Anti-aldringseffekter af Leontopodium Alpinum (Edelweiss) calluskulturekstrakt gennem transkriptomprofilering, del 3

Klik venligstoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

3.4. In vitro-evaluering af LACCE-ekstrakt forbundet med den fugtgivende effekt

Vi undersøgte den fugtgivende effekt af LACCE på HaCaT-celler ved hjælp af ekspressionen af ​​Aquaporin 3 (AQP3), som koder for vand og glyceroltransporterende protein udtrykt i hudceller, ved real-time RT-PCR (Figur 3C). Sammenlignet med den negative kontrol blev AQP3-genet signifikant opreguleret ved tilsætning af LACCE-ekstrakten.cistanche tubulosa fordele og bivirkningerInteressant nok, efterhånden som koncentrationen af ​​LACCE-ekstrakten blev øget, steg ekspressionen af ​​AQP3 gradvist fra 3,19 (0,1 procent LACCE) til 4,5 (1 procent LACCE).

Klik venligst her for at vide mere

3.5. In vitro evaluering af LACCE-ekstrakt som et anti-rynkemiddel

Vi testede anti-rynkeeffekten af ​​LACCE ved hjælp af et markørgen, der koder for matrix metalloproteinase-2(MMP-2), som fremmer cellevækst, ved real-time RT-PCR (Figur 3D). UVB-bestråling øgede udtrykket af MMP-2 signifikant sammenlignet med den negative kontrol uden nogen UVB-bestråling (fold ændring 0.67 med værdi mindre end 0.05). Udtrykket af MMP-2 blev nedreguleret ved tilsætning af LACCE mod UVB-bestråling. Generelt faldt ekspressionen af ​​MMP-2 gradvist, efterhånden som koncentrationen af ​​LACCE blev øget. Ekspressionen af ​​MMP-2 under normale forhold uden nogen UVB-bestråling var sammenlignelig med den i 0,5 procent LACCE med UVB-bestråling.

3.6.Klinisk evaluering af LACCE på ansigtsløftning og forbedring af periorbitale rynker, hudelasticitet, dermal tæthed og hudtykkelse

For at undersøge effekten af ​​LACCE in vivo udførte vi en klinisk evaluering af LACCE forbundet med ansigtsløftning og forbedring af periorbitale rynker, hudens elasticitet, dermal tæthed og hudtykkelse. Til dette deltog 21 kvindelige frivillige, som blev yderligere opdelt i 12 i 40'erne og ni i 50'erne, i den kliniske evaluering over fire uger.

Cistanche kan anti-aging

Først undersøgte vi effekten af ​​LACCEon periorbitale rynker ved hjælp af PRIMOS højopløsningssystemet. To forskellige ruhedsparametre, ruhedsgennemsnit (Ra) (Figur 4A) og gennemsnitlig kvadratisk ruhed (Rq) (Figur 4B), blev analyseret. Fire uger efter behandling med LACCE og placebo faldt Ra- og Rq-værdierne i begge prøver.cistanche tubulosa ekstrakt,Imidlertid var faldhastigheden for Ra- og Rq-værdierne meget højere i den LACCE-behandlede prøve end i den placebobehandlede prøve (tabel 2). For eksempel var faldraten for Ra-værdien 3,654 procent og 6,118 procent efter henholdsvis to og fire uger med statistisk signifikans (p.<0.05). similarly,="" the="" decrease="" rate="" for="" the="" rq="" value="" was="" 3.583%and="" 6.189%="" at="" two="" and="" four="" weeks,="" respectively,="" with="" statistical="" significance=""><0.05). moreover,="" the="" ratio="" of="" volunteers="" who="" displayed="" a="" reduction="" in="" the="" roughness="" parameters="" for="" the="" lacce-treated="" sample="" was="" much="" higher="" than="" that="" for="" the="" placebo-treated="" sample.="" for="" example,="" at="" four="" weeks,="" the="" ratios="" of="" volunteers="" showing="" a="" decrease="" in="" ra="" and="" rq="" values="" were="" 90.476%="" in="" the="" lacce-treated="" sample="" and="" 57.142%="" in="" the="" placebo-treated="">

