Ændringer i proteinoversættelse og carboxylsyrekataboliske processer ved diabetisk nyresygdom

Abstrakt: Diabetisk nyresygdom (DKD)er fortsat den primære årsag tilnyresygdom i slutstadiettrods årtiers studier. Ændringer iglomerulus og nyretubulibegge bidrager tilpatogenese af DKDselvom størstedelen af efterforskningsindsatsen har fokuseret på glomerulus. Vi søgte at undersøge den differentielle ekspressionssignatur af human DKD i glomerulus og proximal tubuli og bekræfte vores resultater i db/db-musemodellen for diabetes. En transkriptogram-netværksanalyse af RNAseq-data fra laser mikrodissektion (LMD) human glomerulus og proksimale tubuli af DKD ogreference nefrektomiprøver afslørede berigede veje, herunder rhodopsin-lignende receptorer, olfaktorisk signalering og ribosom (proteintranslation) i den proksimale tubuli af humane DKD-biopsiprøver. Oversættelsesvejen blev også beriget i glomerulus. Øget oversættelse idiabetisk nyres blev valideret ved hjælp af polyribosomal profilering i db/db-musemodellen for diabetes. Ved at bruge enkelt nuklear RNA-sekventering (RNA-Seq) af nyrer fra db/db-mus prioriterede vi yderligere veje identificeret i human DKD. Den øverste overlappende vej identificeret i de murine snRNAseq proksimale tubuliklynger og den humane LMD proksimale tubulikompartment var carboxylsyrekatabolisme. Ved hjælp af ultra-performance væskekromatografi-massespektrometri blev fedtsyrekatabolismevejen også fundet at være dysreguleret i db/db musemodellen. Acetyl-CoA-metabolitten blev nedreguleret i db/db-mus, tilpasset den humane differentielle ekspression af generne ACOX1 og ACACB. Sammenfattende viser vores resultater, at proksimale tubulære ændringer i proteinoversættelse ogcarboxylsyrekatabolismeer nøgletræk i både menneskelige ogmurine DKD.

Nøgleord:genekspressionssignatur; enkelt nuklear RNA-sekventering;metabolomik; ribosomal profilering

NYE URTER TILDIABETISK NYRE

1. Introduktion

Diabetes mellitus (DM) rammer over 400 millioner mennesker verden over [1] og over 30 millioner i USA [2]. Diabetisk nyresygdom (DKD) er en af de mest alvorlige komplikationer af DM, der rammer 19 millioner mennesker i USA [3], og er den førende årsag tilnyresygdom i slutstadiet(ESKD) [4]. DKD ses klassisk som en glomerulær sygdom; fokuserer udelukkende på glomerulær patologi som det primære skadested overser vigtige biologiske ændringer i det tubulointerstitielle kompartment, der bidrager til patofysiologien af DKD [5]. Faktisk er prognosen og progressionen af DKD ofte parallel tubulær atrofi og omfanget af interstitiel sygdom [6,7]. Yderligere relevant til dette punkt er bevis på, at målretning af den proksimale tubuli med SGLT2-hæmmere bremser progressionen af DKD [8].

De cellulære mekanismer, der fører til udvikling og progression af DKD, er ganske vist komplekse. Det diabetiske miljø er karakteriseret ved metaboliske abnormiteter, inflammation, oxidativt stress og ændringer i proteinhomeostase. Alle disse forstyrrelser bidrager til cellestress og udviklingen af DKD. Der er voksende beviser for, at ændret translation, det grundlæggende trin i genekspression, der skaber funktionelle proteiner, er vigtigt både for at reagere og bidrage til cellestress [9,10]. Ændringer i translation bidrager til ubalancer i proteinhomeostase og påvirker menneskers sundhed og sygdom [11-14].

Forhør af humane nyrebiopsiprøver bruger rutinemæssigt lysmikroskopi, transmissionselektronmikroskopi og immunreaktioner for at sætte patologen i stand til at stille en diagnose og prognose. Disse diagnostiske værktøjer har imidlertid begrænsninger i afdækningen af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for nyresygdom, herunder DKD. Som følge heraf er dyremodeller af DM historisk blevet brugt til at studere de patofysiologiske mekanismer af DKD; ingen af disse modeller simulerer dog passende human DKD [15]. Selvom nylige bestræbelser på at anvende mere avancerede molekylære undersøgelsesteknikker til humane nyrebiopsiprøver er opmuntrende [16], mener vi, at brug af dyremodeller parallelt med humant nyrevæv forbliver en vigtig eksperimentel tilgang til at give unik indsigt i den molekylære underbygning af DKD.

