Anti-allergiske og anti-inflammatoriske virkninger af Neferin på RBL-2H3-celler

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Abstrakt:Mastceller spiller en meget vigtig rolle i hudallergi og -betændelse, herunder atopisk dermatitis og psoriasis. Tidligere har man fundet ud af, at reference har anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter på huden, men dens effekt på mastceller er endnu ikke undersøgt i detaljer. I denne undersøgelse brugte vi mastceller (RBL-2H3-celler) og musemodeller til at studere de anti-allergiske og inflammatoriske virkninger af reference. For det første fandt vi ud af, at reference hæmmer degranuleringen af ​​mastceller og ekspressionen af ​​cytokiner. Derudover observerede vi, at når mastceller blev stimuleret af A23187/phorbol 12-myristat-13-acetat (PMA), blev forhøjelsen af ​​intracellulært calcium hæmmet ved reference. Fosforyleringen af ​​MAPK/NF-KB-vejen reduceres også ved forbehandling af reference. Resultaterne af in vivo undersøgelser viser, at reference kan forbedre udseendet af dermatitis og mastcelleinfiltration forårsaget af dinitrochlorbenzen (DNCB). Ydermere genoprettes også udtryk for barriereproteiner i huden.cistanchEndelig blev det fundet, at reference kan reducere ridseadfærden forårsaget af forbindelse 48/80. Tilsammen indikerer vores resultater, at reference er et meget godt anti-allergisk og anti-inflammatorisk naturprodukt. Dens virkning på mastceller bidrager til dens farmakologiske mekanisme.

Nøgleord:reference; naturlige produkter; mastcelle; dermatitis; kløe

Klik venligst her for at vide mere

1. Introduktion

Mange undersøgelser har bekræftet, at allergiske sygdomme er resultatet af ikke kun medfødt immunaktivering, men også adaptiv aktivering. Blandt dem spiller mastceller en meget vigtig rolle i en række allergiske sygdomme såsom allergisk rhinitis, astma og allergisk dermatitis. Mastceller udtrykker IgE-receptorer (FceRI) på deres cellemembraner, og FceRI-receptorer har en høj affinitet for IgE-antistoffer [1,2]. Når antigenspecifikt IgE binder til FceRI, opstår der en interaktion, og der opstår en allergisk reaktion. Aggregeringen af ​​FceRI kan aktivere receptortyrosinkinaser, initiere nedstrømsreaktioner og fremme phosphoryleringen af ​​forskellige nøgleproteiner (såsom mitogenaktiveret proteinkinase; MAPK'er), hvilket i sidste ende fører til tilstrømningen af ​​calciumioner (Ca2 plus ), som er en nøglebegivenhed i mastcelledegranulering [3].cistanche AustralienDe aktiverede mastceller degranulerer og frigiver kemiske mediatorer. Disse kemiske mediatorer, der bruges i allergiske reaktioner, kan forårsage betændelse [4], så behandlingen af ​​allergiske symptomer involverer mastcelledegranuleringshæmmere. Derfor bruges inhiberingen af ​​IgE-medieret mastcelledegranulering ofte til at identificere nye forbindelser til at forebygge og behandle allergiske sygdomme. Det er blevet fastslået, at anti-dinitrophenyl (DNP)IgE-antistoffer og -antigener kan inducere passive hudoverfølsomhedsreaktioner (PCA) som en typisk in vivo-model for øjeblikkelig overfølsomhed og som et forskningslægemiddel for potentialet af anti-antigeniske allergier [5,6 ]. Derudover kan mastcelledegranulering også være forårsaget af ikke-immunstimulerende midler, såsom forbindelser 48/80 og A23187. A23187 calciumionophor, har længe været kendt for at stimulere mastcellesekretion med frigivelse af præformede mediatorer, såsom histamin fra deres granula, tjener som eksempel [4]Forbindelse 48/80 er en blandet polymer af p-methoxy-N-methylphenethylamin tværbundet af formaldehyd, som er meget brugt til uafhængig stimulering af mastceller [7,8]Derfor er passende mængder af forbindelse 48/80 og A23187 almindeligvis blevet brugt som reagenser til at studere mekanismen for allergiske reaktioner. Ifølge statistiske evalueringer lider omkring 15-20 procent af befolkningen af ​​atopisk dermatitis. Uanset om det er børn eller voksne, der lider af denne sygdom, uden ordentlig behandling, kan atopisk dermatitis forårsage psykiske lidelser for patienter og belaste deres familie og sociale sundhedsomkostninger [9]. Desværre er der ingen egnet behandlingsmetode til at helbrede allergisk dermatitis. De nuværende behandlingsmuligheder undgår stadig sygdomsfremkaldende allergener, og kontinuerlig brug af steroider er den gyldne standard for behandlingen. De uundgåelige allergener og lægemidlers bivirkninger har foranlediget den presserende udvikling af nye terapeutiske lægemidler. Naturlige forbindelser isoleret fra medicinske urter og planter er potentielle kilder til terapeutiske midler til at forebygge og behandle inflammatoriske sygdomme og forbedre livskvaliteten for patienter med allergiske lidelser.