Figur 4. In vivo kliniske test af LACCE til ansigtsløftning og forbedring af periorbitale rynker, hudens elasticitet, dermal tæthed og hudtykkelse. Ra (A) og Rq(B) værdier blev målt af PRIMOs højopløsningssystem på tre forskellige tidspunkter for at observere den periorbitale rynkeeffekt af LACCE (1 procent). Værdierne for bruttoelasticitet (R2)(C), nettoelasticitet(R5)(D) og biologisk elasticitet (R7)(E) blev målt for at observere hudens elasticitet med LACCE. Måling af dermal tæthed (F) og hudtykkelse (G). R-måling ved mundvigen (H).Før/efter:sandsynlighed p (gentagne målinger ANOVA, signifikant:*p<><><0.001).lacce lacebo="" b:="" probability="" p(repeated="" measures="" anova,="" significant∶="" 十="" p=""><>

Vi undersøgte effekten af ​​LACCE på kindhudens elasticitet ved hjælp af Cutometer. Tre forskellige parametre, bruttoelasticitet (R2), nettoelasticitet (R5) og biologisk elasticitet (R2)(R7), blev målt (Figur 4C-E). R2-, R5- og R7-værdierne for både LACCE- og placebo-behandlede tilstande steg i løbet af de fire uger.anmeldelser af cistanche tubulosa,For eksempel steg R2-værdien for den LACCE-behandlede prøve fra 0.728 til 0.752, mens R2-værdien for den placebobehandlede prøve steg fra 0.74{ {10}} til 0,752 (figur 4C). Desuden var stigningshastigheden i den LACCE-behandlede prøve meget højere end den i den placebobehandlede prøve (tabel 3). For eksempel var stigningsraterne i den LACCE-behandlede prøve 3.296(R2),5.816(R5) og 6.756 (R7), mens stigningsraterne i den placebobehandlede prøve var 1.621(R2),2.895(R5), og 3.378(R7) efter fire uger. Der var dog ingen forskel i forholdet mellem frivillige, der viste en stigning i hudens elasticitet mellem de to prøver.

Vi undersøgte effekten af ​​LACCE på dermal tæthed og hudtykkelse ved hjælp af Dermascan-C. Begge prøver viste en stigning i dermal tæthed og hudtykkelse fire uger efter behandling (figur 4F,G). For eksempel steg huddensiteten i den LACCE-behandlede prøve fra 26,708 til 28,168, hvorimod den for den placebo-behandlede prøve steg fra 26.936 til 28.168 (figur 4F). Stigningsraten for dermal tæthed var meget højere i LACCE-prøven (5,466 procent) end i den placebobehandlede prøve (3,118 procent) fire uger efter behandling (tabel 4). Igen var stigningsraten for hudtykkelse meget højere i LACCE-prøven (10,192 procent) end i den placebobehandlede prøve (4,829 procent) fire uger efter behandlingen. Interessant nok viste mange frivillige en stærk stigning i dermal tæthed (90,476 procent) og hudtykkelse (100 procent) efter fire ugers LACCE-behandling.

Vi undersøgte effekten af ​​LACCE på ansigtsløft i mundvigen ved hjælp af Moireé-analyse. Både de LACCE- og placebo-behandlede prøver viste en reduktion i ansigtsløftning (figur 4H); dog var faldet i ansigtsløft meget højere i LACCE-prøven (2,541 procent) end i placeboprøven (0.437 procent) efter fire ugers behandling. Forholdet mellem frivillige, der viste et fald i ansigtsløftning, var højere med LACCE (85,714 procent) end med placebo (57,142 procent).

