifugeret ved 6000 x g i 20 minutter. Supernatanten blev tilsat til 0,1 mM L-ascorbinsyre og 10 µM ferrosulfat 37 grader i 1 times inkubation. Dernæst blev 30 procent trichloreddikesyre og 1 procent TBA tilsat til blandingen, som derefter blev inkuberet i et vandbad ved 80 grader i 20 min. Derefter blev TBA-MDA-komplekset målt ved hjælp af et spektrofotometer (UV-1201; Shimadzu, Kyoto, Japan) ved 532 nm.

2.4. Tyrosinasehæmmende effekt

Den tyrosinaseinhiberende virkning blev bestemt under anvendelse af L-tyrosin som et substrat. En prøve blev tilsat til en 96-brøndplade og blandet med 0.1 M natriumphosphatbuffer, tyrosinase og 0.1 mML-tyrosinsubstrat for at reagere ved 37 grader. Efter inkubering blev enzymaktiviteten målt under anvendelse af en mikropladelæser (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA) ved 490 nm. L-DOPA blev også anvendt som et substrat til at måle tyrosinaseinhiberende aktivitet. 67 mM natriumphosphatbuffer, tyrosinase og 10 mML-DOPA-substrat blev tilsat til prøven for at reagere ved 37 grader i 10 minutter. Tyrosinaseaktivitet blev målt ved 415 nm.

Cistanche hæmmer melanindannelsen

2.5. -Glucosidasehæmmende effekt

Den -glucosidaseinhiberende effekt blev målt ved at blande 0.1 M natriumphosphatbuffer og -glucosidase ved 37 grader i 10 min. Efter aktivering blev blandingen tilsat til 5 mM 4-nitrophenyl- -D-glucopyranosid i buffer ved 37 grader i 5 minutter, og derefter blev absorbansen målt ved 405 nm ved hjælp af en mikropladelæser (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.6. Cellelevedygtighedsanalyse

Cytotoksiciteten af ​​prøven blev estimeret ved hjælp af et MTT-assay. B16/F10 melanomceller blev dyrket ved 1 × 104 celler/brønd i en 96-brøndsplade i 24 timer. Derefter blev prøver behandlet til koncentrationer på 1, 2, 5 og 10 µg/ml. Prøver blev behandlet i 48 timer, hvorefter cellerne blev behandlet med 10 µg/ml MTT-stamopløsning i 3 timer. Til sidst blev mediet fjernet, og DMSO blev tilsat for at opløse formazanen. Mængden af ​​formazan blev kvantificeret ved hjælp af en mikropladelæser (EPOCH2;BioTek, Winooski, VT, USA) ved 570 nm (excitationsbølgelængde) og 655 nm (emissionsbølgelængde).

2.7. Måling af cellulært melaninindhold

For at måle mængden af ​​melanin blev B16/F10-melanomceller dyrket i en 24-brøndplade med en tæthed på 4×104 celler/brønd over i 24 timer. Derefter blev cellerne behandlet med 100 mM IBMX og ESB eller positiv kontrol (arbutin) i yderligere 48 timer. Efter behandling blev cellerne vasket og høstet under anvendelse af phosphatbuffer saltvand (PBS). De høstede celler blev derefter centrifugeret ved 16, 000 x g i 10 minutter, og den opnåede pellet blev opløst med 1 N natriumhydroxid indeholdende 10 procent DMSO ved 90 grader i 20 minutter. Melaninindholdet blev målt ved 490 nm under anvendelse af en mikropladelæser (EPOCH2; BioTek, Winooski, VT, USA).

2.8. Western Blot Analyse

Forbehandlede B16/F10 melanomceller blev vasket med PBS og lyseret under anvendelse af RIPA-buffer indeholdende 1 procent proteaseinhibitorer på is. Proteinkoncentrationer blev bestemt ved Bradford-proteinassay, og de lige store proteiner blev denatureret med en Laemmli-buffer i 10 minutter ved 95 grader. De denaturerede proteiner blev adskilt ved 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og blev derefter overført til polyvinylidendifluorid (PVDF) membraner (Millipore, Billerica, MA, USA). Derefter blev membraner blokeret med 5 procent skummetmælk i Tris-bufret saltvand med 0,1 procent Tween20 (TBST) i 1 time og derefter reageret med primære antistoffer natten over ved 4 grader. Membranerne blev reageret med de sekundære antistoffer i 1 time, og immunkomplekserne blev visualiseret ved anvendelse af forstærket kemiluminescensreagens (Bionote, Hwaseong, Korea). Båndbillederne blev detekteret og analyseret af Chemi-doc (iBright Imager, Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