Vi søgte at undersøge den differentielle ekspressionssignatur af human DKD i glomerulus og proximal tubuli. Vi antog, at den proksimale tubulære transkriptomiske signatur ud over glomerulus også bestemmer DKD-resultater. Vi adresserede denne hypotese ved at udspørge humane nyrebiopsiprøver med lasermikrodissektion af glomerulære og proksimale tubulære regioner for at identificere veje forbundet med DKD og dets progression. Dernæst blev nøgleveje bekræftet i en diabetisk musemodel ved hjælp af en multimodal tilgang af enkelt nuklear RNA-sekventering (RNA-Seq), polyribosomal profilering og metabolomik. Ud over forstyrrelser i proteinoversættelse understøtter vores resultater den potentielle rolle af carboxylsyremetabolisme som en nøglefaktor i udviklingen af diabetisk nyresygdom.

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2. Materialer og metoder

2.1. Menneskelige Subjekter

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board ved Indiana University School of Medicine (IRB nr. 190657223). Syvogtyve nyreprøver blev opnået fra Kidney Precision Medicine Project Consortium og Biopsy Biobank Cohort of Indiana [17]. Nyrebiopsier var indikationsbiopsier for proteinuri eller et fald i nyrefunktionen hos personer med diabetes mellitus. Atten prøver blev erhvervet fra voksne med diabetisk nyresygdom og uden en anden glomerulær læsion. Ni referenceprøver uden histologisk bevis for DKD blev erhvervet fra ikke-neoplastisk parenkym fra nefrektomiprøver eller afdøde donorer. Kliniske og histopatologiske variabler blev ekstraheret fra den elektroniske sundhedsjournal. Baseline-estimeret glomerulær filtrationshastighed (eGFR) blev defineret som værdien tættest på biopsidatoen, medmindre et 20 % eller større fald i eGFR-udfældet biopsihenvisning. I dette scenarie blev en eGFR inden for 1 år før biopsi og før 20 % faldet sat som udgangspunkt for progressionsberegninger.

2.2. Laser mikrodissektion af humant nyrevæv og RNA-sekventering

Kryosektioner med en tykkelse på 12 µm blev skåret fra frosne vævsblokke konserveret i et Optimal Cutting Temperature medium, klæbet til polyphenylensulfid (PPS) membranglas og behandlet ved hjælp af en Rapid Stain-protokol som tidligere beskrevet [18,19]. Et minimumsareal på 500,000 µm2 blev dissekeret for glomerulære og proksimale rørformede rum ved hjælp af den pulserede UV-laser på Leica LMD6500 og et 20× objektiv. Dissekeret væv blev opsamlet i et sterilt RNAse-frit rør indeholdende RNA-ekstraktionsbuffer, og RNA blev isoleret i henhold til producentens instruktioner (Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit, ThermoFisher, Waltham, MA, USA). RNA-kvalitet blev bestemt under anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer.

Sekventering blev udført på Indiana University Center for Medical Genomics Core. Ribosomalt RNA blev udtømt under anvendelse af RiboGone-Mammalian Kit-protokollen (kat #634847, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA). SMARTer Universal Low Input RNA Kit-protokol v2 (Cat #634938, Takara Bio USA, Mountain View, CA, USA) blev brugt til cDNA-syntese og bibliotekskonstruktion. Sekventering blev udført med en 2 × 75 bp parret ende-konfiguration på Illumina HiSeq 4000 ved hjælp af HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, og de sekventerede data blev kortlagt til hg38-genomet ved hjælp af STAR. Unikt kortlagte sekventeringslæsninger blev tildelt til hg38-referencegenomegenerne ved hjælp af Rsubread featureCounts [20,21].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2.3. Dyreforsøgsgodkendelser

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Indiana University Institutional Animal Care Committee og er i overensstemmelse med National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Til bulk RNA-sekventering, polyribosomal profilering og metabolomik blev hanmus stamme C57BL/6J (#000664, baggrundskontrol/C57 mus) og B6.BKS-Leprdb/J (#000697, db mus) opnået fra Jackson Laboratory ( Bar Harbor, ME, USA). Musene var i alderen 9-12 uger og vejede ~30 g (C57-mus) eller 40-50 g (db-mus). Musene blev aflivet, og nyrerne blev høstet (n=4 eller 5 pr. gruppe).