3.7. Transkriptomanalyse af HaCaT-celler som respons på LACCE af RNA-Seq

Selvom LACCE-ekstraktet viste flere positive effekter som et kosmetisk middel, kan det være bemærkelsesværdigt at undersøge ændringen i det humane transkriptom som reaktion på LACCE. Til dette brugte vi 1 procent LACCE-ekstrakt i stedet for en lavere koncentration, fordi vi antog, at den mulige effekt af en lav koncentration af LACCE på keratinocytceller kan være lille. HaCaT-cellerne blev behandlet med 1 procent LACCE(behandling), hvorimod kontrol-HaCaT-cellerne blev behandlet med sterilt vand. Tre biologiske replikater blev anvendt til RNA-Seg. Antallet af sekvenslæsninger varierede fra 32.776.672 til 42.640,000(tabel 5). Mere end 90 procent af aflæsningerne i alle seks prøver blev kortlagt på de humane referencetranskripter indeholdende 159.998 transkriptioner (figur 5A). Til genekspressionsanalyse beregnede vi fragmenter pr. kilobase af transkript pr. million (FPKM) værdier. Som vist i figur 5B var FPKM-værdierne fra de tre behandlede prøver højere end dem fra de tre kontrolprøver. Efter fjernelse af overflødige transkripter blev kun 11.290 transkripter af 68.158 transkripter udtrykt i humane keratinocytceller (tabel S1).

Figur 5. Kortlægningsresultater, fordeling af fragmenter pr. kilobase af transkript pr. million (FPKM) værdier og visualisering af differentielt udtrykte gener. (A) En del af kortlagte (orange) og ikke-kortlagte (grå) læsninger på det humane referencetranskriptom. (B) Boksplot, der viser fordelingen af ​​FPKM-værdier i hvert bibliotek. (C) Vulkanplot, der viser fordelingen af ​​log1o(adj) og log2 (FC) for alle udtrykte gener. Pad og FC angiver henholdsvis justeret p-værdi og foldændring. Ti identificerede DEG'er er angivet med blå (nedregulerede gener, Ned), røde (opregulerede gener, Op) og grå (ikke signifikant udtrykte gener, NS) prikker.

Selvom vi brugte en højere koncentration af LACCE(1 procent ), som var 10 gange højere end den normale LACCE (0,1 procent), der blev brugt til kosmetik, ændrede transkriptomet af humane keratinocytceller sig ikke signifikant som respons på LACCE-behandling, som vist i vulkanplottet (tabel S1 og figur 5C).cistanche UKBaseret på den justerede p-værdi på mindre end 0.001 og log2 (fold ændring) på mere end 1, identificerede vi i alt 10 differentielt udtrykte gener (DEG'er) på LACCE (tabel 6). Af de 10 grader,

de fire nedregulerede gener var gener, der koder for en inhibitor af DNA-binding 3, ankyrin-gentagelsesdomæne 1, Rho-relateret BTB-domæne-holdig 3 og 18S ribosomalt N5. De seks regulerede gener var gener, der koder for kulsyreanhydrase 2, insulinlignende vækstfaktorbindende protein 3, keratin 15, BCL2-interagerende protein 3, fibroblastvækstfaktorbindende protein 1 og DNA-skade-inducerbart transCript4.

3.8. Funktionelle roller af opregulerede gener som svar på LACCE

Virkningen af ​​LACCE på keratinocyttranskriptomet var mildere end andre stressbehandlinger. For at opnå et funktionelt overblik over opregulerede og nedregulerede gener udførte vi en GO berigelsesanalyse. Vi opnåede imidlertid ingen signifikante resultater for berigede GO-termer på grund af et lille antal differentielt udtrykte gener. Derfor øgede vi antallet af differentielt udtrykte gener ved at anvende en justeret p-værdi på mindre end 0.05 og log2(fold ændring) på mere end 0,5. Som et resultat identificerede vi 22 opregulerede gener og 13 nedregulerede gener (tabel S1). GO-berigelsesanalysen identificerede 36 berigede GO-termer sammensat af 21 GO-termer (biologisk proces), to GO-termer (molekylær funktion) og 13 GO-termer (cellulær komponent) i opregulerede gener (tabel S2). I modsætning hertil blev kun 12 berigede GO-udtryk for den biologiske proces identificeret i 13 nedregulerede gener (tabel S2).

