Anti-aldring - Klotho genaktiveret stillads fremmer foryngende sårhelingsrespons i humane fedtafledte stamceller

Nøgleord:anti aldring; -Klotho; gen-aktiveret stillads; fedtafledte stamceller; angiogenese;matrixaflejring;foryngende helbredelse

Klik her for at få Herb Cistanche til anti-aging og sårheling

1. Introduktion

Sårheling er en kompleks biologisk proces, der kræver en stram orkestrering af flere cellulære begivenheder [1]. I den aldrende befolkning bliver cellulære begivenheder imidlertid forstyrret, hvilket fører til forsinket heling [2]. Forstyrrelsen i helingsmekanismerne opstår dels på grund af den reducerede målsøgning af stamcellerne fra knoglemarven og andre fremherskende stofskiftesygdomme såsom diabetes [3,4]. Inden for sårbehandling bliver anvendelsen af ​​biomateriale stilladser mere almindelig som behandling. Biomateriale stilladserbeskytter såret mod infektion, absorberer såreksudater og hold såret fugtigt for at forhindre vævsnekrose [5]. Terapeutik kan også indlæses i biomateriale stilladser og fremme hurtigere heling i svære at hele sår [1]. Imidlertid kan biomateriale stilladser alene ikke effektivt orkestrere de mange signalkaskader, der forekommer i såret. Levering af stamceller er nogle gange foreslået som en løsning til at moderere de komplekse signalbegivenheder i såret [6]. 

Stamceller udskiller parakrine faktorer og kan differentiere til celler af flere vævslinjer [7]. Stamceller leveres typisk ind i såret gennem intradermale injektioner [6], topisk sprøjtning [8], eller som vævsmanipulerede transplantater [9]. I de senere år har anvendelsen af ​​vævsmanipulerede transplantater til kronisk sårheling gradvist vundet bredere accept på grund af deres evne til at hele sår hurtigt [9–11]. Apligraf® og Dermagraft® er to af de meget anvendte Food and Drug Administration (FDA)-godkendte biokonstruerede konstruktioner til kronisk sårbehandling [12,13]. Genereringen af ​​disse transplantater kræver imidlertid langvarig cellekultur for at producere høje celleantal [14]. Ved brug af stamceller kan langvarig dyrkning øge cellulær alderdom og mindske stamcellernes stamceller [15,16]. Derfor er opretholdelse af stamcellerne centralt for at opnå den optimale terapeutiske respons. Terapeutisk genlevering til stamcellerne ved hjælp af ikke-virale vektorer er en potentiel strategi til at forbedre stamcellernes funktionalitet [17]. Traditionelt transficeres cellerne i 2D-kulturer og transplanteres senere in vivo [18]. Men platforme såsom de genaktiverede stilladser, bestående af biomateriale stilladser funktionaliserede med nanopartikler, der bærer det terapeutiske transgen [19], at vores gruppe har været banebrydende for at tilbyde en alternativ løsning til transficering af cellerne i et 3-D-miljø. Denne undersøgelse fokuserede på at udvikle en genaktiveret version af 3D collagen-chondroitin sulfat (coll-CS) stilladset, der har et enormt klinisk translationspotentiale, da dets sammensætning ligner sammensætningen af ​​Integras Dermal Regeneration Template (DRT), en klinisk godkendt stillads til kronisk sårheling [20]. Vi bruger primært en kationisk polymer kaldet polyethylenimin (PEI) til at kondensere DNA-plasmider, der koder for vækstfaktorgener såsom den stromal-afledte faktor-1 alfa og nervevækstfaktor og samle dem til ladede nanopartikler [21–23]. Disse ladede nanopartikler lægges derefter i blød i vores coll-CS-stillads for at generere de genaktiverede stilladser. Vores tidligere undersøgelser har også vist, at det PEI-baserede genaktiverede stillads kan forårsage forbigående overekspression af det terapeutiske transgen i en række sårhelende celler og fremme deres regenerative evner [21,24,25]. Traditionelt blev det genaktiverede stillads udviklet til at målrette værtsceller og fremme lokal reparation [26]. Nye beviser indikerer imidlertid, at celleladede genaktiverede stilladser har overlegen styrke til at regenerere komplekse vævsstrukturer end genaktiverede stilladser alene [27]. 

