Anti-aging effekt af urolithin A på bovine oocytter in vitro 2

Venligst kontaktoscar.xiao@wecistanche.comfor mere information

2.8.Statistisk analyse

Data fra embryoproduktion og kvalitetssessioner blev analyseret ved at bruge Proc Glimmix fra SAS (Statistical Analysis Systems, SAS Inst., Inc., Cary, NC, USA), ved at bruge den binære distribution og logit som linkfunktioner. Den generaliserede lineære blandede model inkluderede behandling (UA-doser, ældningseffekt og kvindelig alder og deres interaktion) som en fast effekt og replikerer som en tilfældig effekt. Derudover blev middelværdierne for hver behandling beregnet, og der blev foretaget sammenligninger mellem grupperne ved hjælp af PDIFF-testen. JC-1-data, mRNA-transskriptionsniveauer og mt-DNA-antal af kopier blev analyseret ved hjælp af Proc Mixed fra SAS med en model, der inkluderer behandling (UA-effekt, ældningseffekt og/eller kvindelig alder og deres interaktion) som en fast effekt. Sessionen blev betragtet som en tilfældig effekt. Dataene for kromosomkonfigurationer blev sammenlignet mellem grupper under anvendelse af den nøjagtige Fisher-test i en 2 x 2 kontingentabel. Analysen af ​​resultater blev betragtet som statistisk signifikant, når p<>

Klik venligst her for at vide mere

3. Resultater

3.1.Tidligere assay-dosis-respons undersøgelse

Oocytmodningsstatus observeret under dosis-respons-undersøgelsen af ​​UA suppleret med modningsmediet er repræsenteret i figur 1. Dette tilskud havde signifikant indflydelse på de nukleare modningsstadier af oocytter. 50 UA-gruppen (38,9±0,5 procent) afslørede en højere frekvens af oocytter i AI/TI-fasestatus sammenlignet med kontrol (10,8±{{ 15}},5 procent ,P=0.03)og 10 UA(0.0±0.{{ 45}} procent ,p=0.0006) grupper. I denne fase er en højere rate i 25 UA-gruppen (17,2±0,5 procent ,p=0.05) sammenlignet med gruppen på 10 UA blev også identificeret. Desuden blev der fundet en tendens mellem 50 UA-gruppen og 1 UA (14,3±2,0 procent ,p=0.08). Den højeste dosis viste også en skadelig effekt, hvilket reducerede antallet af oocytter klassificeret ved Metafase-II (MII) trin(50 UA,44,4 ±2,0 procent) sammenlignet med kontrol (86.5±7.0 procent ,p=0.003),1 UA(82.1±2.5 procent,p{{ 53}}.01), 10 UA(89.3±6.5 procent ,p=0.002) og 25UA(82.8±9.0 procent ,p=0.01)-grupper. Der blev ikke observeret nogen forskelle mellem de resterende stadier af oocytmodning. GV- og CCl-modningsfaserne blev ikke vist i figur 1, da ingen oocytter blev vurderet i disse kategorier.

Dosis-respons-testen viste ingen signifikant effekt af UA-koncentrationer på spaltning og udklækkede embryohastigheder. Imidlertid var hastigheden af ​​embryoner produceret på dag 7 påvirket af de forskellige koncentrationer af UA. 50 UA-gruppen (7,2±2,7 procent) havde lavere frekvenser af embryoner på dag 7 sammenlignet med 1 UA (28,5±4,8 procent,p=0.004),10 UA(20,4±4,0 procent) , p=0.03) og 25 UA(18,5±4,7 procent ,p=0.05)-grupper. Selvom der ikke blev fundet signifikante forskelle mellem kontrol- og 50 UA-grupper, blev en tendens (p=0.06) identificeret. Desuden har embryorater på dag 7 (p =0.07) en tendens til at være højere efter 1 UA-dosistilskud sammenlignet med kontrol. Desuden fordoblede 1 UA-gruppen antallet af fremragende/god embryokvalitet (68,9 procent af grad 1 embryoner,n=20) sammenlignet med kontrol(34,6 procent,n=10) og 10 UA (26,8) procent ,n=10). Et lavt antal grad 1-embryoner blev opnået med de højere doser: 25UA-gruppe (15,4 procent ,n=4) og 50UA (35,4 procent,n=3). Baseret på de ovennævnte resultater blev 1 uM UA valgt for at gå videre til følgende undersøgelser.