Cistanche kan anti-aging

Referencen kommer fra lotuskernen (frøets embryo) af planten Nelumbo nucifera og er et større bisbenzylisoquinolinalkaloid. Der er evidens for, at reference har en lang række farmakologiske egenskaber, såsom anti-cancer, antioxidant, antiinflammatoriske og neurobeskyttende virkninger i mange sygdomme [10-15].cistanche fordeleKhan et al. fandt ud af, at reference frembringer anti-fotoaldringseffekter ved at hæmme den UV-medierede stigning i ROS- og malondialdehyd(MDA)-niveauer i humane keratinocytter og fibroblaster[16,17]For nylig fandt vi ud af, at reference har potentiale som alternativ medicin til behandling af atopisk dermatitis eller andre hudrelaterede inflammatoriske sygdomme[18]. Det er dog stadig usikkert, om referencen har en anti-hudallergieffekt i mastceller. I denne undersøgelse havde vi til formål at undersøge virkningerne af reference på mastcellemedierede allergiske sygdomme ved hjælp af humane mastcellelinjer (RBL-2H3-celler) og en forbindelse 48/80- og DNCB-induceret anafylaksi musemodel.

La referencia proviene del núcleo de loto (el embrión de la semilla) de la planta Nelumbo nucifera y es un importante alcaloide de bisbencilisoquinolina. Existe evidencia de que la reference tiene una amplia gama de propiedades farmacológicas, como efectos anticancerígenos, antioxidanter, antiinflamatorios y neuroprotectores, and muchas enfermedades [10-15]. Beneficios de la cistanche Khan et al. encontró que la referencia producere efectos anti-fotoenvejecimiento al inhibir el aumento de los niveles de ROS y malondialdehído (MDA) mediado por UV en queratinocitos y fibroblastos humanos [16,17] de atópica dermatitis u otras enfermedades inflamatorias relacionadas con la piel[18]. Sin embargo, sigue siendo incierto si la referencia tiene un efecto contra la alergia cutánea en los mastocitos. En este estudio, nuestro objetivo fue investigar los efectos de referencia en las enfermedades alérgicas mediadas por mastocitos, utilizando líneas de mastocitos humanos (células RBL-2H3) y un modelo de ratones con anafilaxia in 8ida/8 compa DNCB .

2. Resultater

2.1. Neferin cytotoksicitetstest på rottemastceller (RBL-2H3)

Da rotte basofil leukæmi (RBL)-2H3-celler, en histaminfrigivende mastcelleanalog, er egnede celler til at undersøge virkningerne af mastcellemedieret inflammation [19], brugte vi disse celler til at undersøge det antiallergiske middel. virkninger af reference. Først testede vi, om referencen kan producere cytotoksicitet i mastceller. Når cellerne forbehandles med reference fra 1 til 30 μM i 24 timer, vil cellernes levedygtighed ikke blive påvirket af referencebehandlingen (figur 1).