Cellulær overflod er et af de afgørende krav til generering af vævsmanipulerede transplantater [28]. Fedtvævet er en rig kilde, der kan forsyne et stort antal stamceller. Fedtvævet indeholder så mange som 500 gange stamcellerne for den samme masse af knoglemarv, en traditionel vævskilde til stamcelleekstraktion [29]. Desuden kan stamcellerne ekstraheres fra fedtvævet ved hjælp af en minimalt invasiv fedtsugning.29]. Vores nylige undersøgelse viste, at humane fedtafledte stamceller (ADSC'er) viser fremragende biokompatibilitet med coll-CS-stilladset. Brug af et pro-angiogent genaktiveret stillads forbedrede ADSC'ernes regenerative respons yderligere [30]. ADSC'erne har dog en tendens til at miste deres stamness ved udvidelse [31]. Tidligere fandt vi, at et anti-aging protein -Klotho kunne markant forbedre spredningen af ​​sunde og diabetiske humane ADSC'er [32]. De fleste undersøgelser bruger generelt den primære variant -Klotho [33–35] og har vist, at proteinet kan øge levetiden for ADSC'er ved at aktivere telomerase transkriptionelle aktivitet [33]. - Klotho-overudtrykkende MSC'er har også vist sig at udøve stærke anti-fibrotiske virkninger ved nyreskade gennem inhibering af Wnt/ -catenin signalering [36]. Men rollen som -Klotho i stamceller forbliver relativt uudforsket.

Udover forskellen i forskningsfokus mellem de - og - Klotho, anti-agingKlotho-proteiner er endnu ikke fuldt ud inkorporeret i vævsmanipuleringsstrategiernetil sårheling. Derfor søgte vi i denne undersøgelse at studere den funktionelle effekt af en -Klotho genaktiveret stillads på humane ADSC'er til sårhelingsapplikationer. Viundersøgte først transkriptionsaktiviteterne af de klassiske pluripotensfaktorer (okt-4,Nanog og Sox-2), proliferationsmarkør (Ki-67) og sårhelingsregulatorer (TGF- 3 og TGF- 1) i ADSC'erne. Vi vurderede derefter bioaktiviteten af ​​de konditionerede mediergenereret af det ADSCs-ladede genaktiverede stillads for at evaluere dets parakrine potentiale.I sidste ende undersøgte vi regenereringen af ​​basalmembranen (fibronectin, laminin,og kollagen IV) og ar-associerede proteiner ( -SMA og elastin) i ADSCs-ladedegenaktiveret stillads for at evaluere kontrolleret vævsmodning.

2. Resultater

2.1. -Klotho genaktiveret stillads forbedrer forbigående menneskelige ADSC'ers stamme og pro-reparative gener

Genekspressionsanalyse viste først, at ADSC'erne på det genaktiverede stillads overudtrykte -Klotho-gen over 172-fold (p < 0.01) than the gene-free scaffold group on day 3 (Figure 1EN). Dette fund bekræftede ADSC'ernes effektive interaktion med det genaktiverede stillads. Analyse af spredningsmarkøren Ki-67 bekræftede yderligere, at ADSC'erne på det genaktiverede stillads også opretholdt en robust proliferationskapacitet over 14 dage (figur1EN). Efter at have bekræftet overekspressionen af ​​anti-aging -Klotho-genet, vurderede vi derefter stamcellernes foryngelse gennem aktivering af "pluripotens"-faktorer i ADSC'erne. Samlet set bemærkede vi en forbigående regulering af alle tre transkriptionsfaktorer over de 14 dage (figur1B). ADSC'erne viste dog kun en signifikant stigning i ekspressionen af ​​Oct-4-genet, som blev opretholdt indtil dag 14. Specifikt viste ADSC'erne en 2.5--fold (p < 0.05) increase in the expression of the Oct-4 gene on day 3 before subsiding to 1.6-fold (p < 0.05) on day 14 relative to the gene-free scaffold group. The next set of genes we investigated were the transforming growth factors beta 1 and 3, which are crucial for regulating scarless wound healing (Figure 1C). Niveauerne af den pro-fibrotiske TGF- 1 gen i -Klotho-overudtrykkende ADSC'er viste sig at være på niveau med den for den genfrie stilladsgruppe over de 14 dage. Men niveauerne af anti-fibrotisk TGF- 3 var signifikant (3.6-fold,p < 0.05) elevated during the early days (day 3) and, as anticipated, subsided by about 0.4-fold by day 14, showing a controlled expression of the regulatory gene. 