2.9. UPLC-IMS-QTOF/MS2 Analyse

De vigtigste forbindelser i 60 procent ethanolekstrakter afS. bicolorblev analyseret ved UPLC-IMS QTOF/MS2 (Vion, Waters Corp., Milford, MA, USA). Kromatografisk adskillelse blev udført under anvendelse af en Acquity UPLC BEH C18-søjle (2,1 x 10{{10}} mm, 1,7 µm partikelstørrelse; Waters Corp.) ved en strømningshastighed på 0,35 ml/min. De mobile faser bestod af opløsningsmiddel A (0,1 procent myresyre i destilleret vand) og B (acetonitril), og analysebetingelser omfattede følgende tidsgradient: 1 procent B ved 0-1 min, 1-100 procent B ved 1-7 min. 100 procent B ved 7-8 min, 100-1 procent B ved 8-8,2 min, 1 procent B ved 8,2-10 min. Massespektrometri blev udført i negativ elektrospray-ioniseringstilstand (ESI) under følgende forhold: kildetemperatur, 100 ◦C; desolvationslinjetemperatur, 400 ◦C; rampekollisionsenergi, 10–30 V; kapillarspænding, 2,5 kV. Fenolforbindelser blev påvist ved en fuld scanning fra m/z 50 til 1500.

2.10. Statistisk analyse

Alle resultater blev præsenteret som middel ± standardafvigelse (SD). Den statistiske forskel mellem grupper blev bestemt ved en envejsvariansanalyse (ANOVA) ved hjælp af Duncans nye multiple range-test (p < 0.05)="" med="" sas-softwareversion="" 9.4="" (sas="" institute,="" cary,="" nc,="" usa)="" .og="" det="" indbyrdes="" forhold="" mellem="">antioxidanteffekter (ABTS/DPPH-radikalopfangende aktivitet og MDA-hæmmende effekt) og den hæmmende effekt afmelanogenese-medierede enzymer (tyrosinase og -glucosidase) blev evalueret Pearson-korrelationsanalyse.

3. Resultater

3.1. Samlet phenolindhold

For at sammenligneantioxidantaktivitet af hver ethanolekstrakt fraS. bicolorTPC blev undersøgt. Som vist i figur 1 var TPC forskellige blandt de ethanoliske ekstrakter; 60 procent ethanolekstrakt (150,08 ± 1,13 mg GAE/g) var signifikant højere end de andre ekstraktioner (0 procent ; 70,83 ± 1,18, 20 procent ; 100,42 ± 0,72, 40 procent 114,67 ± 1,46, 80 procent, 118,33 ± 3,17 og 95 procent, 73,67 ± 1,46 mg GAE/g). Derfor blev den 60 procent ethanoliske ekstrakt brugt til yderligere eksperimentelle analyser.

3.2. Radikal rensningsaktivitet

Detantioxidantaktiviteten af ​​det 60 procent ethanoliske ekstrakt fraS. bicolor(ESB) blev målt ved hjælp af ABTS/DPPH-assayet og MDA-assayet, og resultaterne blev vist i figur 2. ESBTS radikalopfangende aktivitet blev udvist ved 97,98 procent ved 1000 ug/ml koncentration og C-vitamin (99,82 procent). , som anvendes som den positive kontrol og også havde lignende radikalopfangende aktivitet ved samme koncentration (figur 2A). Og ESB viste en 50 procent hæmmende effekt (IC50-værdi) af ABTS-radikalet ved en koncentration på 409,71 ug/mL. Som vist i figur 2B blev ESBS DPPH-radikalopfangende aktivitet vist 79,44 procent ved 1000 ug/ml koncentration, og IC50-værdien blev angivet til 612,53 ug/ml. Den hæmmende effekt af MDA-produktion af ESB viste en hæmmende effekt på 89,54 procent ved 50 ug/ml koncentration og viste en højere hæmmende effekt end catechin (71,03 procent), som er den positive kontrol, ved samme koncentration (Figur 2C). Derudover blev IC50-værdien af ​​MDA observeret ved 16,56 ug/ml koncentrationer af ESB.