3.2.Eksperiment 1——Oocytkvalitet og udviklingspotentiale for gamle og fysiologisk modnede oocytter

3.2.1.Nuklear modning

Vi undersøgte effekten af ​​UA-tilskud på den kromosomale modningsstatus af gamle og fysiologisk modne oocytter indsamlet fra præpubertale og voksne kvinder. Uafhængigt af UA-effekten inducerede oocytaldring og kvindelig alder en signifikant skadelig effekt på modning. Højere rater af MII-fase blev identificeret i kontroloocytter sammenlignet med ældre (22h=93.2±5.4 procent vs.30t=77.6±4.1 procent , p {{11 }}.02). Desuden blev der identificeret en forsinkelse i modningsforløbet på ældre kønsceller og præpubertale kvinder med flere oocytter i AI/TI-fasen (22 timer=3.4±0.5 procent vs. 30t. =17.9±0.6 procent ,p=0.01 og præpubertal=21.1±1.1 procent vs. voksen=6.8±0,7 procent p =0.03). Desuden blev et højere antal degenererede oocytter efter 30 timers IVM identificeret sammenlignet med efter 22 timer (7,1 ±1,39 procent mod 4,1±0,89 procent ,p =0.02) . Den kvindelige alder og UA-tilskud interfererede ikke (p 0,05) med antallet af degenererede oocytter.

Både in vitro-ældning og UA-tilskud til modningsmediet havde signifikant indflydelse på den kromosomale konfiguration af oocytter hos præpubertale og voksne kvinder (p.<0.05, figure="" 2).="" on="" the="" al/ti="" phase="" of="" the="" maturation="" status,="" higher="" rates="" of="" oocytes="" were="" found="" in="" this="" stage="" in="" the="" control="" aged="" 30="" h="" prepubertal="" group="" (46.7±0.5%)="" when="" compared="" to="" control="" prepubertal="" (0.0±0.0%,p="0.05)" and="" ua="" aged="" 30h="" prepubertal="" (0.0="" ±0.0%,p="0.02),and" both="" adult="" control="" (5.6±0.5%,p="0.01" and="" ua="" adult,0.0±0.0%,="" p="0.0002)and" control="" aged="" 30h="" adult="" (9.1±10%,p="0.02)groups." a="" trend="" was="" also="" identified="" between="" ua="" adults="" and="" ua="" aged="" 30="" h="" adult="" (p="">

Med hensyn til MII-fasen svarende til fuldstændig nuklear modning, blev der også fundet signifikante forskelle mellem grupperne (figur 2). Lavere frekvenser af oocytter på MII-stadiet blev fundet i kontrollen i alderen 30 timer præpubertal (53,3±2.0 procent) sammenlignet med den præpubertale kontrol (10{{2{ {27}}}}.0±1,5 procent ,p=0,05),UA i alderen 30 timer før puberteten(100,0±2,5 procent, p=0,02)og UA voksen(100,0 ±10,5 procent ,p=0.0002) og kontrol i alderen 30 havde voksne (86.0±5.5 procent p =0.056) grupper. Desuden viste UA-voksengruppen højere frekvenser af modne oocytter (MII) sammenlignet med UA i alderen 30 timer voksen (76,2±11,3 procent ,p=0.01), kontrol i alderen 30 timer voksen (86). 0±5,5 procent ,p=0.08) og kontrol voksen (83.3±4.5 procent ,p=0.057).