2.2. -Klotho genaktiveret stillads

Forbedrer den parakrine styrke af menneskelige ADSC'er2.2.1. Pro-angiogen bioaktivitet Bioaktivitetstesten af ​​CM genereret af ADSC'er-ladet genaktiveret stillads viste først, at den midlertidigt kunne kontrollere den metaboliske aktivitet i HUVEC'er. Dag 3 CM øgede signifikant den metaboliske aktivitet i HUVEC'er, mens brugen af ​​ældre CM fra dag 14 signifikant reducerede HUVEC's metaboliske aktivitet (figur2EN). Efter at have observeret dette, testede vi derefter den pro-angiogene virkning af CM fra dag 3 og 14 på HUVEC'erne udsået på Matrigel. Som forventet var dag 3 CM fra den genaktiverede stilladsgruppe signifikant (p < 0.05) enhanced HUVEC tubule formation capacity and their branching (Figure 2B). Der forekom imidlertid ingen yderligere stigning i den angiogene aktivitet med dag 14 CM sammenlignet med dag 3 CM. Også dagen 14 CM fra begge grupper udviste lignende pro-angiogen effektivitet (figur2C). Samlet set indikerer vores fund, at det genaktiverede stillads forbigående fremskynder ADSC'ers pro-angiogene respons.

pro-fibrotisk TGF- 1. ** og * angiverp < 0.01 and p < 0.05 respectively. Data represent mean ± standardafvigelse (n = 3).

Figur 2. Pro-angiogen parakrin bioaktivitet af det ADSCs-ladede genaktiverede scaffold CM. (A) CM produceret af det ADSCs-ladede genaktiverede stillads i løbet af de 14 dage viste en evne til midlertidigt at kontrollere HUVECs metaboliske aktivitet. (B) Dag 3 CM fra den genaktiverede stilladsgruppe forbedrede signifikant dannelsen af ​​endoteltubuli og dens forgrening sammenlignet med den for den genfrie stilladsgruppe. (C) Tubulidannelse og forgrening af endotelceller 6 timer efter eksponering for CM fra ADSC'erne seedet genaktiveret og genfrit stillads, * angiver p < 0.05. Data repræsenterer middelværdi! standardafvigelse (n=3)

2.2.2. Dermal Fibroblast Healing og Modning

Et af resultaterne fra angiogeneseundersøgelsen er, at når det ADSCs-ladede genaktiverede stillads modnes, fremmer det ikke længere angiogenese. På dag 14 svarede deres angiogene styrke desuden til den for den genfrie stilladsgruppe (figur 2B, C) Derfor undersøgte vi indflydelsen af ​​alderen dag 14 CM på lukning af dermal fibroblastsår. I lighed med resultatet af angiogeneseundersøgelsen viste begge grupper lignende niveauer af fibroblastsårlukning med dag 14 CM. Specifikt helede begge grupper såret med cirka 40 procent på 12 timer (figur 3A). Dette fund afslørede, at den genaktiverede stilladsgruppe under modning understøtter, men fremmer ikke lukning af dermal fibroblastsår.

