Anti-aging effekt af urolithin A på bovine oocytter in vitro

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

Abstrakt:Oxidativt stress og mitokondriel dysfunktion er blevet forbundet med det aldersrelaterede fald i oocytkvalitet, og strategier til forebyggelse heraf er i øjeblikket undersøgt. Urolithin A (UA) er en naturlig metabolit med pro-apoptotisk og antioxidant virkning, der er i stand til at forhindre akkumulering af dysfunktionelle mitokondrier i forskellige ælde celler. UA er aldrig blevet testet i bovine oocytter. Vores mål var at studere effekten af UA på udviklingspotentialet af cumulus-oocyt-komplekser (COC'er) og granulosaceller (GC'er) ekspression af vigtige gener relateret til reproduktiv kompetence. Nuklear modningsprogression, mitokondrielt membranpotentiale (MMP) og udviklingskompetence af fysiologisk modne (22 timer) og in vitro-aldrede oocytter (30 timer IVM) opnået fra præpubertale og voksne kvinder, enten suppleret med UA eller ej, blev vurderet. Derudover blev mængden af mRNA fra flere gener (NFE2L2, NQO1 og mt-DN5) og antallet af mt-ND5 DNA-kopier kvantificeret i dyrkede GC'er fra præpubertale og voksne hunner, enten suppleret med UA eller ej. Vores undersøgelse bekræftede den skadelige effekt af ældning af oocytter på nuklear modningsprogression, MMP, udviklingskompetence og genekspressionsniveauer. UA-behandling under in vitro-modning forbedret (s<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

Klik venligst her for at vide mere

Nøgleord:oocyt; aldring; Urolithin A; assisterede reproduktionsteknologier

1. Introduktion

Nedgangen i kvindelig reproduktionsevne er en af de første fysiologiske funktioner, der er negativt påvirket af aldring og betragtes derfor som et voksende sundhedsproblem på verdensplan [1,2]. Ud over adskillige patologiske problemer tilskrives det aldersrelaterede fald i kvindelig fertilitet i høj grad et fald i ovariereserven af oocytter [1,3-5] forbundet med en tidsafhængig forringelse af deres kvalitet [2]. Denne forringelsesproces kan forekomme på grund af udsættelse af oocytter til et ældet æggestokkemikromiljø før ægløsning. Desuden udsættes den kvindelige kønscelle ofte for post-ovulatorisk aldring, når befrugtningsprocessen ikke finder sted inden for den bedste optimale spændvidde, og den ubefrugtede oocyt forbliver i æggelederen eller in vitropriren til insemination i længere perioder [6] oocytkvalitet er en kritisk faktor forbundet med svigt af assisteret reproduktionsteknologi (ART), da dens kvalitet er den vigtigste determinant for embryonets udviklingspotentiale efter befrugtning [7,8]. Asynkron ægløsning og ældede oocytter blev ofte rapporteret at forringe succesen med kunstig befrugtning og embryoproduktionsprogrammer hos hopper, kvæg og får, hvilket indebar vigtige økonomiske tab[1,9,10]. Derfor er det af primordial betydning at studere de mekanismer, der ligger til grund for oocyternes aldring, for at designe bedre terapeutiske tilgange til at redde fertilitet hos flere arter, herunder mennesker, og også som et værktøj til genetisk forbedring hos husdyr.cistanche wirkungDer skal lægges særlig vægt på at forbedre udviklingskapaciteten af oocytter fra præpubertale kvæg, som ofte bruges til at accelerere genetisk gevinst og forkorte generationsintervaller.