2.4. Isolering af musenyrevæv og bulk RNA-sekventering

Nyrerne blev lynfrosset, og RNA blev ekstraheret ved hjælp af et QIAGEN RNeasy Plus Midi Kit med en genomisk DNA-fjernelsessøjle. RNA-kvalitet blev bestemt under anvendelse af en Agilent 2100 Bioanalyzer. Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit blev brugt til bibliotekskonstruktion. Sekventering blev udført med en 2 × 75 bp parret ende-konfiguration på Illumina HiSeq 4000 ved hjælp af HiSeq 3000/4000 PE SBS Kit, og de sekventerede data blev kortlagt til mm10-genomet ved hjælp af STAR. Unikt kortlagte sekventeringslæsninger blev tildelt mm10 referencegenomegenerne ved hjælp af Rsubread feature Counts.

2.5. Isolering af musenyrevæv og enkelt-nukleær RNA-sekventering

Mus i alderen 5, 8, 11, 16 og 20 uger blev evalueret (n=5 i alt, BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J #000642). Heterozygoter fra den samme stamme blev brugt som baggrundskontroller (n=3). Urinalbumin blev målt med et musealbumin ELISA-kit (Bethyl Laboratories, E99-134, Montgomery, TX, USA), og urinkreatinin blev målt med et QuantiChrom-kreatinin-assay-kit (Bioassay System, DICT-500, Hayward , CA, USA). På isen blev en del af hver nyre tilsat til 1 ml Nuclei EZ lysisbuffer suppleret med 2 % proteaseinhibitor (Thermofisher) og 1 % Superase (Thermofisher). Efter hakning blev 1 ml buffer tilsat, og væv blev homogeniseret under anvendelse af KONTES Dounce Tissue Grinder (Kimble Chase, Rockwood, TN, USA). Homogenat blev forsigtigt blandet med 2 ml buffer og inkuberet på is i 5 min. Homogenat blev filtreret gennem en 40 µm si og behandlet med lyseringsbuffer suppleret med 1 % Superbase, derefter filtreret igen gennem en30 µm si, og efterfølgende resuspenderet i PBS suppleret med 2% BSA og 1%Superase. Denne suspension blev derefter filtreret gennem en 5µm filter og koncentrationenblev justeret til 1-3 millioner kerner/ml før indsendelse til sekventering.

Enkelt nuklear 30 RNA-sekventering blev udført på Indiana University Center for Medical Genomics Core ved hjælp af Chromium enkeltcellesystem version 3 (10× Genomics, San Francisco, CA, USA) og NovaSeq6000 sequencer (Illumina, San Diego, CA, USA). Cell Ranger 4.0 blev brugt til at generere prøvespecifikke FASTQ-filer, og aflæsninger blev justeret til mm10-referencegenomet ved hjælp af STAR. Seurat v 3.0.1 blev brugt til at integrere prøver ved hjælp af følgende kvalitetskontrolmålinger: inkluderet genantal mellem 200-3000 og procent mitokondrielt gen mindre end 50 %. I alt blev 58.405 celler tilbageholdt til nedstrømsanalyse. Standard forbehandling, funktionsvalg, dimensionsreduktion (20 hovedkomponenter), identifikation af ankre mellem prøver og integration varudføres efter Seurat v3 forankringsmetoder.Klynger blev kommenteret ud fraalmindelige genekspressionsmarkører [22] og ved hjælp af Nyrecelle Explorer [23].

HERB CISTANCHE FOR DIABETIC KIDNEY

2.6. Isolering af musenyrevæv og polyribosomal profilering

Baggrundskontrol og db-mus blev aflivet ved 9 og 12 ugers alderen. Hjerteperfusion via venstre ventrikel blev udført med 6 ml cycloheximid (100 µg/ml i PBS). Høstede nyrer blev straks anbragt i en lysisbuffer bestående af 1 % Triton X-100, 0,1 % deoxycholat, 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, EDTA-fri proteasehæmmer cocktailtablet (Roche, Penzberg , Tyskland), 50 µg/ml cycloheximid og RNAsin (1:500 fortynding). Væv blev homogeniseret ved 4 ◦C under anvendelse af en Precellys vævshomogenisator (Precellys, Montigny-le-Bretonneux, Frankrig). Vævshomogenater blev inkuberet på is i 10 minutter og derefter centrifugeret ved 9600 x g i 10 minutter. Supernatanten blev tilsat til toppen af en saccharosegradient genereret af BioComp Gradient Master (10 % saccharoseoven på 50 % saccharose i 20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2og 50 mg/mlcycloheximid) og centrifugeret ved 284,000× g i 2 timer klokken 4◦C. Gradienterne blev høstetfra toppen i en Biocomp høstmaskine (Biocomp Instruments, Fredericton, NB, Canada),og RNA-indholdet af eluerede ribosomale fraktioner blev kontinuerligt overvåget med UVabsorbans ved 254 nm.