3.3. Hæmmende virkning af melanogenese-medierede enzymer

Den hæmmende effekt afmelanogenese-medierede enzymer blev evalueret under anvendelse af tyrosinase og -glucosidase (figur 3). For at måle den hæmmende aktivitet af tyrosinase mod melaninsyntese blev der udført eksperimenter med L-tyrosin og L-DOPA som et substrat under cellefrie forhold. Som et resultat var IC50-værdien 89,25 µg/mL, når L -tyrosin blev brugt som et substrat (figur 3A), men L-DOPA kunne ikke, at mere end 5 0 procent af den hæmmende effekt blev observeret (figur 3B). På dette tidspunkt var IC50-værdien af ​​den positive kontrol (arbutin) for L-tyrosin 74,35 µg/ml, hvilket var højere end ESB. ESB viste sig at have en bedre hæmmende effekt på tyrosinase ved brug af L-tyrosin end ved anvendelse af L-DOPA som et substrat. Baseret på resultaterne af assayet ved anvendelse af to substrater anses den tyrosinaseinhiberende virkning af ESB derfor for at være relateret til oxidationen af ​​L-tyrosin til L-DOPA snarere end oxidationen af ​​L-DOPA til DOPA-quinon i melanogenese. Tyrosinaseinhiberende effekt ved anvendelse af L-DOPA som substrat og radikalfjernende aktivitet (ABTS; 0.943, p < 0.05,="" dpph;="" 0.952,="" p="">< 0.05)="" indikerede="" de="" positive="" stærke="" korrelationer="" i="" tabel="">

For at måle den hæmmende effekt afmelanogenese-medieret enzym blev den hæmmende aktivitet mod -glucosidase af ESB målt. Som vist i figur 3C inhiberede ESB -glucosidase med 33,72 procent ved 200 µg/ml koncentration. Og IC50 for ESB var 46,29 µg/mL, hvilket er omkring fem gange højere end acarbose (216,05 µg/mL). Disse resultater indikerer, at ESB har bedre -glucosidaseinhiberende aktivitet end acarbose som en positiv kontrol. Og -glucosidasehæmmende effekt afslørede stærke positive korrelationer med MDA-hæmmende effekt (0,966, p < 0,05)="" i="" tabel="">

3.4. Cellelevedygtighed og cellulær melaninsyntese

For at bekræfte ESBs cytotoksicitet blev B16/F10 melanomceller behandlet med ESB i 24 timer ved 1, 2, 5, 10 og 20 µg/ml koncentrationer. Resultaterne viste, at ESB ikke påvirkede cellernes levedygtighed ved de angivne koncentrationer sammenlignet med kontrollen (figur 4A). Derfor blev eksperimenter udført ved at vælge koncentrationer på 2, 5 og 10 µg/mL. Efterfølgende blev B16/F10 melanomceller behandlet med IBMX for at analysere ESBs effekt på melaninproduktion. Som vist i figur 4B steg niveauet af melaninindhold til 316,85 procent, når det blev behandlet med IBMX. På den anden side viste den ESB-behandlede gruppe (108,60 procent) ved en koncentration på 10 µg/mL signifikant reduceret melaninindhold sammenlignet med den IBMX-behandlede gruppe og lignende melaninindhold sammenlignet med arbutingruppen (101,79 procent) som en positiv kontrol.

3.5. Melanogenesevej i B16/F10 melanomceller

Melanogeneseer en væsentlig proces til at beskytte menneskelig hud mod ydre stimuli, og denne proces reguleres af forskellige mekanismer. I denne undersøgelse målte vi ekspressionsniveauet af melanogenese-regulerende molekyler for at bekræfte den potentielle hæmmende mekanisme for ESB onIBMX-induceret melaninproduktion i B16/F10 melanomceller (figur 5). Resultaterne viste, at ESB effektivt reducerede IBMX-induceret MITF-ekspression (figur 5A, B). Således blev ekspressionen af ​​tyrosinase (figur 5A, C) og TRP -1 (figur 5A, D) nedreguleret af reduceret MITF med ESB-behandling. Som et resultat nedregulerede ESB-behandling ekspressionen af ​​beslægtede proteiner i IBMX-inducerede melanogenesisin B16/F10 melanomceller.