En af hovedårsagerne til nedsat udviklingskompetence hos ældre oocytter er stigningen i oxidativt stress, som inducerer mitokondriel dysfunktion, DNA-skader og spindeldannelsesfejl, hvilket påvirker oocytkvaliteten [1]. Det er veletableret, at øget produktion af frie radikaler er en årsag til cellulær aldring i flere kroniske sygdomme og også i reproduktionsbiologi, hvilket resulterer i dårlige fertilitetsresultater [12]. Ovariemikromiljøet, som omfatter oocytter og granulosaceller (GC'er), giver en antioxidantforsvarsmekanisme i stand til at regulere oxidative forhold og opretholde oxidant/antioxidantbalancen [13]. Men under ældningsprocessen svækkes effektiviteten af antioxidantforsvaret til at neutralisere reaktive oxygenarter (ROS), hvilket øger niveauet af oxidativ stress. Den nuklear faktor-E2--relaterede faktor2(Nrf2 eller NFE2L2), også kendt som Nrf2/Kelch-lignende ECH-associeret protein 1 (Keap1)-vej, er en dominerende reaktionskaskade aktiveret af oxidativt stress[14]. Denne vej er en cellulær forsvarsmekanisme, som celler har udviklet til at klare de skadelige virkninger af oxidativt stress. Under normale forhold reguleres Nrf2 negativt af Keap1, holdes i cytoplasmaet og holdes på lave niveauer. Når det udsættes for oxidanter, dissocieres Nrf2 fra Keapl, hvilket tillader dets translokation i kernen, hvor det binder til specifikke DNA-sekvenser. Disse sekvenser, kaldet antioxidantresponselementer (ARE), fører til transkriptionel aktivering af cytobeskyttende gener, såsom NAD(P)H:quinon-oxidoreduktase-1 (NQO1), hæmoxygenase-1 (HMOX1) og glutamat-cysteinligase katalytisk underenhed (GCLC)[15,16]. Tidligere undersøgelser har vist, at aktiveringen af Nrf2-Keapl-signalvejen reducerer oxidativ stressskade ved at hæve antioxidantniveauer i humane GC'er og museovarier[17,18]. Imidlertid forbliver dens rolle i den kvindelige gamet-aldringsproces uhåndgribelig, selvom det klart er fastslået, at mitokondrier er det vigtigste produktionssted for ROS under denne proces [9,10].

KSL02

Cistanche kan anti-aging

Omvendt er mitokondrier involveret i flere kritiske cellulære funktioner og er fundamentale for at imødekomme efterspørgslen efter energiproduktion, der kræves under oocytmodning og efterfølgende embryonal udvikling [19]. Kompetent mitokondriel aktivitet har været stærkt forbundet med højere indhold af mitokondrie-DNA (mt-DNA) og ATP-generering [20], højere mitokondriel membranpotentiale [21] og opretholdelse af mitokondriekvalitet og -kvantitet gennem mitofagi [22]. Desuden er mitokondriel aktivitet blevet foreslået at være direkte korreleret med embryones levedygtighed og bedre fertilitetsresultater [23]. Stigende beviser understøtter, at aldersrelaterede mitokondrieændringer fører til ældning af æggestokkene og efterfølgende reduceret embryolevedygtighed og implantationspotentiale. Disse ændringer inkluderer nedsat mt-DNA-kopiantal, nedsat ATP-generering [20], ændringer i mitokondriel genekspression [24,mt-DNA-skade [25] og reduceret mitokondrielt membranpotentiale [26].

KSL03

Mitokondrier-målrettede terapeutiske tilgange foranledigede en enorm interesse for adskillige patologier forbundet med aldring på grund af deres store potentiale til at forbedre mitokondriefunktionen [27]. Inden for denne ramme er Urolithin A (UA) - en naturlig metabolit opnået efter indtagelse af mad såsom granatæbler efterfulgt af dets omdannelse af tarmmikrobiotaen - vist sig at forhindre ophobning af dysfunktionelle mitokondrier med alderen, inducere mitofagi og også opretholde mitokondrie. biogenese og respirationskapacitet [28,29]. UA er blevet anvendt som et lovende terapeutisk lægemiddel til at forhindre nogle kræftformer, såsom kolorektal- og prostatacancer[30,31]. Derudover har UA også anti-inflammatoriske [32], anti-fedme [33], antioxidant [34] og anti-aging egenskaber [35].citrus bioflavonoiderEn nylig undersøgelse har fremhævet virkningerne af UA-tilskud til ældende menneskelige hudfibroblaster på aktiveringen af Nrf2-Keapl-vejen, hvilket øger deres antioxidantkapacitet. Denne aktivering af Nrf2-Keapl-vejen dæmper effektivt ROS-niveauet gennem opregulering af ekspressionen af Nrf2-nedstrøms ARE-responsgener (SOD, NQO1, GCLC og HMOX1), hvilket indikerer en lovende anti-aldringseffekt [ 35].