Ifølge den biologiske proces var generne involveret i keratinisering, forhorning, programmeret celledød, celleforbindelsesorganisation, den positive regulering af udviklingsprocessen og etableringen af ​​en hudbarriere stærkt opreguleret (figur 6A).cistanche wirkungFor den molekylære funktion var den strukturelle bestanddel af cytoskelettet og strukturel molekyleaktivitet stærkt udtrykt (tabel S2). I tilfælde af den cellulære komponent var gener i det mellemliggende filament, ekstracellulære exosom og keratinfilament højt udtrykt (figur 6B). Af 12 GO-termer for 13 nedregulerede gener blev gener relateret til responsen på zinkion, regulering af ossifikation og negativ regulering af den biologiske proces ofte nedreguleret.

Figur 6. Den hierarkiske struktur af identificerede berigede GO-termer for opregulerede humane gener som respons på LACCE. Styrede acykliske grafer (DAG'er) visualiserer den hierarkiske struktur af identificerede berigede GO-termer for opregulerede gener ved LACCE-behandling i henhold til biologisk proces (A) og cellulær komponent (B). Hvert GO-udtryk er angivet med forskellig boksfarve baseret på p-værdien. Detaljerede oplysninger om identificerede GO-udtryk kan findes i Tabel S2.

4. Diskussion

Kosmetik er klassisk defineret som ethvert tilberedt produkt, der kan påføres den menneskelige krop, inklusive ansigt, hud, hår, mund og øjne, for at ændre eller styrke den menneskelige krops udseende [21]. Derudover bruges kosmetik til at rense, give duft og give beskyttelse. De fleste kosmetik er sammensat af kemiske forbindelser, der kan stamme fra naturlige kilder eller syntetiske stoffer [22].

I denne undersøgelse undersøgte vi de mulige virkninger af LACCE som en naturlig forbindelse til kosmetik gennem forskellige assays in vitro og in vivo. Adskillige in vitro-assayresultater viste LACCE's stærke antioxidantaktivitet som respons på UVB-behandling. Interessant nok var effekten af ​​LACCEasan antioxidant korreleret med koncentrationen af ​​LACCE. Antioxidantaktiviteten af ​​LACCE (1 procent) var sammenlignelig med NAC eller meget højere end vitamin C. LACCE indeholder en højere mængde chlorogensyre, 3,5-dicaffeoylquinsyre, leontopodinsyre B og leontopodsyre A end normale edelweiss callus kulturer, som vist i en tidligere undersøgelse [4]. Især viste en tidligere undersøgelse, der identificerede to leontopodiske syrer fra edelweiss, den funktionelle rolle af LACCE som et antioxidantmiddel [23].

Ekspressionen af ​​to inflammatoriske gener blev undertrykt af LACCE-behandling, hvilket tyder på den mulige rolle af LACCE i anti-inflammatorisk aktivitet, som vist tidligere [7,24]. Interessant nok var der ingen signifikant forskel i den antiinflammatoriske effekt blandt forskellige LACCE-koncentrationer, hvilket indikerer, at 1 procent LACCE kan være tilstrækkeligt til anvendelse som et antiinflammatorisk middel i kosmetik. I modsætning hertil blev udtryk for AQP3 og MMP2, der kræves til henholdsvis fugtgivende og rynker, dramatisk ændret efter behandling med forskellige LACCE-koncentrationer.

En klinisk test er det vigtigste trin for at bruge planteekstrakt som en kosmetisk kilde. I denne undersøgelse undersøgte vi in ​​vivo-effekterne af LACCE med 21 frivillige. Anvendelsen af ​​LACCE på ansigt og hudvæv viste signifikante stigninger i fire forskellige faktorer (forbedringer i periorbitale rynker, hudens elasticitet, dermal tæthed og hudtykkelse) sammenlignet med placebo. Især den konstante brug af LACCE forbedrede ansigtet og hudens væv betydeligt. Selvom edelweissekstrakter er kendt som en kilde til kosmetik, er dette den første rapport, der viser den vellykkede anvendelse af LACCE som kosmetisk materiale.