Der blev ikke observeret forskelle mellem de resterende stadier af oocytmodning.flavonoider,Sammenfattende forbedrede UA-tilskud in vitro-modningsforløbet i oocytter, der blev underkastet ældningsprocessen, især hos præpubertale kvinder. En vigtig anti-aging effekt af UA blev således identificeret.

3.2.2.Mitokondriel membranpotentiale

For at analysere involveringen af ​​mitokondriel dysfunktion i kvindelige oocytter og effekten af ​​UA og moderens alder, blev mitokondriemembranpotentialet (MMP) vurderet i oocytter fra forskellige grupper.

Cistanche kan anti-aging

Uafhængigt af kvindens alder og UA-effekter havde oocytaldring en signifikant skadelig effekt på MMP vurderet som forholdet mellem den målte røde og grønne fluorescens (22 timers forhold =0,54±1,8 procent vs.30hratio{{6} },47±1,5 procent ,p=0.002).

Kombinationen af ​​kvindens alder, ældningseffekten og tilskuddet med UA under modning signifikant (p{{0}}.{{10}}07) påvirkede MMP'en (Figur 3). Som observeret i figur 3 blev højere mængder af MMP opnået i UA præpubertale (forhold=0.55±0.04) og UA voksne (forhold=0.63±0.04), hvor oocytter blev modnet i 22 timer sammenlignet med kontrolgruppen på 30 timer voksen (forhold=0.45±0.04,p=0.04 og p=0.0007, henholdsvis) og UA på 30 timer voksen (forhold{ {23}}.45±0.03,p=0.03 og p=0.0003, henholdsvis) grupper.hesperidin brugerDesuden blev der observeret en signifikant stigning i JC{0}} aggregat/monomer-forhold, hvilket indikerer en signifikant stigning i MMP, i UA-voksengruppen sammenlignet med kontrol-voksen (forhold =0.47 ±0.04,p =0.0031),kontrol præpubertal(forhold=0.52±0,04, p=0. 03),kontrol i alderen 30 timer voksen(forhold=0.48±0.03,p=0.003) og UA i alderen 30 timer voksen (forhold=0.47±0.03,p{{25 }}.001)-grupper. Der blev også identificeret en tendens mellem UA præpubertal og UA i alderen 30 timer præpubertal (p=0.07).

Sammenfattende forbedrede UA MMP under fysiologisk modning, men var ikke i stand til at overvinde den negative effekt af aldring i både præpubertale og voksne oocytter.

3.2.3.Embryonal udvikling

Det embryonale udviklingspotentiale blev evalueret gennem spaltning, D7 og udklækkede embryohastigheder, opnået med de forskellige behandlinger (aldring og UA-supplement) anvendt på præpubertale og voksne kvinders COC'er under modning. Uafhængigt af kvindens alder og UA-effekter havde oocytaldring en signifikant skadelig effekt på spaltningen (22h=79.5±1,7 procent vs.30h=68.6±2,0 procent, p=0.0001)og D7embryofrekvenser(22t=18,6±1,9 procent

vs.30h=12.1±1,7 procent ,p=0.01). UA-tilskuddet viste sig også at forbedre D7-embryohastigheden (kontrol{ {8}}.1±1,5 procent vs. UA=20.0±2.0 procent ,p=0.0009).

Kombinationen af ​​den kvindelige alder, ældningseffekten og tilskuddet med UA under modning signifikant (p {{0}}.{{30}}1) påvirkede embryonal udvikling, nemlig spaltningen og D7 embryohastigheder (tabel 2). Højere spaltningshastigheder blev opnået, når de voksne oocytter blev modnet i 22 timer med eller uden UA-tilskud (kontrol voksen=1.4±3,2 procent og UA voksen=80. 9±3,4 procent ) og præpubertale oocytter modnede i 22 timer med UA-tilskud (UA præpubertal=80.6±3,2 procent ), sammenlignet med UA i alderen 30havde (66,5±4,2 procent ,p Mindre end eller lig med 0,01), kontrol i alderen 30hprepubertal (66,9±3,9 procent ,p Mindre end eller lig med 0,02) og UA i alderen 30 timer præpubertal (67,2±4,0 procent ,p Mindre end eller lig med 0,01) grupper (tabel 2). En tendens (p=0.09) blev også identificeret mellem voksenkontrolgruppen og kontrolgruppen i alderen 30 timer.