Ikke desto mindre, da fibroblasterne blev stimuleret med gammel CM, undersøgte vi, om indflydelsen af ​​ekspressionen af ​​matrixproteiner involveret i sårmodning. Som forventet udtrykte dermale fibroblaster stimuleret med CM fra den genfrie stilladsgruppe i rigelige mængder det pro-fibrotiske kollagen I-protein (figur 3B). Tværtimod viste fibroblaster stimuleret med CM fra den genaktiverede scaffold-gruppe 50 procent lavere ekspression (p < 0,05) af kollagen I-proteinet. I mellemtiden manglede begge grupper ekspressionen af ​​anti-fibrotisk kollagen, og der blev ikke observeret nogen forskelle mellem de to grupper. Tilsammen indebærer det, at det genaktiverede stillads forbedrer ADSCswound-modulerende respons under modning.

Figur 3. Parakrin indflydelse på dermal heling og modning. (A) Alder dag 14 CM fra begge grupper udøvede lignende niveauer af sårlukningsaktivitet i humane voksne dermale fibroblaster med ca. 40 procent på 12 timer.(B) CM fra det genaktiverede stillads reducerede udtrykket signifikant. af pro-fibrotisk kollagen i fibroblasterne. " angiver p < 0,05 Data repræsenterer gennemsnitlig=standardafvigelse (n=3). I figur 3B står GAS og GFS for henholdsvis genaktiveret stillads og genfrit stillads

2.3. B-Klotho genaktiveret stillads forbedrer kældermembranregenerering med forbedret anti-fibrotisk respons i humane ADSC'er

Efter at have observeret det genaktiverede stillads's kontrollerede stimulering af ADSC'ers funktionalitet, undersøgte vi i sidste ende ADSC'ernes reaktion mod regenerering af dermale matricer og proteiner. Det genaktiverede stillads styrkede kraftigt regenereringen af ​​ADSCs basalmembran. Specifikt fremmede det genaktiverede stillads signifikant aflejringen af ​​basalmembrankomponenter laminin og kollagen IVFigur 4A). Efter den semikvantitative analyse bemærkede vi også, at matrixafsætningen fulgte en tendens i forhold til den genfrie stilladsgruppe. Tendensen som observeret wasfibronectin (1.0-fold) < laminin (2.1-fold, p < {{10}}.05) < kollagen IV (8.8-fold, p < 0,01). Når først evnen til at regenerere basalmembranen var bestemt, vurderede vi ekspressionen af ​​proteiner, der var afgørende for overlegen kvalitativ heling, såsom reduceret ardannelse. ADSC'erne på det genaktiverede stillads viste en signifikant (p < 0,05) reduceret ekspression af det ar-associerede kontraktile protein a-SMA. a-SMA-ekspressionen i ADSC'erne var lavere med 50 procent i forhold til den genfrie stilladsgruppe (figur 4B). Til sidst efter at have observeret den reducerede a-SMA-ekspression, vurderede vi ekspressionen af ​​det elastiske matrixprotein elastin. ADSC'erne på det genaktiverede stillads viste en relativt overlegen kvalitativ elastinekspression gennem aflejring af et modent fibrøst netværk af elastin sammenlignet med ADSC'erne på det genfrie stillads (figur 4B).

Figur 4. Deponering af pro-sårhelende matrixproteiner af ADSC'erne i det genaktiverede stillads på dag 14. (A) ADSC'erne i det genaktiverede stillads viste signifikant regen. drift af basalmembranen sammenlignet med ADSC'erne i det genfrie stillads. ADSC'erne deponerede overvejende et relativt modent netværk af kollagen IV-proteiner, efterfulgt af laminin og fibronectin.(B) ADSC'erne i det genaktiverede stillads udtrykte også 2- gange lavere af SMA-proteinet sammenlignet med ADSC'erne i genet -gratis stillads. I forbindelse med kældermem. brane-regenerering afsatte ADSC'erne i det genaktiverede stillads en kvalitativt bedre elastisk matrix. Alle billederne blev optaget gennem 20x objektiv ved hjælp af et IX73 Olympus-mikroskop*, og * angiver henholdsvis p < 0.01 og p < 0,05. Målestok 50um. Data repræsenterer gennemsnitlig standardafvigelse (n=3).-SMA og fibronectin var dobbeltimmunfarvet.

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950