KSL04

Adskillige undersøgelser er blevet udført med det formål at forsinke æggestokkenes aldring, og dermed forbedre oocytkvalitet og fertilitetsresultater. På grund af bidraget fra oxidativ stress til æggestokkenes ældningsproces, såvel som mitokondriel dysfunktion, har tilskud med antioxidanter vist sig som en lovende terapi [36,37]. Det er dog ukendt, om Urolithin A-tilskud kan genoprette den skade, der opstår under æggestokkens aldring, hvilket bidrager til at forhindre infertilitetsproblemer. Derfor var formålet med denne undersøgelse:(1) at demonstrere, at aldring kunne ændre cumulus-oocytkomplekser(COC) udviklingspotentiale og GC'ers ekspression af vigtige gener involveret i Nrf2-signalvejen;(2) at bestemme, om UA kan redde kvindelig fertilitet, der viser en anti-aldringseffekt i gamle COC'er og GC'er; og (3) at evaluere UA-effekt på ekspressionsniveauet af gener involveret i Nrf2-signalvejen såvel som på oocytkvalitet.

2. Materialer og metoder

2.1. Eksperimentelt design

Denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care Committee of the National Veterinary Authority (N-grad 08965DGAV) i overensstemmelse med EU's retningslinjer (nr.86/609/EEC). For at undersøge effekten af aldring på ændringen af oocytkvaliteten og den potentielle anti-ældningseffekt af UA, en model, der anvender COC'er indsamlet fra præpubertale og voksne køer underkastet in vitro aldring (30 timers modning) eller til den fysiologiske modning (22 h) der blev anvendt processer.

2.1.1.Tidligere assay-dosis-respons undersøgelse

Et tidligere assay for at bestemme koncentrationen af UA, der skulle bruges under modningsprocessen for bovine COC'er, blev udført baseret på en dosis-respons undersøgelse i fire sessioner. Da UA aldrig er blevet testet i bovine oocytter, blev tidligere doser med succes anvendt til forebyggelse og afbødning af nogle kræftformer og for at demonstrere anti-aldringseffekten af UA i forskellige cellelinjer [28,39]. COC'er opnået fra præpubertale og modne voksne køer (n=978) blev udvalgt og derefter tilfældigt opdelt i fem grupper for at teste forskellige doser af UA: kontrol, 1,10,25 og 50 uM under fysiologisk in vitro-modning. Efter modningsperioden blev nogle oocytter (n=154) farvet for at bestemme den kromosomale konfiguration og modningsstadier. De resterende modne oocytter blev underkastet in vitro-insemination med frossen/optøet sæd. Formodede zygoter blev dyrket, og spaltnings- og blastocysthastigheder blev bestemt på henholdsvis dag 2 og dag 7 af dyrkning. Baseret på de opnåede resultater, nemlig fraværet af skadelige effekter og fremme af modning og blastocystudvikling, blev koncentrationen på 1 uM UA valgt.

2.1.2.Eksperiment1

I dette eksperiment, udført i seks sessioner, både p-piller fra præpubertal (gennemsnitsalder=9 måneder,n=660) og voksen (gennemsnitsalder =39måneder,n=674) køer blev indsamlet for at vurdere oocytkvaliteten og udviklingspotentialet af gamle og fysiologisk modne oocytter samt UA-effekt for at redde kvindelig fertilitet. P-piller blev tilfældigt opdelt i 8 grupper: (1) kontrol præpubertale gruppe, p-piller fra præpubertale kalve modnet i 22 timer (n=148);(2)UA præpubertale gruppe, p-piller fra præpubertale kalve modnet i medium suppleret med 1 uM UA i 22 timer (n=155);(3)kontrol i alderen 30 timer præpubertal gruppe, COC'er fra præpubertale kalve i alderen gennem 30 timer af in oitro modning (n=149);(4)UA i alderen 30 timer præpubertal gruppe, p-piller fra præpubertale kalve lagret in vitro i 30 timer i modningsmedium suppleret med 1 uM UA(n=144);(5) kontrol voksengruppe, p-piller fra voksne køer modnet i 22 timer (n=155 );(6) UA voksen gruppe, COC'er fra voksne køer modnet i medium suppleret med 1 uM UA i 22 timer (n=129);(7) kontrol i alderen 30 timer voksen gruppe, COC'er fra voksne køer i alderen til og med 30 timers in oitro modning (n=148); og (8) UA i alderen 30 timer voksen gruppe, COC'er fra voksne køer ældet in oitro i 30 timer i modningsmedium suppleret med 1 uM UA(n=138).cynomorium fordeleEfter de respektive in vitro-modningsperioder blev oocytter insemineret med optøet kapaciteret tyresæd. Efterfølgende blev embryonal udvikling vurderet, hvor både hastigheden af spaltede og producerede embryoner blev evalueret, såvel som deres kvalitet.