Another parameter that was significantly (p=0.01) influenced by the combination of the female age, the supplementation with UA, and COCs aging was the rate of embryos produced at day 7(Table 2). Exceptions were made for the UA prepubertal and UA 30 h prepubertal groups, the UA adult group presented the highest rates of the embryo at day7 (26.8±4.3%,p≤0.05). Moreover, lower D7 embryo rates were produced from aged oocytes from both adult and prepubertal females without the supplementation of UA (control aged 30hprepubertal=7.7±2.6% and control aged 30h adult=7.7±2.6%)compared to those that were supplemented with UA, respectively (UA aged 30 h prepubertal=18.9±4.0%,p=0.03 and UA aged 30 h adult=15.9±4.0%,p=0.09). The supplementation of UA to the maturation medium did not significantly (p>0.05)påvirkede kvalitetsraterne af producerede embryoner af grad 1,2 og 3, ej heller ældningseffekten eller alle de undersøgte effekter tilsammen (tabel 3). Imidlertid fordobledes antallet af embryoner af fremragende/god kvalitet, der blev produceret, når UA blev suppleret med oocytter modnet i 22 timer (tabel 3).

3.3.Eksperiment 2

3.3.1.Genekspressionsniveauer

For at studere UA-effekten og moderens alderspåvirkning på Nrf2-signalvejen blev analyse af NFE2L2- og NQO1-genekspressionsniveauer i GCs-kultur fra præpubertale og voksne køer vurderet ved RT-qPCR. Uafhængigt af de andre undersøgte faktorer påvirkede kvindens alder signifikant NFE2L2-genekspressionen, hvilket afspejles i det højere niveau af NFE2L2-transkripter i GC'er fra præpubertale kvinder (mRNA-niveauer præpubertalt=0.00015 ±0,0012 procent vs. voksen=0,00011±0,0012,p=0,048).

The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly(p>0.05) påvirker genekspressionsniveauerne for NFE2L2-, NQOl- og mt-ND5-gener. Figur 4 repræsenterer ekspressionsniveauerne af disse gener, der blev normaliseret med den respektive kontrol, i både UA-behandlede præpubertale og voksne GC'er.

3.3.2.mt-DNA-kopinummer

Analysis of mt-ND5 DNA content in GC culture from prepubertal and adult cows was assessed by qPCR. The supplementation of UA to the culture medium of GCs, both independently and considering female age, did not significantly (p>0.05) påvirker kopinummeret af mt-ND5-genet.tabt imperium cistancheFigur 5 repræsenterer kopiantallet af dette gen normaliseret med de respektive kontroller i både UA-behandlede præpubertale og voksne GC'er.

4. Diskussion

I løbet af de sidste årtier er stigende efterspørgsel efter ART-anvendelse i husdyr blevet observeret [8,46,47]. Derudover er forsinket barsel i forbindelse med fremskreden moderens alder nu blevet den vigtigste faktor, der får kvinder til at ty til ART [5]. Oocytkvalitet er afgørende for forekomsten af ​​en vellykket undfangelse, og ældning af den kvindelige kønscelle er en stor bekymring for ART-succes. På trods af de stigende fremskridt, der er gjort på dette område, er de anvendte teknologier endnu ikke i stand til at genoprette frugtbarheden, hvilket vender det biologiske ur tilbage [7]. I nærværende arbejde blev der udviklet en model til undersøgelse af aldersassocieret infertilitet i kvægoocytter. På grund af lighederne med human graviditet, follikulære og endokrine hændelser[48,49], kan denne model også være nyttig til human forskning, idet man undgår de etiske og fysiske begrænsninger, der hæmmer disse undersøgelser i menneskelige oocytter. Vores model for ældning af kvindelige kønsceller viste sig at være meget effektiv og velegnet til at studere forskellige problemer forbundet med reproduktiv aldring og fertilitetssvækkelse, som i øjeblikket er en af ​​de mest kritiske udfordringer i verden. Ydermere er søgningen efter nye kommende antioxidantterapier med potentiale til at forhindre infertilitet fremkaldt af kvindelig kønsældning, som undersøgt i dette arbejde, lige så meget vigtig.