3.6. UPLC-IMS-QTOF/MS2 Analyse

En profil af ESBs hovedforbindelser blev scannet ved LC/MS i et interval på m/z 50-1500, og base peak-chromatogrammerne er vist i figur 6. Yderligere identifikation og karakterisering af forbindelserne blev udført i sammenligning med litteraturdata vha. MS2fragmenteringsdata (tabel 2). Baseret på fragmenterne i tidligere litteratur var top 2 1-O-caffeoylglycerol(m/z 253,07, 179,03, 161,02 og 135,04) [15]; top 3, dicaffeoylglycerider (m/z 415,10, 253,07, 179,03 og 135,04) [16]; top 4, 1,3-O-dicaffeoylglycerol (m/z 415,10, 253,07, 179,03, 161,02 og 135,04) [16]; top 5, p-coumaroyl-caffeoylglycerol (m/z . og 135,04) [17]; top 6,feruloyl-caffeoylglycerol (m/z 429,12, 253,07, 193,05, 161,02 og 134,03) [18]; top 7, tricin (m/z 329,23, 314,04, 299,01 og 271,02) [19]; og top 9, henholdsvis 9-hydroxyoctadecadiensyre (9-HODE) (m/z 295,22, 277,21 og 171,10) [20]. Blandt dem blev 1,3-O-dicaffeoylglycerol (figur 6B), tricin (figur 6C) og 9-HODE (figur 6D) identificeret som hovedforbindelser.

virkninger af cistanche:anti-oxidation

4. Diskussion

Melanogeneserapporteres at være forårsaget af øget oxidativt stress fra ydre stimuli.Oxidativt stress forårsager oxidation af DNA og proteiner, lipidperoxidation og øgede umættede fedtsyrer. Denne stress fører også til en unødvendig forøgelse af melaninsyntesen i melanocytter på huden. Således kan overdreven melanin genereret forårsage pigmentering, og det kan føre til hudkræft. IBMX stimulerer melanogenese ved at hæmme phosphodiesterase og derved øge niveauet af cAMP [7]. Efterhånden som niveauet af cAMP i celler stiger, forårsager det aktivering af ERK og PI3K/Akt signalvejene, der fremmer dannelsen af ​​proteiner forbundet med melanogenese. Derfor undersøgte vi blegningseffekten af ​​ESB på IBMX-induceret melanogenese i B16/F10 melanomceller.

Fenolforbindelser som planters sekundære metabolitter har den egenskab at blive stabiliseret af en resonansstruktur, når de reagerer med radikaler [21]. Fenolforbindelser virker også som vigtige faktorer for antioxidantaktiviteten, såsom ABTS/DPPH radikalopfangende aktivitet, og virker som hæmmere af pigmentdannelse, fordi de har en kemisk struktur som L-tyrosin [22,23]. Et ABTS/DPPH-assay er den mest almindelige og enkleste metode til estimering in vitroantioxidantaktivitet. I denne undersøgelse har ESB vist en høj TPC (Figur 1) og ABTS/DPPH radikalopfangende aktivitet (Figur 2A, B). Især ESB var højere i ABTS-radikalopfangende aktivitet end DPPH-radikalopfangende aktivitet. DPPH-assayet bruges til at måle radikalopfangende aktivitet af hydrofobe forbindelser, hvorimod ABTS-assayet gør det muligt at måle radikalopfangende aktivitet mod hydrofobe såvel som hydrofile forbindelser [24]. Derfor blev det bekræftet, at ESBs radikalopfangende aktivitet var mere påvirket af den hydrofile forbindelse.

UV-stråling forårsager ROS-produktion og har direkte og indirekte virkninger på huden. Især ROS inducerer lipidperoxidation ved at angribe umættede fedtsyrer, som er komponenter i cellemembraner [2]. Ophobningen af ​​lipidperoxider fører til ødelæggelse af hudens antioxidantsystem, hvilket forårsager pigmentering, betændelse og aldring [25]. I denne undersøgelse viste ESB en fremragende hæmning af lipidperoxidation (figur 2C). De phenoliske forbindelser indeholdt i naturlige planter blev rapporteret at være forbundet med radikalopfangende aktivitet [26]. Også Maresca et al. [27] rapporterede, at fjernelse af ROS med antioxidanter er effektiv til at hæmme melaninbiosyntesen. En nylig undersøgelse rapporterede, at ethylacetat- og aglyconfraktionerne af Dendropanax morbifera-blade kan fungere som hudcellebeskyttende midler og naturlige antioxidanter ved at beskytte HaCaT-celler mod oxidativt stress [28]. Desuden viste behandling med de samme fraktioner en bedre anti-melanogen effekt end arbutin, brugt som en positiv kontrol, mod -MSH-induceret overdreven melanindannelse i B16/F10 melanomceller [28].