Derudover blev COC'er fra hver gruppe i dette eksperiment hentet for at vurdere deres nukleare modningsstadie (kontrol præpubertal gruppe, n=7; UA præpubertal gruppe, n =7; kontrol i alderen 30 timer præpubertal gruppe, n{ {3}}; UA i alderen 30 timer præpubertal gruppe, n=6; kontrol voksengruppe,n=16;UA voksen gruppe,n=21;kontrol i alderen 30 timer voksen gruppe, n{ {9}}; UA i alderen 30 timer voksen gruppe,n=18). Det mitokondrielle membranpotentiale (MP) af COC'er blev også evalueret (kontrol præpubertal gruppe, n=10; UA præpubertal gruppe, n{ {13}};kontrol i alderen 30 timer præpubertal gruppe,n=9;UA i alderen 30 timer præpubertal gruppe,n=9;kontrol voksen gruppe, n=15; UA voksen gruppe, n{ {19}}; kontrol i alderen 30 timer voksen gruppe,n=10;UA i alderen 30 timer voksen gruppe,n=14).

2.1.3.Eksperiment2

Da GC'erne spiller en væsentlig rolle i follikulær vækst og oocytudvikling, blev et andet eksperiment udført i fem sessioner for yderligere at studere effekten af alder og UA på ekspressionen af NFE2L2, NQO1 og mt-ND5. Antallet af kopier af mt-ND5-genet blev også evalueret. GC'er blev opnået efter centrifugering af follikulærvæsken udsuget fra ovarier fra præpubertale (gennemsnitsalder=10 måneder) og voksne køer (gennemsnitsalder =62måneder). Disse celler blev dyrket under følgende betingelser: (1) præpubertal kontrol, dyrkning af GC'er fra præpubertale kalve; (2) præpubertale UA, dyrkning af GC'er fra præpubertale kalve suppleret med 1 uM UA; (3) voksenkontrol, dyrkning af GC'er fra voksne køer; og (4) voksen UA, kulturen af GC'er fra voksne køer suppleret med 1 uM UA. Efter GC's sammenløb på den 5. dyrkningsdag blev de lynfrosset i flydende nitrogen, og senere blev DNA'et og RNA'et ekstraheret, hvilket muliggjorde den efterfølgende kvantificering af NFE2L2-, NQO1- og mt-ND5-mRNA-transkripter og også mt-ND5-kopinummer.

2.2. Oocytopsamling og in vitro modning

Æggestokke fra voksne og præpubertale køer (tidligere assay, n {{0}} og eks. 1, n=1334) blev indsamlet på et lokalt slagteri og holdt i 35-37 grad i et fosfatpufret saltvand (PBS) suppleret med 0.15 procent bovint serumalbumin (w/v, BSA) suppleret med 0,05 mg ml-l kanamycin. På laboratoriet blev ovariefollikler med en diameter på 2-8 mm aspireret med en 19-målernål. Kun COC'er med mindst tre lag kompakte cumulusceller og en homogen ooplasme blev vasket og udvalgt til modning i henhold til det eksperimentelle design.ørkenhyacintModning blev udført i en inkubator ved 38,8 grader ,5 procent CO2 i fugtet luft i 22 eller 30 timer i et modningsmedium bestående af vævskulturmedium 199 (TCM) med 10 procent føtalt bovint serum, 0,2 mM natrium pyruvat, 10 ng mL-l epidermal vækstfaktor og 10 μL mL-l gentamicin【40】.