2.7. Metabolomics

For at vurdere metabolomiske signaturer blev prøver af baggrundskontrol og db-mus (n=5 pr. gruppe) fremstillet ved hjælp af det automatiserede MicroLab STAR®-system (Hamilton Company, Reno, NV, USA). Metabolomisk analyse blev udført hos Metabolon Inc. Kort fortalt blev snapfrosset nyrevæv behandlet efter Metabolon standardekstraktionsmetoden i henhold til firmaets protokol. Ekstrakterne blev analyseret på en Waters ACQUITY ultra-performance væskekromatografi (UPLC) med en C18 søjle (Waters UPLC BEH C18-2.1 × 100 mm, 1,7 µm) og en Thermo Scientific Q-Exactive høj opløsning/præcis massespektrometer koblet til en opvarmet elektrospray-ioniseringskilde (HESI-II) og Orbitrap-masseanalysator, der drives ved 35,000 masseopløsning.

Rådata blev ekstraheret, peak-identificeret og QC behandlet ved hjælp af Metabolons (Durham, NC, USA) hardware og software. Toppe blev kvantificeret under anvendelse af areal under kurven. Standard statistiske analyser med Welchs to-sample t-test blev udført i ArrayStudio på log-transformerede data.

2.8. Differentiel genekspression, pathway-analyse og statistik

Human LMD- og musenyrevævsekspressionsdata fra RNA-sekventering blev kvantilnormaliseret, og differentialekspression blev bestemt ved hjælp af en nøjagtig test i edgeR med p-værdier < 0.05 betragtes som statistisk signifikant efter Benjamini-Hochberg falsk Discovery rate (FDR) multiple testkorrektion. For musenyreprøver, der gennemgik snRNA-sekventering, blev differentiel ekspression bestemt ved hjælp af en Wilcoxon Rank Sum-test med Bonferroni justerede p-værdier < 0.05, der blev betragtet som statistisk signifikant. Der er dog angivet ukorrigerede p-værdier i manuskriptet. Genekspressionsdata blev undersøgt for berigede veje i Gene Ontology, Kegg og Reactome ved hjælp af en transkriptogram netværksanalyse som tidligere beskrevet [19,24-26]. Kort fortalt er alle proteinkodende gener, uanset p-værdi, ordnet af protein-protein-interaktionsnetværk. En Monte Carlo-algoritme blev brugt til at gruppere gener ved delte biologiske funktioner. Signifikans bestemmes ved hjælp af en tosidet Welch's t-test efter 500 tilfældige permutationer for at estimere den falske opdagelsesrate med p-værdier < 0,05, der anses for statistisk signifikante. Da kun en undergruppe af gener udtrykkes i en given celle for snRNA-seq-data, er transkriptogrammetoden ikke mulig for denne datatype. Pathway-analyse for snRNA-seq involverede berigelse af differentielt udtrykte gener i Gene Ontology, Kegg og Reactome ifølge Fishers eksakte test uden at tage højde for protein-protein-netværksinteraktioner. Alle proksimale tubulære celleklynger på tværs af alle tidspunkter blev slået sammen for at identificere berigede gener mellem kontrol- og db-mus. Den enkelte podocytklynge blev også slået sammen på tværs af tidspunkter. Denne metode blev også anvendt på humane RNA-seq-data ved vurdering af overlapning med snRNA-seq-datasættet. FDR-korrigerede p-værdier for veje blev brugt til at identificere overlap mellem matchende undersegmenter. PAM (partitionering rundtmedoids) blev brugt til at gruppere humane diabetiske prøver i henhold til generne involveret i hver overlappende vej. Differentielle kliniske træk blev bestemt ved hjælp af Wilcoxon Rank Sum-testen mellem grupperede grupper.