Flere mekanismer er forbundet medmelanogenese, og det fælles mål for hudblegemidler er reguleringen af ​​tyrosinase, som er et vigtigt enzym i melanogenese. Tyrosinase, et kobberholdigt enzym, katalyserer to reaktioner på denne vej: hydroxyleringen af ​​L-tyrosin til L-DOPA og oxidationen af ​​L-DOPA til DOPA-quinon [6]. Når den udsættes for store mængder UV ellerROS, øges aktiviteten af ​​tyrosinase, og melaninsyntesen øges også. Derfor viste resultaterne af måling af den hæmmende effekt af tyrosinase i forhold til melaninsyntese, at ESB viste sig at have en bedre hæmmende effekt på tyrosinase ved anvendelse af L-tyrosin end ved anvendelse af L-DOPA som et substrat (figur 3A,B). En nylig undersøgelse rapporterede sammenhængen mellem TPC og tyrosinaseinhibering, fordi phenoliske forbindelser har en kemisk struktur, der ligner den for L-tyrosin, et substrat for tyrosinase. Ifølge Choi et al. [29] blev det observeret, at effektiviteten af ​​frie radikaler-fjernende aktivitet og tyrosinaseinhiberende effekt steg i forhold til fermenteringstiden for Cheonggukjang, hvilket skyldtes, at mængden af ​​TPC steg med fermenteringstiden. Im & Lee [30] observerede, at ethylacetatfraktionen af ​​75 procent ethanolekstrakt fra Taraxacum core num havde rigelig TPC og antioxidantaktivitet, og den tyrosinaseinhiberende effekt var overlegen i forhold til andre fraktioner (hexan, chloroform, butanol og vandig).

Tyrosinase, et af glycoproteinerne, glykosyleres, når polypeptidkæder translokeres til det endoplasmatiske retikulum. Forskellige enzymer er involveret i denne proces, og blandt dem kan inhibering af -glucosidase hæmme foldningen af ​​tyrosinase til dannelse af en inaktiv struktur uden kobber. Som et resultat heraf er tyrosinase ikke i stand til at blive transporteret til melanosomet og hæmmer melaninproduktionen. Den tilstedeværende polyphenol i planter er ikke kun i stand til at reducere oxidativt stress, men hæmmer også kulhydrathydrolyserende enzymer såsom -glucosidase ved at binde sig til proteiner [31]. En tidligere undersøgelse indikerede, at B16/F10 melanomceller i nærvær af glycosyleringshæmmere resulterer i reduktion af melanogenese ved at reducere det totale indhold af tyrosinase [32]. Og Choi et al. [33] rapporterede, at deoxynojirimycin, en af ​​-glucosidase-hæmmerne, blokerede glycosylering af tyrosinase og hæmmede tyrosinase-migrering til melanosomer. Ando et al. [34] har vist, at det er muligt at hæmme melaninsyntesen i melanomceller ved at kontrollere glykosyleringen af ​​tyrosinase med -glucosidasehæmmere såsom glutathion, ferritin og geldanamycin. Kim et al. [35] rapporterede de gode korrelationer for bipollen som en naturligantioxidantmellem TPC og tyrosinaseinhiberende effekt ({{0}}.973,p < 0.05),="" og="" også="" tpc="" gav="" den="" positive="" korrelation="" med="" dpph-radikalopfangende="" aktivitet="" (0,897,="" p="">< 0,05).="" og="" resultaterne="" tyder="" på,="" at="" polyfenoler="" som="" naturlige="" antioxidanter="" kunne="" være="" potentielt="" effektive="" til="" hudblegning="" baseret="" på="" deres="" fremragende="" antioxidantaktivitet.="" i="" vores="" undersøgelse="" blev="" antioxidantvirkningen="" af="" ​​esb="" i="" processen="" med="" at="" hæmme="" virkningen="" af="" ​​tyrosinase="" angivet="" at="" være="" stærkt="" korreleret="" gennem="" inhibering="" af="" oxidationen="" af="" ​​l-dopa="" til="" dopa-quinon="" og="" glycosyleringen="" af="" ​​tyrosinase="" (tabel="" 1).="" af="" denne="" grund="" er="" antioxidanten="" virkning="" af="" esb="" har="" en="" effekt="" på="" hudblegningseffekt="" ved="" at="" påvirke="" hæmningen="">melanogenese-medierede enzymer.