2.3. Granulosa-celleindsamling og -kultur

Granulosaceller blev opnået fra den genvundne follikelvæske efter centrifugering i 1 0 min ved 200x g[41]. Pelleten blev suspenderet i 1 ml dyrkningsmedium (TCM199 plus 10 procent serum) for at udføre endnu en centrifugering i 5 min. Den nye pellet blev resuspenderet i 1 ml dyrkningsmedium enten suppleret med 1 uM UA eller ej i henhold til det eksperimentelle design og homogeniseret med en sprøjte fastgjort til en 19G-nål, mindst 30 gange for at frigøre cellerne. Efter evaluering af GC-levedygtighed (trypanblåt farvestof, 0,4 % w/v) blev celler podet i en koncentration på 2×105 levedygtige celler mL-1 og dyrket i fem dage ved 38,8 grader ,5 % CO2 i en fugtet atmosfære indtil sammenløb. Hver 48. time blev dyrkningsmediet udtømt og genopfrisket med et nyt. Til DNA- og RNA-ekstraktion blev GC'er opsamlet og vasket ved centrifugering ved 200 x g i 10 minutter. Cellepelleter blev resuspenderet i 1 ml PBS, øjeblikkeligt lynfrosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -80 grad.

2.4. Oocytkernemodning

Nukleare modningsstadier blev vurderet efter 22 timers eller 30 timers in vitro-modning.flavonoid ekstraktionsmetode pdfDenuderede oocytter blev fikseret i en eddikesyre/ethanol (1:3, v/v) opløsning og holdt ved 4 grader i 48 timer. Derefter blev oocytter farvet med 1 procent aceto-lacmoid-opløsning, monteret i et Neubauer-kammer og observeret under et fasekontrastmikroskop (Olympus BX41). Oocytter blev klassificeret som følger: Germinal vesikel (GV), kondenserende kromosomer I (CCI), kondenserende kromosomer II (CCII), Diakinesis, Anafase-I/Telofase-I (AI/TI) og MII (Metafase-II) . Kun oocytter med synlig kromatinfarvning blev taget i betragtning [42].

2.5. Vurdering af mitokondriel membranpotentiale

For at måle mitokondriemembranpotentialet (MP), en indikator for mitokondriel aktivitet, blev mitokondrier farvet med 5, 6, 6'-tetrachlor-1, 1', 3, 3'tetraethylbenzimidazolcarbocyanin iodid (JC-1 , Invitrogen, Waltham, MA, USA). Denuderede oocytter blev inkuberet med 5 ug mL-l JC-1 [37] i et modningsmedium i 30 minutter ved 38,8 grader og 5 procent CO2 i befugtet luft i mørke. Oocytter blev vasket to gange i PBS og straks overført til et forvarmet objektglas og observeret under et fluorescensmikroskop (Olympus BX51) under anvendelse af det blå fluorescensfilter (BP 470-490 objektiv UPlanFI 20×/0,50). Mitokondrielt membranpotentiale blev derefter beregnet som forholdet mellem den målte rød/grønne fluorescens ved hjælp af Image]-softwaren (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). 2.6. In vitro fertilisering og embryokultur

In vitro-befrugtning blev udført med frosset-optøet sæd fra en holstein-frisisk tyr, tidligere underkastet kapacitering ved hjælp af Percoll-gradientmetoden (45 og 90), i en koncentration på 2 x 10 grader spermatozoer mL-4.COC'er og sperm blev co-inkuberet i 20 timer ved 38,8 grader og 5 procent CO2 i fugtet luft. Formodede zygoter blev derefter overført til dråber af syntetisk oviductal fluid (SOF) medium suppleret med BME og MEM aminosyrer, glutamin, glutathion og BSA [40]. Efter 48 timer efter inseminationen blev spaltningshastigheden (spaltede embryoner pr. samlede inseminerede oocytter) passeret, og spaltede embryoner blev opretholdt i SOF suppleret med BSA og 10 procent af føtalt bovint serum (FBS). Embryoer blev dyrket i 12 dage [41,43] for at vurdere blastocystudviklingshastigheden (ved dag 7, 9 og 12; D7 embryoner pr. spaltede embryoner) og udklækkede embryoner (udklækkede embryoner pr. D7 embryoner) og deres kvalitet [43]. Dag 7 embryoner blev klassificeret som grad 1 (god kvalitet), 2 (rimelig kvalitet) og grad 3 (dårlig kvalitet)[4].