For at evaluere planteekstrakter som en kosmetisk eller medicinsk kilde in vitro er undersøgelsen af ​​ekspressionen af ​​markørgener en populær eksperimentel tilgang. Anvendelsen af ​​kun udvalgte gener til genekspressionsanalyse har imidlertid flere begrænsninger. Den seneste hurtige udvikling af næste generations sekventering letter genekspressionsanalyse i hele genomet. I denne undersøgelse brugte vi RNA-Seq til at undersøge transkriptomomfattende ændringer i humane keratinocytceller som svar på LACCE. Vores resultater viste, at mindst 16,56 procent af humane gener blev udtrykt i keratinocytceller, hvilket indikerer den vævsspecifikke ekspression af humane gener. LACCE inducerede ekspressionen af ​​adskillige gener; dog var den globale ændring i det humane transkriptom af LACCE mild sammenlignet med andre stresstilstande. Dette resultat sikrer sikkerheden af ​​LACCE til anvendelse i humant væv.

berigelsesanalyse afslørede, at opregulerede gener, der koder for Keratin 5 (KRT5), KRT19, KRT6A, KRT15, ​​KRT14, KRT17 og junction plakoglobin (JUP) var involveret i keratinisering og cornification. Epidermale keratinocytter spiller en vigtig rolle som en barriere mod forskellige miljøfaktorer [25]. Specifikt udvikler terminaldifferentierede epidermale celler sig til døde keratinocytter ved programmeret celledød kaldet cornification, der danner en stærk epidermal barriere [26]. Efter celledød giver det forhornede hudlag mange fordele til ansigt og væv, herunder en stigning i elasticitet, stabilitet, fugtgivende og mekanisk modstand [25]. Af de identificerede KRT-gener er genet, der koder for Keratin15(KRT15), et medlem af keratingen-familien, kendt som en hårfollikelstamcellemarkør, der er stærkt udtrykt i hudvæv[27,28]. En nylig undersøgelse har antydet, at KRT15 fungerer i epitelregenerering mod stråling og sårreparation [29,30].

Ud over flere gener, der koder for KRT-proteiner, fungerer gener, der koder for DDIT4, BNIP3 og IGFBP3, i programmeret celledød. For eksempel er DNA-skade-inducerbar transcript4(DDIT4) stærkt udtrykt af forskellige belastninger og hæmmer pattedyrmålet for rapamycinkompleks 1(mTORC1)-vejen forbundet med behandling af cancer [31]. Tidligere undersøgelser har identificeret DDIT4-genet, som var stærkt udtrykt af dexamethason, som er et kemoterapeutisk middel, der inducerer autofagi i lymfocytter, hvilket tyder på dets mulige rolle i reguleringen af ​​cellevækst, -proliferation og overlevelse [32,33]. LACCE viste lignende virkninger som dexamethason som et antiinflammatorisk middel. Bcl-2/adenovirus E1B 19-kDa-interagerende protein (BNIP3) er medlem af en pro-apoptoseproteinfamilie, der regulerer cellulær proliferation[34] . Derudover er BNIP3 involveret i beskyttelsen af ​​keratinocytter mod UVB-induceret apoptose ved at opregulere dets genekspression [35]. Adskillige undersøgelser har vist, at ekspression af insulinlignende vækstfaktorbindende protein 3 (IGFBP-3) er relateret til cellulær senescens [36,37]. Tilføjelsen af ​​IGFBP-3 inducerer eller hæmmer apoptose afhængigt af celletyper [37]. For eksempel blev IGFBP-3 opreguleret i de humane papillomavirus-immortaliserede livmoderhalsceller, hvilket resulterede i en forbedring af IGF-1-induceret mitogenese [37]. En nylig undersøgelse har vist nedreguleringen af ​​IGFBP-3 i senescent og H,O2-inducerede gamle celler sammenlignet med unge celler, hvilket tyder på dets mulige rolle som en aldringsmarkør [36].

BNIP3, IGFBP3, stratifin (SFN), CA2, FGFBP1, KRT17 og JUP er involveret i den positive regulering af udviklingsprocessen. Af dem er kulsyreanhydraser allestedsnærværende enzymer til stede i prokaryoter og eukaryoter, herunder dyr og planter [38]. Hos mennesker katalyserer kulsyreanhydrase dannelsen af ​​kulsyre fra vand og kuldioxid (CO,), som er nødvendige for hjerne-, nyre- og knoglefysiologi [39]. En tidligere undersøgelse viste, at CA4 og CA9 blev opreguleret i en mus under sårets hypoksiske periode af RNA-Seq [40]. Derudover fremmede tilsætningen af ​​rekombinant CA9-enzym sårre-epitelisering [40]. Desuden afslørede en proteomundersøgelse også involveringen af ​​CA2-protein i aldring og neurodegeneration hos en mus [41]. Her viste vi, at LACCE fremmede regenereringen af ​​humane keratinocytceller ved at opregulere CA2-ekspression. Fibroblast vækstfaktor-bindende protein 1 (FGFBP1) er en ekstracellulært udskilt chaperon, der binder til FGF'er, og det modulerer FGF-signalering J42]. Adskillige undersøgelser har vist, at FGFBP1 i høj grad udtrykkes under angiogenese og spiller en vigtig rolle i hudkarcinogenese, inflammation og sårheling [42-44]. Desuden antyder den cellulære lokalisering af opregulerede gener i vesiklen, det ekstracellulære exosom, mellemfilamentet og keratinfilamentet, at disse proteiner er en primær komponent i cytoskelettet.

I nedregulerede gener er de fleste gener kendt for at blive induceret af forskellige belastninger. For eksempel induceres to gener, der koder for metallothionein 2a (MT2A) og metallothionein le (MT1E), under metalspændingsforhold, herunder zinkion, kobberion og cadmiumion og oxidativ stress, såsom UVB [45,46]. Desuden er en inhibitor af DNA-binding 3 (ID3), et medlem af helix-loop-helix-proteiner, et øjeblikkeligt-tidligt gen som reaktion på mitogene signaler og oxidativt stress [47]. Ankyrin repeat domæne 1 (ANKRD1), også kendt som cardiac ankyrin repeat protein (CARP), er en transkriptionel cofaktor, der opreguleres under sårheling og inducerer angiogenese [48]. Både ID3 og ANKRD1 er involveret i den negative regulering af den biologiske proces. ID3 fungerer som en transkriptionel regulator, der hæmmer stamcelledifferentiering og fremmer cellecyklusprogression [47]. Derudover viste en nylig undersøgelse, at tabet af ANKRD1-funktion hos mus resulterede i forsinket sårheling, hvilket tyder på dets rolle i sår- og vævsskader [49 ]. Desuden fungerer Rho-relateret BTB-domæne-indeholdende 3 (RHOBTB3) til at fremme den proteasomale nedbrydning af hypoxi-inducerbare faktorer (HIF'er), som er de vigtigste regulatorer af adaptive reaktioner på lavt iltindhold [50]. Derudover hæmmer interferon-induceret transmembranprotein 1(IFITM1) indtrængen af ​​mange vira i værtscellen [51]. På samme måde induceres genet, der koder for interferon alfa-inducerbart protein 6(IFI6) af interferon og regulerer apoptose og antiviral medfødt immunitet [52,53]. Nedreguleringen af ​​stress-responsive gener ved LACCE-behandling tyder på, at LACCE ikke forårsager stress i humane keratinocytceller.

5. Konklusioner

Her vurderede vi LACCE som et naturligt kosmetisk materiale gennem adskillige in vitro og in vivo assays, hvilket tyder på dets stærke virkninger på forbedring af ansigts- og hudvæv. Især afslørede RNA-Seg-baseret transkriptomanalyse den molekylære mekanisme i humane keratinocytceller som svar på LACCE. LACCE opregulerede genet involveret i keratinisering og cornification, hvilket gav en hudbarriere, som fremmes af gener, der kræves til programmeret celledød. Mange positive regulatorer af udviklingsprocessen blev opreguleret, mens forskellige stress-inducerede gener blev nedreguleret af LACCE-behandling. Tilsammen viste vores undersøgelse, at LACCE er et middel til anti-aging kosmetik eller kosmetik.

Denne artikel er uddraget fra Genes 2020, 11, 230; doi:10.3390/genes11020230 www.mdpi.com/journal/genes