naturlig antioxidant: cistanche tubulosa

PKA-signalvejen er hovedprocessen involveret i melanogenese, og denne aktiveres af IBMX, som er et cAMP-forhøjende middel. PKA-signalvejen kan regulere transkriptionsfaktorer såsom MITF og cAMP-responsivt element-bindende protein, som er involveret i ekspressionen afmelanogeneseregulatorer såsom tyrosinase, TRP-1 og TRP-2. Som følge heraf øger IBMX-behandling ekspressionen af ​​MITF og tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP-1) gennemcAMP-aktivering [7]. Park et al. [36] viste, at mængden af ​​melaninsyntese fra PapenfusiellaCuomo ethanolekstrakt (65,17 ± 13,40 procent) ved en koncentration på 40 µg/mL svarede til kojinsyre (72,30 ± 3,92 procent) som en positiv kontrol, og rapporterede, at den viste potentiale som et naturligt blegemateriale. I denne undersøgelse viste ESB en effektiv hæmmende effekt på melaninsyntese svarende til den positive kontrol ved lave koncentrationer (figur 4). Derefter blev western blot-analyse udført på melanogenese-medieret protein under anvendelse af B16/F10-melanomceller for at vurdere ESBs detaljerede anti-melanogene effekt.

Akt, som er involveret i forskellige mekanismer, spiller en nøglerolle i flere cellulære processer såsom apoptose, glucose og hudmetabolisme. Især stigningen af ​​cAMP ved IBMX-behandling reducerer Akt-phosphorylering og dens aktivering. Inaktiveret Akt inducerer også aktiveringen af ​​GSK-3, hvilket betyder, at phosphorylering ikke opnås, dvs. niveauet af p-GSK-3 reduceres [7]. Ifølge tidligere litteratur nedgraderer luftdelen af ​​Pueraria thunbergia MITF ved at aktivere Akt/GSK-3 signalvejen i B16/F10 melanomceller [37]. Også Huang et al. [38] viste, at [6]-skole fremmede p-Akt-ekspression og hæmmede melanogenesesignalering i B16/F10-melanomceller. Aktiveret GSK-3 opregulerer tyrosinase-genfamilien ved at fosforylereSer289 af MITF, hvilket som konsekvens fremmer melanogenese. MITF er en vigtig transkriptionsfaktor, der binder sig til en tyrosinase-genpromotor, og den øger efterfølgende ekspressionen af ​​enzymer relateret til melanocytproliferation ogmelanogenese[7]. Når udtrykket af tyrosinase fremmes af MITF, fører det efterfølgende til en stigning i niveauerne af TRP-1 og TRP-2, og som et resultat producerer disse melanogene enzymer melanin [6]. Oxidativ stress forårsaget af UV-lys stimulerer melaninpigmentering i huden. Derfor er den rensende aktivitet af radikaler eller ROS effektiv til at undertrykke melaninproduktion, og polyphenoler med antioxidantaktivitet kan have fremragende blegningseffekter [38]. Choi et al. [39] viste, at koreanske bambusstængler (Phyllostachys nigra varietet henosis) nedregulerede PKA/CREB-medieret MITF via opfangning af ABTS/DPPH-radikaler. Og et 70 procent ethanolekstrakt af Nelumbo nucifera G. Leaf hæmmede udtrykket af MITF, tyrosinase og TRP'er med antioxidantaktiviteter såsom elektrondonationsevne og hæmning af xanthinoxidase [40]. I dette eksperiment blev det vist, at ESB-behandling reducerede ekspressionen af ​​MITF- og tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP-1), som fremmer oxidationen af ​​DHICA til DHI i melanogenese-vejen (figur 5). Baseret på disse resultater har ESB vist sig at nedregulere IBMX-medieret melanogenese baseret på dens overlegneantioxidanteffekter.

Baseret på den tidligere litteratur blev de vigtigste phenolforbindelser i ESB identificeret som1,3-O-di-caffeoylglycerol (figur 6B), tricin (figur 6C) og 9-HODE (figur 6D) [16 ,19,20]. Blandt dem er 9-HODE, som er den hyppigst forekommende forbindelse i ESB, en af ​​metabolitterne af linolsyre og viser en blegende effekt på irriteret hud ved at hæmme tyrosinase [41]. I modsætning til andre alifatiske forbindelser er 9-HODE også rapporteret at være stabil i alle oxidationseksperimenter og at have en blegende effekt på ROS-skader [41]. I mellemtiden tricin (5,7-dihydroxy- 2-(4-hydroxy-3,5-di-methoxyphenyl)-4H-chromen{{24 }}one) har længe været anerkendt for dets gavnlige sundhedseffekter, såsom antioxidant-, antivirale og antitumor-/antikræftaktiviteter [42-44]. Mu et al. [45] rapporterede, at tricin udviste en bedre hæmmende effekt på tyrosinaseaktivitet sammenlignet med arbutin som en positiv kontrol. Desuden har Meng et al. [46] rapporterede, at tricin isoleret fra methanolekstraktet af unggrøn byg (Hordeum vulgare L.) hæmmede melaninbiosyntese og tyrosinaseaktivitet i B16/F10melanomceller gennem hydroxylgruppen i C-4'-positionen og methoxygrupper ved C-3',5'positioner af tricinskelettet. Phenylpropanoider såsom 1-O-caffeoylglycerol, dicaffeoylglycerider og 1,3-O-dicaffeoylglycerol er organiske forbindelser, der syntetiseres af planter fra phenylalanin og tyrosin. Phenylpropanoid og deres glycosylerede former blev rapporteret at være potente antioxidanter, enten ved direkte at fjerne ROS eller ved at fungere som kædebrydende peroxyl-radikal-fjernere [47].

p-cumarsyre, som har en kemisk struktur svarende til L-tyrosin, konkurrerer med L-tyrosin om aktive steder på tyrosinase [48]. Det er kendt som en stærk tyrosinaseinhibitor, og det blev rapporteret, at dets anti-melanogenese-effekt er stærkere end strukturelt lignende forbindelser såsom kanelsyre [48]. Derudover har An et al. [48] ​​rapporterede, at p-cumarsyre, en bestanddel af Sasa quelpaertensis Nakai, hæmmede tyrosinaseaktivitet ved at bruge L-DOPA som et substrat og reducerede melaninproduktion i B16/F10 melanomceller. Derfor kan ESB anses for at have en fremragende blegende effekt gennem p-cumarsyre. Desuden viste MS-spektrene for 1-O-caffeoylglycerol og 1-3-O-dicaffeoylglycerol lignende fragmenteringsmønstre ved m/z 179, 161 og 135, og disse fragmenter blev rapporteret som koffeinsyrerest. De har et UV-spektrum svarende til det for et koffeinsyrederivat med en λmax ved omkring 326 nm, og anses derfor for at være et koffeinsyrederivat [48]. Det blev rapporteret, at koffeinsyre, et derivat af forskellige forbindelser, er en potent antioxidant in vitro/in vivo og reducerer styrosinaseaktivitet ogmelanogenesei B16/F10 melanomceller. Følgelig kan den anti-melanogene effekt af ESB anses for at skyldesantioxidanterog hudblegende stoffer såsom alifatiske og phenoliske forbindelser.

virkninger af cistanche: antioxidation

5. Konklusioner

For at vurdere muligheden som hudblegningsmiddel afSorghum bicolor, antioxidant og anti-melanogene virkninger af ESB på IBMX-induceret melanogenese blev evalueret i B16/F10 melanomceller. ESB udviste betydeligeantioxidantaktiviteter i ABTS/DPPH radikal scavenging aktivitet og MDA-hæmmende effekt. ESB forhindrede det første skridt afmelanogeneseved at hæmme -glucosidase og tyrosinase under anvendelse af L-tyrosin og L-DOPA som substrater. De anti-melanogene virkninger af ESB på IBMX-induceretmelanogeneseblev evalueret i B16/F10 melanomceller, og resultaterne viste, at ESB hæmmede IBMX-induceret melanomceller i B16/F10 melanomceller. Melaninakkumulering blev hæmmet af nedregulering af udtrykket af MITF og tyrosinase-genfamilien (tyrosinase og TRP-1) i IBMX-induceret melanogenese. De vigtigste forbindelser af ESB blev analyseret som 1,3-O-di-caffeoylglycerol, tricin og 9-HODE. Følgelig viste ESB sig in vitroantioxidantaktivitet og en anti-melanogen effekt i B16/F10 melanomceller, og kan derfor bruges som hudblegemiddel på kosmetikmarkedet.

anti-oxidationcistanche tabletter