Præsenterede resultater rapporterede for første gang om den gavnlige effekt af UA i ART-resultater. UA er en fødevaremetabolit, der er i stand til at forhindre akkumulering af aldersrelaterede dysfunktionelle mitokondrier ved at inducere deres mitofagi og en forlænget levetid for celler [28]. Da UA aldrig er blevet testet før i bovin reproduktion, blev der anvendt doser med succes anvendt i forskellige cellelinjer, der viser dets anti-cancer, anti-inflammatoriske og anti-aldringseffekter [28,35,39]. I vores undersøgelse blev en tidligere dosis- responsassay blev udført, og koncentrationen af ​​1 uM UA blev klart identificeret som den mest lovende. Desuden blev en skadelig virkning påvist ved højere doser, især ved 50 uM UA-dosis, hvilket skadede progressionen af ​​nuklear modning indtil MII. Denne effekt blev afspejlet på svækkelse af embryonal udvikling. Derfor bemærkede Liu og kolleger (2019) signifikant reduceret cellelevedygtighed og spredning af humane ældende hudfibroblaster ved en UA-koncentration på 50 uM. De henviste til, at høje UA-doser fører til nedsat cellelevedygtighed, hvilket øger antallet af celler, der stoppes i G/M-cellecyklussen [35]. Tværtimod blev der produceret højere mængder af embryoner på dag 7 efter tilskud af 1 uM UA til modningsmediet sammenlignet med de andre doser. For yderligere at udforske de potentielle mekanismer for virkningen af ​​UA i kvindelig reproduktion, blev en undersøgelse under oocytaldring og brug af hunner med forskellige aldre som oocytdonorer implementeret. Yamamoto og medarbejdere (2010) rapporterede et aldersrelateret fald i befrugtningsraten hos gamle køer, hvilket viste, at disse oocytter var mere tilbøjelige til at genoptage den første meiotiske deling under modning og ofte allerede havde påbegyndt den meiotiske modning ved oocytopsamling [50] Disse data antydede, at oocytter fra ældre køer havde en hurtigere nuklear modningsprogression og nåede MII-fasen hurtigere end oocytter fra unge hunner på grund af en lavere oocytkompetence [51]. I overensstemmelse hermed afslører vores undersøgelse, at kvindelige donorers alder og processen med ældning af oocytter signifikant påvirker den kromosomale konfiguration af oocytter under modningsforløbet. Faktisk udviste oocytter fra præpubertale køer en højere frekvens af forsinkede stadier, såsom Al/TI-faser (præpubertale=21.1 procent vs. voksne =6.8 procent), hvilket afslørede en langsommere progression af nuklear modning, hvilket kan skyldes lavere oocytkompetence som foreslået af Soto-Heras og kolleger (2018). Ældre oocytter præsenterer også lavere frekvenser af oocytter, der har nået MII-fasen i løbet af en 30 timers periode (7,6 procent) sammenlignet med den fysiologiske periode (93,2 procent). Desuden er en positiv effekt blevet identificeret med UA-behandling under den fysiologiske modningsproces, og også anti-aldringseffekter hos både præpubertale og voksne kvinder.

I overensstemmelse med vores resultater har en undersøgelse vist, at melatonintilskud under in oitro-modningen kunne stimulere meiose-genoptagelsen i bovine COC'er, hvorimod kontroloocytter dyrket uden hormoner havde langsommere meiose-genoptagelseshastigheder [52]. Tværtimod havde tilskuddet med andre antioxidantmidler, såsom quercetin, C-vitamin eller resveratrol, ingen effekt på nuklear modningshastighed, selv når der blev observeret et reduceret ROS-niveau eller øget antioxidant-enzymatiske niveau [53,54].mikroniseret oprenset flavonoidfraktion 1000 mg brugerOmvendt viser vores resultater, at UA kunne redde oocytter fra ældningseffekter hos både ældre voksne og præpubertale kvinder, som giver lavere kompetence, hvilket forbedrer modningshastigheden.