2.7.DNA- og RNA-ekstraktion og kvantificering

Total DNA og RNA blev isoleret fra GC'er ved hjælp af High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Schweiz) og PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), ifølge producentens instruktioner. Disse protokoller omfattede brugen af spin-søjler, der blev brugt til at isolere total DNA og RNA og DNase af høj kvalitet som en behandling for at fjerne genomisk DNA fra RNA[40]. Efter ekstraktion blev prøverne opbevaret ved -80 grad. Koncentrationen og kvaliteten af DNA og RNA blev bestemt ved hjælp af et NanoDropTM One/OneC spektrofotometer (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Komplementær DNA-syntese

Syntese af komplementært DNA (cDNA) fra RNA-isolater blev udført ved hjælp af Xpert cDNA Synthesis Mastermix-kittet (GRiSP, Porto, Portugal, ifølge producentens instruktioner. RNA blev omvendt transskriberet ved hjælp af 500 ng ekstraheret RNA fra hver prøve for at udføre cDNA-syntese, som blev udført ved hjælp af en termocycler (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). De resulterende cDNA'er blev opbevaret ved -20 grad indtil brug til yderligere assays. 2.7.2.Primer Design

Til denne undersøgelse blev primere for det målrettede (NFE2L2 og NQO1) og et endogent kontrolgen (6-aktin) designet ved hjælp af Primer-BLAST-softwaren fra National Center for Biotechnology Information (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, adgang til den 6. marts 2020). Sekvenser af primere for referencegenerne og målgenerne er afbildet i tabel 1. Derudover blev mt-ND5-genet brugt i dette arbejde, og detaljer om mt-ND5-primere blev hentet fra en tidligere undersøgelse [45].

2.7.3. Kvantitativ omvendt transkriptionspolymerasekædereaktion

Real-time PCR-analyser blev udført ved hjælp af Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X med ROX i en QuantStudio 3 thermocycler (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), ved anvendelse af cDNA i en koncentration på 25 ng uL-l. Vurderingen af mitokondrie-DNA (mt-DNA) kopinummer af ND5-genet blev udført ved qPCR gennem det tidligere ekstraherede DNA under anvendelse af det samme udstyr som til kvantificering af gener. Hver optimeret reaktion blev udført, bestående af Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X med ROX, primer (fremad og omvendt) af hvert målgen, prøve (cDNA/DNA) og RNase-frit vand, der udgør et samlet volumen på 10 μL. Prøverne blev analyseret i to eksemplarer, og reaktioner indeholdende vand i stedet for skabelon blev inkluderet som negative kontroller. Prøverne blev underkastet en amplifikationsprotokol, der bestod af en indledende cyklus ved 95 grader i 2 min denatureringsfase, efterfulgt af 40 denatureringscyklusser ved 95 grader i 55 sekunder, 40 annealingscyklusser i 30 sekunder ved 60 grader (afhængigt af smeltetemperaturen på primersekvenser) og forlængelsesfase ved 72 grader i 30 s og til sidst en sidste forlængelsesperiode ved 72 grader i 10 minutter.

Til kvantificeringen af genekspression blev den relative kvantificeringsmetode brugt. Denne metode til relativ kvantificering af genekspression blev udført med ekspressionsniveauerne af målgenerne under undersøgelse, som blev normaliseret med husholdningsgenerne, ved den CT-komparative metode. Da amplifikationen med RT-qPCR blev udført i to eksemplarer, blev de gennemsnitlige CT-værdier for hvert gen bestemt, og ekspressionsniveauerne blev beregnet ved hjælp af følgende formel:

hvor △Ct=Ct-målgen -Ct endogent kontrolgen.

Til kvantificering af mt-DNA antallet af kopier blev den relative kvantificering normaliseret mod enhedsmassemetoden anvendt. Denne metode blev udført med CT-værdierne af GC'er behandlet med UA (navngivet som en test), som blev normaliseret med kontrolprøver (i øjeblikket betegnet som kalibrator). Da mt-ND5 kopiantallet blev vurderet ved qPCR og udført i to eksemplarer, blev de gennemsnitlige CT-værdier for test- og kalibratorprøverne bestemt, og forholdene blev beregnet ved hjælp af følgende formel: