Alkohol-specifik transkriptionel dynamik af hukommelsesrekonsolidering og tilbagefald del 4

Ud over Arc fandt vi, at mRNA-niveauerne af Egr1, men ikke Bdnf, blev øget i DH og mPFC ved alkoholhukommelseshentning.

Som tiden går, får folk gradvist en ny forståelse af glemsomhedens mysterium. I denne proces er en ny teknologihukommelseshentning efterhånden blevet et forskningshotspot.

Så er der en sammenhæng mellem genfinding af alkoholhukommelse og hukommelsesydelse? Kom og kig nu! Først og fremmest skal vi være klare: Hentning af alkoholhukommelse er ikke en separat teknologi. Det er en teknologi, der påvirker hjerneneuroner gennem alkohol. Denne proces kan aktivere nogle "sovende" minder i hjernen, hvilket giver os mulighed for at genopfriske disse minder.

For det andet skal vi vide, at forbedring af hukommelsen ikke blot giver os mulighed for at "huske" flere ting, men er en proces med at hente og rekonstruere minder på forskellige måder. Denne proces kan hjælpe os med bedre at konsolidere og forstå den viden, vi har lært, og derved forbedre vores hukommelse.

Derfor kan vi konkludere, at der er en sammenhæng mellem genfinding af alkoholhukommelse og hukommelsesydelse. Når vi bruger denne teknologi til at genudtrække tidligere minder efter at have drukket alkohol, gennemgår vi en proces med at konsolidere disse minder og derved forbedre vores hukommelse til en vis grad.

Selvfølgelig skal vi også bemærke, at genfinding af alkoholhukommelse ikke er en langvarig og pålidelig teknik til at forbedre hukommelsen. Hvis vi ønsker at have en fremragende hukommelse i lang tid, er vi nødt til løbende at konsolidere og forbedre vores hukommelse gennem daglige studier og liv, kombineret med andre hukommelsestræningsteknikker.

I denne proces er vi nødt til at opretholde en optimistisk holdning til enhver tid, for bedre at stimulere vores læringsmotivation og hukommelsespotentiale. Lad os derfor møde hukommelsestræning aktivt, være os selv utrætteligt og gå modigt videre på vejen til løbende at forbedre hukommelsen! Det kan ses, at vi skal forbedre hukommelsen, og Cistanche deserticola kan forbedre hukommelsen markant, fordi Cistanche deserticola også kan regulere balancen af ​​neurotransmittere, såsom at øge niveauet af acetylcholin og vækstfaktorer. Disse stoffer er meget vigtige for hukommelse og indlæring. Derudover kan Kød også forbedre blodgennemstrømningen og fremme ilttilførsel, hvilket kan sikre, at hjernen får tilstrækkelige næringsstoffer og energi, og derved forbedre hjernens vitalitet og udholdenhed.

Klik nu for at forbedre korttidshukommelsen

Øget Egr1-mRNA-ekspression er tidligere blevet impliceret i rekonsolidering af frygt og lægemiddelhukommelser[19, 21, 48, 61], hvilket øger muligheden for, at denne transkriptionsfaktor også spiller en rolle i rekonsolidering af alkoholhukommelser.

Mens Bdnfs rolle i hukommelsesrekonsolidering fortsat er kontroversiel [19, 49], er Bdnf-induktion kendt for at være afgørende for hukommelsestilegnelse og ekstinktionsindlæring [19, 62]. Manglen på ændring i Bdnf-ekspression i vores undersøgelse kunne således tyde på, at vores hukommelseshentningsprocedure ikke initierede ekstinktionslæring sideløbende med hukommelseshentning.

Desuden rapporterede vi for nylig, at selvom mRNA-niveauerne af Bdnf i DH ikke øges af alkoholhukommelsesindhentning i sig selv, var ekspressionen af ​​vækstfaktoren forhøjet, når udvindingen efterfølges af aversiv modkonditionering, der forhindrede tilbagefald [44], hvilket tyder på en kompleks rolle for Bdnf. i alkoholhukommelsens dynamik.