En af de vigtigste bidragydere til dårlige fertilitetsresultater, der påvirker oocytkvaliteten, er relateret til mitokondriefunktioner, som bliver kompromitteret med fremskreden moderens alder og post-ovulatorisk aldring [21,55]. MMP er blevet undersøgt i vid udstrækning i forskellige modeller, hvilket afslører, at både ældede kønsceller efter ægløsning og moderens aldring inducerer tab af mitokondriel funktion [56]. Som følge heraf blev tabet af MMP negativt afspejlet på oocyt- og embryoudvikling [26,57]. Ifølge disse resultater blev der i vores undersøgelse fundet et reduceret MMP-forhold i gamle oocytter fra både præpubertale og voksne køer. Desuden inducerede UA-tilskud til dyrkningsmediet en stigning i MMP af præpubertale og voksne oocytter, der modnede i 22 timer, hvilket gav genlyd i højere spaltningshastigheder. Disse data er i overensstemmelse med resultaterne fundet af Liang og kolleger (2017), som observerede en MMP-forøgelse, når bovine oocytter blev suppleret med melatonin i 22 timer [26]. Vi identificerede dog også en reduktion i MMP i gamle oocytter suppleret med UA, hvilket indikerer, at UA muligvis ikke er i stand til at vende den negative effekt af aldring i MMP. Der er observeret afvigende resultater vedrørende MMP efter tilskud af gamle oocytter med antioxidantforbindelser. Faktisk rapporterede flere forfattere højere niveauer af MMP på oocytter efter tilskud med melatonin [26] og laminarin [21], mens andre har observeret det modsatte, et fald i MMP i gamle oocytter behandlet med L-carnitin [58] og melatonin [38]. Derudover viste Ryu og kolleger (2016) en reduktion i MMP i musemyoblaster dyrket med UA [28]. Med hensyn til vores resultater bør yderligere undersøgelser behandles for at uddybe kendskabet til virkningsmekanismen for UA i oocytmitokondrierne og forklare de identificerede differentielle virkninger på ældede og fysiologisk modne oocytter.

Den iboende kvalitet af oocytter er blevet rapporteret bredt som den vigtigste determinant for efterfølgende embryonal udvikling. Akkumuleret evidens afslørede, at adskillige cellulære og molekylære abnormiteter forekommer under forlængede in vitro-modningsperioder såvel som under in oivo post-ovulatorisk aldring [57]. Ydermere kan disse abnormiteter have relevante indvirkninger på oocytkvaliteten, som giver genlyd på embryoproduktionen [52]. For at demonstrere, at UA kan fungere som en anti-aldringsforbindelse og forbedre oocytkvaliteten, forsinke oocyternes aldring, undersøgte vi udviklingskapaciteten af ​​gamle oocytter efter in vitro fertilisering. I vores undersøgelse blev der observeret en signifikant (p Mindre end eller lig med 0.01) skadelig effekt af kønsældning på spaltning og embryoproduktion på dag 7. I overensstemmelse hermed henviste flere forfattere til, at gamle hunner har et aldersrelateret fald i reproduktionsevnen, hvilket afspejles i lavere fertilitetsrater og dårlig embryokvalitet [44,55]. På den anden side har tidligere undersøgelser, der tester andre antioxidantmolekyler for at redde gamle oocytter, rapporteret den gavnlige effekt af nogle få af disse forbindelser under in vitro-modning på embryoudviklingen af ​​ældre hunner fra forskellige arter, såsom kvæg [58], svin [58] 38] og mus [6]. For eksempel blev L-carnitin testet på bovin-ældne oocytter, og der blev ikke fundet nogen signifikante forskelle på de opnåede spaltningshastigheder. Imidlertid blev en signifikant stigning i hastigheden af ​​zygoter udviklet til blastocyststadiet identificeret sammenlignet med gamle oocytter uden L-carnitin [59] Vores resultater viser også, at UA-tilskud under fysiologisk modning forbedrede spaltningshastigheden hos præpubertale og voksne kvinder. Selvom spaltningshastighederne af UA-ældne oocytter ikke var signifikant forskellige fra kontrol-ældrede oocytter, blev højere D7-embryohastigheder identificeret i UA-aldrede oocytter fra både præpubertale og voksne kvinder. Disse resultater påpegede, at anti-aldringseffekten af ​​UA tidligere identificeret i forskellige cellekulturer [28,35] er gyldig for oocytter og embryoner. Ældring af oocytter er en multifaktoriel proces, der hæmmer udviklingen af ​​embryonet, og genoprettelse af udviklingskapaciteten af ​​gamle oocytter er et vigtigt mål, som blev opnået i denne undersøgelse.