2.2.Neferin reducerer degranuleringseffekten af ​​RBL-2H3 stimuleret af forskellige aktivatorer

RBL-2H3-celler bruges almindeligvis til in vitro-undersøgelser af degranulering [20-22]Stimulering af RBL-2H3-cellerne med anti-dinitrophenol (DNP)IgE og DNP-konjugeret humant serumalbumin (HSA) udløser degranulering. Derudover er mastceller kendt for at degranulere som reaktion på syntetiske forbindelser, såsom forbindelse 48/80 og calciumionoforen A23187, og disse forbindelser er blevet brugt som bekvemme reagenser til direkte undersøgelser af mekanismerne for in vitro allergireaktioner [23, 24]. Resultaterne viste, at cytoplasmaet af RBL-2H3, der ikke blev aktiveret af aktivatoren, indeholdt begrænsede sekretoriske granuler.cistanche kolesterolBehandling af reference (10μM) alene påvirkede ikke aktiviteten af ​​RBL-2H3 (figur 2A, B). Tilsætningen af ​​forskellige aktivatorer, herunder forbindelse 48/80, A23187 og anti-DNP/IgE plus DNP/HSA, fyldte imidlertid klart cytoplasmaet med sekretoriske granuler. Under elektronmikroskopet kan det ses, at der er et stort antal sekretoriske granula i cytoplasmaet, og nogle sekretoriske granula smelter endda sammen med cellemembranen, hvilket fører til degranulering (figur 2C-E). Efter forbehandling med reference 10 uM var de sekretoriske granuler i cytoplasmaet signifikant reduceret (figur 2F-H). Disse resultater indikerer, at reference effektivt kan hæmme aktiveringen og degranuleringen af ​​RBL-2H3 stimuleret af aktivatoren.

2.3. Neferin hæmmer PMA/A23187-induceret intracellulær calciumstigning i RBL-2H3

Calciumioner spiller rollen som sekundær budbringer i processen med celleaktivering. A23187 er den mest effektive måde at øge indtrængning af calciumioner gennem cellemembraner og stimulere aktiveringen af ​​mastceller. Phorbol myristatacetat (PMA) kan aktivere proteinkinase Cand og øge intracellulære calciumioner for at øge effekten af ​​A23187. Forøgelsen af ​​calciumioner i mastceller er også blevet betragtet som en vigtig faktor til at inducere mastcelleaktivering, så det påvirker degranuleringen af ​​mastceller og frigiver flere inflammatoriske cytokiner og kemokiner.cistanche deserticola bivirkninger,Derfor forsøgte denne undersøgelse at undersøge, om referencen kan hæmme calciumionkoncentrationen i RBL-2H3, når den hæmmer inflammation. Forsøgsgruppen blev opdelt i med eller uden referenceforbehandling i 20 minutter, og 1 mM CaClz og PMA/A23187 blev tilsat for at stimulere og aktivere RBL-2H3. De eksperimentelle resultater viste, at behandling af RBL-2H3 med forskellige referencekoncentrationer alene ikke påvirkede stigningen i intracellulær calciumionkoncentration. I den PMA/A23187-inducerede Ca2t-tilstrømningsgruppe steg den intracellulære calciumionkoncentration signifikant. RBL-2H3-celler blev forbehandlet i 20 minutter med reference (3 μM og 10 μM), og calciumionkoncentrationen blev signifikant reduceret (figur 3).