Vores resultater indikerer, at stigningerne i IEG-ekspressionen ikke er unikke for rekonsolidering af alkoholrelaterede minder.

Faktisk var ARC og EGR1 tidligere impliceret i konsolideringen af ​​flere typer minder, inklusive frygtminder [19, 46, 47, 62], genkendelseshukommelser [21] og minder forbundet med forskellige misbrugsstoffer [20, 22, 61].

Der er dog også voksende beviser på, at nogle af de mekanismer, der ligger til grund for alkoholsøgning, kan afvige fra dem, der kontrollerer naturlig belønningssøgning [5, 27, 28, 63]. Der er også bevis for, at minder for forskellige belønninger (og for forskellige stoffer, især) behandles forskelligt [29-32]. Vores RNAseq-analyseresultater afslørede faktisk den unikke transkriptomiske signatur induceret af alkoholhukommelseshentning.

Specifikt fandt vi 44 gener i DH og et andet sæt af 9 gener i dem PFC, som viste signifikante ændringer efter hentning af alkoholhukommelse. Efter yderligere datavalidering fokuserede vi på et gen i mPFC (Fkbp5) og tre gener i DH (Adcy8, Scl8a3 og Neto1) og fandt ud af, at deres ekspression ikke blev påvirket af hentning af saccharose-associerede minder.

Dette tyder på, at i modsætning til Arc og Egr1 spiller disse 4 specifikke gener sandsynligvis ikke generelle roller i behandlingen af ​​belønningsminder, men måske snarere spiller selektive roller i behandlingen af ​​alkoholminder.

Interessant nok var disse fire gener tidligere involveret i alkoholforbrugsforstyrrelser og indlæring og hukommelse. Fkbp5 koder således for FK506 Binding Protein 5, en regulator af det stressneuroendokrine system [64].

FKBP5-varianter modulerer sværhedsgraden af ​​alkoholabstinenssyndrom [65] og forudsiger tilbøjeligheden til tungt drikkeri hos mennesker [66-68]. Sletning af Fkbp5 blev vist at øge alkoholabstinens sværhedsgrad [65] og alkoholdrikning [67] hos mus, hvorimod farmakologisk hæmning af proteinet reducerede moderat alkoholforbrug og genindsættelse af CPP hos mus [69] og reduceret alkoholdrikning hos stressede hanrotter [70].

Niveauerne af Adcy8 mRNA, der koder for adenylatcyclase 8 (AC8), der katalyserer cAMP-dannelse som respons på calciumtilstrømning og for nylig markeret som en mulig regulator af alkoholindtag [28, 71], blev reduceret i blodceller fra langtidsafholdende alkoholikere [72].

Sletning af Adcy8 blev tidligere vist at reducere alkoholdrikning og øge følsomheden over for dissedative virkninger af alkohol hos mus [73]. Derudover opregulerede kronisk alkoholeksponering hos rotter hjerneekspressionen af ​​opløst stofbærerfamilie 8 (natrium/calciumbytter), medlem 3 (NCX3), proteinet kodet af Scl8a3 [74, 75].

Alkoholforbrug hos rotter var også forbundet med reduceret hjernestammeekspression af Neto1[76], der koder for neuropilin tolloid-lignende 1 (NRP1), en komponent af NMDA-receptorkomplekset [77].

Dette protein er involveret i synaptisk reorganisering og transmission i hippocampus [78] og er påkrævet for rumlig læring og hukommelse [77].

Vores resultater viser således, at den blotte genfinding af alkoholminder, selv uden nogen farmakologiske virkninger af alkohol, påvirker ekspressionen af ​​disse gener. Deres specifikke rolle i rekonsolidering af alkoholhukommelsen og tilbagefald mangler dog at blive testet.