Derudover vurderede vi også den forebyggende rolle af UA i den aldersrelaterede forringelse af embryokvalitet. Selvom der i denne undersøgelse ikke blev fundet signifikante forskelle i embryokvalitetsrater, øgede oocytterne suppleret med UA antallet af overførbare embryoner sammenlignet med de ubehandlede. En tidligere undersøgelse rapporterede, at L-carnitinbehandling kunne forbedre kvaliteten af ​​embryoner udviklet fra gamle bovine oocytter gennem reduktion i ROS-niveauer og højere niveauer af glutathion såvel som andre antioxidantenzymer [58]. Forskellene mellem disse resultater og vores kan skyldes de forskellige teknikker, der anvendes til at vurdere embryokvalitet. Den morfologiske evaluering af embryokvalitet forbliver en subjektiv metode, der afhænger af observatørens oplevelse. I fremtiden bør flere undersøgelser behandles ved hjælp af andre teknikker til nøjagtigt at vurdere embryokvalitet.

Det er almindeligt kendt, at oxidativ stress spiller en afgørende rolle i det aldersrelaterede fald i fertilitet. Oxidativt stress er en af ​​de største bidragydere til lav oocytmodningseffektivitet og forringelse af oocytkvaliteten, hvilket forringer efterfølgende embryoudvikling [11]. Intercellulær kommunikation mellem gameten og somatiske celler er afgørende for den korrekte udvikling af oocytter af høj kvalitet. Ændringer i mikromiljøet i gamle æggestokke er blevet rapporteret, såsom nedsat antioxidant-enzymatisk aktivitet, der fører til en forringet ROS-opfangningseffektivitet.oteflavonoidYdermere blev GC'er fra unge og ældre kvinder vist at have differentielt udtrykte gener forbundet med antioxidantaktiviteter og moderens alder [2,13]. Det er således af stor betydning, at fundne mekanismer håndterer oxidativ stress for at redde oocytter fra aldring og overvinde infertilitetsproblemer. Nrf2-Keapl-vejen er blevet grundigt undersøgt på grund af dens evne til at klare de skadelige virkninger af oxidativt stress og udøve antioxidantegenskaber [60]For yderligere at studere aktiveringen af ​​Nrf2-signalvejen i bovine GC'er, vurderede vi mRNA-ekspressionsniveau af NFE2L2 og dens nedstrøms antioxidant (NQO1). Vores resultater viste en signifikant indflydelse af kvindelig alder på niveauet af NFE2L2-transskriptioner, som falder med alderen. Faktisk blev større mRNA-ekspressionsniveauer observeret i præpubertale køer sammenlignet med voksne. Dette er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der rapporterede et højt udtrykt niveau af Nrf2-protein og mRNA på ovarievæv fra fødedygtige unge mus og kvinder fra 22 og 49 år, hvorimod der i ældre mus og kvinder blev fundet et lavere udtryk. Det blev foreslået, at nedsat ekspression af Nrf2 kan være involveret i faldet i reproduktionsevnen hos ældre kvinder, og dets kontrol kan have vigtige implikationer i at forsinke æggestokkenes aldring[15,61]. Ydermere viste Akino og kolleger (2019), at aktiveringen af ​​Nrf2-Keapl-vejen gennem administration af dimethylfumarat kunne reducere ROS-niveauer og føre til forsinket infertilitet [18]. Lignende resultater vedrørende effekten af ​​UA til at reducere ROS i ældende humane hudfibroblaster blev rapporteret. Når disse celler blev behandlet med UA, blev der rapporteret en signifikant stigning i mRNA-ekspressionen af ​​Nrf2-målrettede gener, såsom SOD1, NQ01, GCLC og HMOX1. [35]. I vores undersøgelse observerede vi, at ekspressionsniveauet af NFE2L2- og NQO1-gener i GC'er ikke var signifikant påvirket af UA-tilskud. Yderligere undersøgelser bør imidlertid behandles for at bekræfte reduktionen i ROS og efterfølgende forbedring af den producerede blastocyst, såvel som UA-effekten på mRNA-ekspression af de førnævnte gener på ældede oocytter.