2.4. Neferin reducerede mRNA-ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner i PMA/A23187 stimuleret af RBL-2H3

Hudens immunrespons vil øge antallet af mastceller i kroppen, og mastcellerne vil så producere pro-inflammatoriske cytokiner og fremskynde sygdommens fremgang. Pro-inflammatoriske cytokiner, især TNF-a, IL-6, IL-1 og IL-8, inducerer ikke kun inflammation, men forårsager også leukocytinfiltration, granulomdannelse og vævsfibrose. PMA/A23187 virker på mastceller og inducerer dem til at producere IL-16, IL-6, TSLP og TNF-, hvilket forårsager allergirelateret inflammation. Derfor forbehandlede vi RBL-2H3 med reference i 20 minutter og stimulerede med PMA/A23187 i 6 timer for at påvise, om referencen kan nedregulere mRNA-ekspressionen af ​​IL-1, IL{{ 19}}, TSLP og TNF-a. Resultaterne viste, at i gruppen behandlet med reference alene, var ekspressionen af ​​cytokin-mRNA ikke påvirket, og ekspressionen af ​​mRNA i gruppen, der inducerede inflammation af PMA/A23187, steg signifikant. I gruppen behandlet med reference blev det observeret, at mRNA-ekspressionsniveauerne af IL-1, IL-6, TSLP og TNF-a var signifikant undertrykt (figur 4).

2.5. Neferin hæmmer PMA/A23187-induceret fosforylering af MAPK-vejen i RBL-2H3

Tidligere undersøgelser har påpeget, at mastceller skal frigive intracellulære calciumioner for at aktivere MAPK. Derudover regulerer MAPK-signalvejen ekspressionen af ​​monocytter, T-lymfocytter, B-lymfocytter, cytokiner og kemokiner og inducerer autoimmunitet. Denne mekanisme ligner aktiveringsvejen for PMA/A23187. I denne undersøgelse undersøgte vi, om referencen kan deltage i reguleringen af ​​MAPK-veje. Vi behandlede forskellige koncentrationer af reference (1,3 og 10 uM) til RBL-2H3 i 20 minutter og stimulerede derefter med PMA/A23187 i 30 minutter for at inducere inflammation. Resultaterne viste, at når RBL-2H3 blev behandlet med forskellige referencekoncentrationer alene, blev aktiveringen af ​​p38-, JNK- og ERK-proteiner ikke påvirket. I gruppen behandlet med PMA/A23187 alene fandt vi, at p38-, JNK- og ERK-proteiner blev aktiveret og har signifikant fosforylering. I gruppen forbehandlet med reference blev det observeret, at for højere referencekoncentrationer var phosphoryleringen af ​​p38-, JNK- og ERK-proteiner signifikant reduceret (figur 5A-C).

2.6. Neferin hæmmer PMA/A23187-induceret phosphorylering af NF-B-vejen i RBL-2H3

Ekspressionen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner afhænger af aktiveringen af ​​transkriptionsfaktoren NF-kB i mastceller. Når IKB-proteinet blev phosphoryleret og nedbrudt, blev NF-kB frigivet og migreret ind i kernen, binding med dets tilsvarende DNA-responsive elementer og fremmer transkriptionen af ​​proinflammatoriske mediatorer. Der blev produceret mange cytokiner og kemokiner, som regulerer immunrespons, differentiering og inflammation. Derfor undersøgte vi, om forbehandling med reference påvirker proteinphosphorylering induceret af PMA/A23187. Vi behandlede forskellige referencekoncentrationer (1,3 og 10 μM) til RBL-2H3. Efter 20 minutter stimulerede PMA/A23187 RBL-2H3 i 1 time eller 2 timer for at fremkalde inflammation. Resultaterne viste, at behandling af RBL-2H3 med forskellige referencekoncentrationer alene ikke påvirkede phosphoryleringen af ​​IKBa og NF-KB. Når PMA/A23187 blev brugt til stimulering, blev der observeret en signifikant stigning i phosphoryleringen af ​​IkBo og NF-KB. I gruppen forbehandlet med reference blev det fundet, at phosphoryleringen af ​​IkBa (figur 6A) og NF-KB (figur 6B) var signifikant reduceret.

2.7. Neferins effekt på 2,4-dinitrochlorbenzen(DNCB)-induceret atopisk dermatitis

DNCB er en dyremodel for sygdomsforskning, et repræsentativt irritationsmiddel, der forårsager atopisk dermatitis[25]. Vores eksperiment bruger 1 procent dinitrochlorbenzen (DNCB) opløst i 75 procent alkohol til at inducere det første trin af sensibiliseringsrespons. Reference (3mg/kg og 10 mg/kg) og dexamethason (Dexa,{{10}},2 mg/kg) opløst i DMSO blev administreret intraperitonealt på den femte dag i ti dage . På den 8., 1. og 14. dag blev 0,5 procent DNCB påført som anden fase af inflammation. Mus blev opdelt i fire grupper - kontrolgruppe, DNCB-gruppe, referencebehandlet gruppe og dexamethason-behandlet gruppe - og derefter, efter sammenligning mellem grupperne, blev forskellene noteret. Vi observerede, at DNCB inducerede en atopisk hudbetændelsesreaktion på huden på mus. Efter påføring af DNCB viste det sig, at musenes hud øgede rødme og skældannelse. Disse skyldes alle unormal keratinocytproliferation, infiltration og aggregering af immunceller. Gruppen behandlet med reference 3 mg/kg og dexamethason 0,2 mg/kg i fire dage havde lindret rødme. Vi fortsatte med at observere tilstanden af ​​musenes ryghud op til dag 15. Sammenlignet med kontrolgruppen havde DNCB-gruppen alvorlige røde og hævede hudsygdomme, og der var skæl og sår, der så ud til at være forårsaget af kløe og smerte . Vi kan finde en tendens til faldende grad efter behandlinger med reference og dexamethason (figur 7A). Toluidinblå farve blev brugt til at observere antallet af aggregerede mastceller. Mastcellerne så lilla ud, når de blev observeret under et mikroskop. Det kan kvantitativt påvises, at mange mastceller infiltrerede og akkumulerede i læderhuden i DNCB-forsøgsgruppen, steg signifikant sammenlignet med kontrolgruppen. I gruppen behandlet med reference og dexamethason blev infiltrationen, aggregeringen og antallet af mastceller reduceret (figur 7B, C).

2.8. Neferin forbedrer mRNA-ekspressionen af ​​barriere-relaterede molekyler efter behandling af DNCB

Den hudrelaterede betændelse forårsaget af AD kan forårsage unormal hudbarrierefunktion. Hvis hudbarrieren er defekt, er det lettere for antigener eller irritanter at trænge ind i hudens epidermis og komme ind i kroppen for at fremkalde immunrelaterede reaktioner. Samtidig vil produktionen af ​​differentieringsproteiner, herunder filaggrin, loricrin og involucrin, blive undertrykt. Derfor er det meget vigtigt at genoprette den beskadigede hudbarriere for at forebygge og behandle AD [26]. I vores undersøgelse brugte vi referencer til at gribe ind i dyremodellen af ​​DNCB-induceret atopisk dermatitis. Efter at have ofret mus, blev det dorsale hudvæv jordet til RI-qPCR-analyse for at evaluere, om referencen kan forbedre mRNA-ekspressionsreduktionen i filaggrin, loricrin og involucrin efter behandlingen af ​​DNCB. Resultaterne viste, at DNCB-eksperimentgruppen havde signifikant reduceret mRNA-ekspression af filaggrin, loricrin og involucrin sammenlignet med kontrolgruppen. mRNA-ekspressionen af ​​filaggrin, loricrin og involucrin var signifikant forøget i gruppen behandlet med reference og dexamethason sammenlignet med DNCB-gruppen (figur 8).

Vi har yderligere bevist, at reference har en anti-allergisk kradseeffekt. Vi brugte et mastcelledegranuleringsmiddel, forbindelse 48/80, til at inducere ridseadfærd hos BALB/c-mus. Som vist i figur 9 fandt vi, at referencebehandlingen hæmmede ridseadfærden forårsaget af forbindelse 48/80 (50 ug/sted). Gentagen administration af lavere og højere referencedoser (3 og 10 mg/kg) i 5 på hinanden følgende dage reducerede signifikant antallet af ridser forårsaget af forbindelse 48/80.