En begrænsning af denne undersøgelse er, at RNA-seq-assayet blev udført på bulk-mPFC- og DH-væv i stedet for på individuelle celler aktiveret ved hukommelseshentning. Specifikt har nyere undersøgelser antydet, at minder generelt [79, 80], og specifikt alkoholrelaterede erindringer [32, 81, 82], kodes via aktivering af neuronale ensembler sammensat af et lille antal neuroner, som kan identificeres via neuronalaktiveringsmarkører ( f.eks. cFOS) [80].

Faktisk blev lignende IEG (cFOS) aktiveringsmønstre ved genfinding af operant-konditioneret alkohol og søde belønningsminder fundet i mPFC og yderligere mesolimbiske regioner i rottehjernen [32, 81]. Det er således muligt, at udførelse af RNA-seq-assayet selektivt på neuronalensemblet aktiveret ved hukommelseshentning ville have givet mere nøjagtige resultater.

Sammenfattende tyder vores resultater på, at alkoholhukommelseshentning inducerer to parallelle transkriptionsprogrammer. Et program, der formidles via almindelige molekylære mekanismer for læring og hukommelse, inklusive IEG'erne Arc og Egr1, er involveret i konsolidering af minder generelt.

Det andet transkriptionsprogram, lanceret ved genfinding af alkoholhukommelse, styres af gener, der specifikt fremmer alkoholrelateret adfærd. Denne dobbeltbearbejdningsmodel for alkoholhukommelser rejser muligheden for, at hukommelsesrekonsolidering for forskellige hukommelser kan have lignende molekylære mekanismer med dobbelt bearbejdning, hvor nogle komponenter deles af flere hukommelser, og andre er unikke for hver hukommelsestype.

Denne hypotetiske model mangler at blive vurderet ved at teste, om manipulation af disse gener påvirker rekonsolidering af alkohol- og saccharosehukommelse forskelligt. Hvis det er tilfældet, vil det antyde, at det kan være muligt at sigte mod belønningsspecifikke molekylære mål for at behandle lidelser relateret til patogene minder, såsom afhængighed, snarere end at forstyrre store molekylære mekanismer, der er afgørende for mange funktioner ud over alkoholhukommelsesrekonsolidering.

MATERIALER OG METODER

Se Supplerende oplysninger for detaljer om apparatur, lægemidler og midler, oligodeoxynukleotid (ODN) design og forberedelse, westernblot og qRT-PCR analyser og RNA-seq bibliotek forberedelse.

Dyr

Han- og hun-C57BL/JRccHsd-mus (25-30 g), anbragt 3-4/bur, blev opdrættet på Tel-Aviv University Animal Facility (Israel) og holdt under en 12 timers lys-mørke-cyklus (lys tændt kl. 7). med mad og vand tilgængeligt adlibitum.

I eksperimenter med saccharose place-conditioning blev adgangen til mad begrænset i 6 timer før træningssessioner for at øge musenes motivation til at indsamle saccharose pellets. Denne korte varighed af madmangel er baseret på resultater af, at en 2-6 timers faste i dagtimerne ikke påvirker fodringsadfærden [83], og udløser ikke et signifikant skift i metaboliske markører [84], hvilket minimerer virkningerne af fødevarerestriktionen i sig selv. .

Mus blev vejet to gange om ugen for at kontrollere vægttabet. Alle eksperimentelle protokoller blev godkendt af og i overensstemmelse med retningslinjerne fra Institutional Animal Care and Use Committee of Tel Aviv University og NIH-retningslinjer (dyrevelfærdsforsikringsnummer A5010-01). Alle bestræbelser blev gjort for at minimere antallet af anvendte dyr.

Adfærdsmæssige procedurer

Plads konditionering

Alkohol-konditioneret sted præference (CPP): Alle mus blev vænnet til daglige ip saltvandsinjektioner i 3 dage.

Baseline-test (dag 1): På den første dag blev skydedøren trukket tilbage, og mus fik lov til frit at udforske hele apparatet i 30 min. Alkoholplacering (dage 2-9): Træning startede 24 timer efter baseline-testen med én session administreres dagligt over 8 dage, med lukket skydedør. På dag 3, 5, 7 og 9 modtog musene alkohol (1,8 g/kg, 20% v/v; ip) og blev straks indespærret til det parrede rum i 5 min.

Denne dosis og konditioneringsvarighed har tidligere vist sig at producere alkohol-induceret CPP [42, 85]. På de skiftende dage (dvs. dag 2, 4, 6 og 8) modtog musene en saltvandsopløsning og blev indespærret i det uparrede rum i samme varighed som på alkoholkonditioneringsdagen.

Parrede rum blev udlignet. Pladspræferencetest 1 (dag 10): Pladspræferencetest var som beskrevet for baseline-testen og tjente til at indeksere alkohol-CPP [41]. Præference blev defineret som en stigning i procentdelen af ​​tid brugt i det alkoholparrede rum under stedpræferencetest 1 sammenlignet med baselinetesten.

Hukommelseshentning (dag 11): Før dette trin blev musene tildelt forskellige eksperimentelle betingelser (matchet for CPP-score og køn). Under en hukommelseshentningssession blev musene begrænset til det alkoholparrede rum i 3 minutter og vendte derefter tilbage til deres hjemmebure. Kontrolmus blev håndteret kort. Pladspræferencetest 2 (dag 12): Musene blev udsat for en stedpræferencetest identisk med stedpræferencetest 1.

Saccharose CPP: Saccharose-fortræning (dage 1-6): På dag 1-3 blev musene vænnet til at indsamle 5-6 saccharosepellets (45 mg, Dustless PrecisionPellets, Bio-Serv, Frenchtown, NJ, USA) i hjemmebure . På dag 4-6 blev mus trænet til at samle 3 pellets i en tom plexiglaskasse i løbet af 30-minuttersessioner. Mus, der indsamlede færre end seks pellets (ud af i alt ni pellets i løbet af de 3 dage) under saccharosetræning blev udelukket fra eksperimentet (2 mus ud af 32).

Basislinjetest (dag 7): På den syvende dag blev skydedøren i et CPP-kammer trukket tilbage, og musene fik lov til at udforske hele apparatet i 30 minutter. En upartisk apparatur/uvildig tildelingstilgang, som beskrevet i alkohol-CPP-proceduren, blev også vedtaget her. Saccharose place-conditioning (dage 8-15): Træning startede 24 timer efter baseline testen med en session om dagen over 8 dage, med glidende dør lukket. På dag 9, 11, 13 og 15 blev mus anbragt i det parrede rum, og et minut senere blev tre saccharose-pellets spredt på gulvet.
Mus blev returneret til deres hjemmebure 15 minutter senere. På de alternative dage (dvs. dag 8, 10, 12 og 14) blev mus anbragt i det uparrede rum i 15 minutter uden interferens.

Parrede rum blev udlignet. Pladspræferencetest 1 (dag 16): Pladspræferencetestning var som beskrevet for baselinetesten og tjente til at indeksere saccharose-CPP. Præference blev defineret som en stigning i procentdelen af ​​tid brugt i det saccharoseparrede rum under stedpræferencetest 1 sammenlignet med baseline-testen. Hukommelseshentning (dage 17): Sucrosehukommelseshentningsproceduren var identisk med alkoholhukommelseshentningsproceduren (se ovenfor) ).

Oligodeoxynukleotid (ODN) validering

Arc antisense ODN (AS-ODN) og scrambled ODN (SCR-ODN) (Sigma-Aldrich, Rehovot, Israel) design fulgte retningslinjerne beskrevet tidligere [56, 86].

Arc AS-ODN funktionsvalidering. Arc AS-ODN (2 nmol/µl, 0,5 µl, 0,25 µl/min) blev infunderet i DH i én halvkugle, og SCR-ODN (2 nmol/µl, { {9}}.5 µl, 0.25 µl/min) blev infunderet i den anden halvkugle (siden var udlignet). To eller fire timer senere udforskede behandlede mus en ukendt kontekst (CPP-rum, se Apparatbeskrivelse ovenfor) i 5 minutter for at inducere nyhedsafhængig ARC-ekspression. Mus blev aflivet en time senere (dvs. 3 eller 5 timer efter ODN-infusion), hjernevæv blev opsamlet, og ARC-proteinniveauer blev vurderet ved Western blotanalyse (figur S4).

Kirurgi og intra-hippocampal mikroinfusion Kirurgi og mikroinfusioner blev udført som beskrevet tidligere[42, 87].

Kirurgi. Stereotaksiske operationer blev udført under isofluranæstesi. Mus blev placeret i en stereotaksisk ramme (RWD Life Science, Shenzhen, Kina), og bilaterale guidekanyler (C235G-2.6, 26G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) blev rettet mod DH kl. følgende koordinater (−2 mm posterior til bregma, ±1,3 mm mediolateral, −1,45 mm ventralt til kraniets overflade). Kanyler blev fastgjort med dental akryl. Matchende dummycannulae (Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA) blev indsat i guidekanylerne og toppet med støvkopper for at holde injektorstedet dækket og frit for snavs. Musene fik lov til at komme sig i 7-10 dage før alkohol-CPP-træning.

Intra-hipocampus infusioner. Actinomycin D (4 µg/µl, 0,5 µl pr. side,0,25 µl/min, i DMSO) [19] eller et tilsvarende volumen vehikel blev mikroinjiceret i DH umiddelbart efter hukommelseshentning . Infusion af actinomycin D i hippocampus ved en lignende koncentration viste sig at forstyrre hukommelsesrekonsolidering [19]. Arc AS-ODN eller kontrol SCR-ODN (2nmol/µl, 0,5 µl/side, 0,25 µl/min; i PBS) blev mikroinjiceret i DH 4 timer 2 timer før eller 4 timer efter hukommelsessøgning.

Efter fjernelse af støvkoppen og attrapkanylerne blev mikroinfusion udført i løbet af 2 minutter til vågent tilbageholdte mus ved hjælp af injektionskanyler (33 G; Plastics One Inc., Roanoke, VA, USA), der strækker sig 0,5 mm ud over guiden kanylespids. Injektionskanyler blev efterladt på plads i yderligere 2 min. Efter infusion blev dummy-kanyler indsat i styrekanylerne, sikret med støvkoppen, og dyrene vendte tilbage til deres hjemmebure. Kanylelokaliseringer blev verificeret i 30 μm tykke koronale sektioner af paraformaldehyd-fikseret væv farvet med cresylviolet.

Dataanalyse

Place preference was assessed as the percentage of time spent in the alcohol/sucrose-paired compartment, relative to the total test time. Mice that spent >75 % af tiden i et af rummene under Baseline-testen blev udelukket fra undersøgelsen (9 ud af 267). CPP-etablering blev bekræftet ved at sammenligne CPP-score mellem baseline- og CPP-test 1 og blev analyseret ved en parret t-test. Da udtrykket af CPP (dvs. hukommelsesdannelse) er påkrævet til hukommelseshentning, blev data fra mus, der ikke viste CPP (en minimumsstigning på 5 % i præference mellem baseline og test 1) udelukket fra eksperimentet (48 ud af 258).

Alkohol-CPP efter interferens med hukommelsesrekonsolidering blev analyseret af en blandet model ANOVA med en behandlingsfaktor mellem emner (Actinomycin D eller ODN) og en inden for forsøgspersoners faktor i test (CPP-test 1, CPP-test 2). Signifikante interaktioner blev analyseret ved aStudent-Newman-Keuls post hoc-test. Tæthederne af Western blotimmunoreaktivt ARC-proteinniveauer blev normaliseret til dem GAPDH og analyseret ved en envejs ANOVA med en behandlingsfaktor mellem emner, efterfulgt af Dunnetts post hoc-test. qRT-PCR mRNA-ekspressionsdata blev normaliseret til Gapdh og udtrykt som en procentdel af udtryk for en kontrolgruppe.

Data fra alle gener for hver hjerneregion blev analyseret ved en envejs ANOVA med en behandlingsfaktor mellem emner, efterfulgt af Dunnetts test for hvert gen, til sammenligning med data opnået fra en kontrolgruppe (ingen hentning). For RNA-seq. vi samlede væv fra 3 dyr for hver replikat og forberedte følgende antal replikater: 3 til dorsale hippocampus (DH) - ingen udtagning, 2 for DH-udtagning, 3 for den præfrontale cortex (PFC) - ingen udtagning og 2 for ( PFC)-hentning. Efter total RNA-isolering med Trizol blev sekventeringsbiblioteker genereret ved hjælp af den metode, vi udviklede [88].

Bibliotekerne blev udsat for 50 bp single-end sekventering med IlluminaHiseq 2000. Efter bekræftelse af kvaliteten af ​​sekventeringsdata ved FastQC, blev læsninger kortlagt til mm9 referencegenomet ved hjælp af Bowtie2 [89] og kommenteret med Tophat2 [90].

Læsninger kortlagt til gener blev kvantificeret af FeatureCounts [91]. Vi udelukkede Rn45s, Lars2, Rn4.5s, Cdk8, Zc3h7a og themitochondrial kromosom for at undgå tællinger af over-amplificerede gener, der kunne skævvække biblioteksnormalisering som tidligere beskrevet [92]. DESeq2 [58] blev brugt til at identificere differentielt udtrykte gener (DEG) i Retrievalgruppen sammenlignet med No Retrieval-kontrolgruppen med en signifikans-cutoff-justeret p-værdi (p(adj) < 0.05).

DATA TILGÆNGELIGHED RNA-seq-data er tilgængelige på NCBI Gene Expression Omnibus på https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi (GSE205586) med et anmeldertoken: knyfwwiorbutvuv.

REFERENCER

1. Collins PY, Patel V, Joestl SS, March D, Insel TR, Daar AS, et al. Store udfordringer for den globale mentale sundhed. Natur. 2011;475:27-30.

2. Heilig M, Egli M. Farmakologisk behandling af alkoholafhængighed: målsymptomer og målmekanismer. Pharmacol Therap. 2006;111:855-76.

3. Sinha R. Nye resultater om biologiske faktorer, der forudsiger sårbarhed for tilbagefald af afhængighed. Curr Psychiatry Rep. 2011;13:398.

4. Litt MD, Cooney NL, Morse P. Reaktivitet over for alkoholrelaterede stimuli i laboratoriet og i feltet: forudsigere for trang hos behandlede alkoholikere. Afhængighed.2000;95:889–900.

5. Barak S, Liu F, Ben Hamida S, Yowell QV, Neasta J, Kharazia V, et al. Afbrydelse af alkoholrelaterede minder ved mTORC1-hæmning forhindrer tilbagefald. Nat Neurosci.2013;16:1111–7.
6. Milton AL. Drik, stoffer og forstyrrelser: hukommelsesmanipulation til behandling af afhængighed. Curr Opin Neurobiol. 2013;23:706–12.

7. Nader K, Hardt O. En enkelt standard for hukommelse: sagen om rekonsolidering. NatRev Neurosci. 2009;10:224-34.

8. Dudai Y. Rekonsolidering: fordelen ved at blive refokuseret. Curr Opin Neurobiol. 2006;16:174-8.

9. Przybyslawski J, Sara SJ. Genkonsolidering af hukommelse efter genaktivering. Behav.Brain Res. 1997;84:241-6.

10. Nader K, Schafe GE, Le Doux JE. Frygterindringer kræver proteinsyntese i theamygdala for rekonsolidering efter genfinding. Natur. 2000;406:722-6.

For more information:1950477648nn@gmail.com