Ud over skaden på mitokondrielt DNA (mt-DNA) [25,57] har forstyrrelsen af ​​mitokondriel genekspression også vist sig at bidrage til mitokondriel dysfunktion med alderen. Zhang og kolleger (2019) rapporterede, at nogle gener involveret i OXPHOS, nemlig mt-ND2, mt-ND3, mt-ND4, mt-ND4L og mt-ND5, var signifikant nedreguleret i GV-stadiet af oocytter fra gamle mus, sammenlignet med dem fra unge mus[62]. I vores undersøgelse blev der ikke fundet nogen signifikant forskel i mt-ND5 mRNA-ekspressionen mellem GC'erne hentet fra præpubertale og voksne køer. Desuden vurderede vi også mt-DNA-kopitallet, fordi indholdet af mt-DNA i GC'er er blevet positivt forbundet med oocytkvalitet og embryoudvikling [63,64]. Selvom der i vores undersøgelse ikke blev identificeret signifikante forskelle mellem mt-DNA-kopitallet i GC'er fra præpubertale og voksne køer, eller når de blev behandlet med UA, observerede vi et større antal oocytter, der udviklede sig til blastocyststadiet sammenlignet med de ubehandlede grupper. Derudover rapporterede Ryu og medarbejdere (2016), at mt-DNA-indholdet og proteinniveauet fra de respiratoriske komplekser ikke ændrede sig i musemyoblaster suppleret med UA[28]. Yderligere undersøgelser bør udføres for at afsløre virkningsmekanismen af ​​UA til at forbedre kvindelig fertilitet.

5. Konklusioner

Resultaterne opnået i denne undersøgelse bekræftede den skadelige effekt af oocytaldring på dens udviklingskompetence. Desuden viste vores model for ældning af kvindelige kønsceller sig at være meget effektiv og nyttig til at studere forskellige problemer forbundet med reproduktiv aldring og deraf følgende fertilitetssvækkelse. Derudover forbedrede UA-tilskud under modningsprocessen af ​​gamle oocytter modningshastigheder og producerede embryoner. Derfor blev der for første gang identificeret en anti-aldringseffekt af UA til at redde gamle kønsceller, hvilket forbedrer blastocystudviklingen, hvilket fører til et øget antal embryoner til overførsel til modtagende hunner. En positiv effekt af UA på fysiologisk modning, MMP og embryonal udvikling blev også identificeret. Som konklusion giver UA-behandling en ny terapeutisk tilgang til at forhindre eller forsinke kønscellers aldring og forbedre den efterfølgende blastocystdannelse og fertilitetsresultater i ART.

Denne artikel er uddraget fra Animals 2021, 11, 2048. https://doi.org/10.3390/ani11072048 https://www.mdpi.com/journal/animals