Fremskridt i molekylær identifikation af Cistanche

Abstrakt:CistancherHerba, et sjældent og værdifuldt medicinsk materiale i Kina, har høj medicinsk værdi og økologisk værdi. Midt i udviklingen af ​​molekylærbiologiske teknikker er en række DNA-baserede molekylære identifikationsteknikker gradvist blevet forbedret, og der er gjort store fremskridt i forskningen iCistancherHerba. Dette papir gennemgår de DNA-baserede molekylære identifikationsteknikker forCistancheog diskuterer begrænsningerne og anvendelsesmulighederne, som forventes at tjene som reference for nøjagtig identifikation og kvalitetsevaluering af Cistanches Herba, beskyttelse og rationel udnyttelse af ressourcerne og mangfoldighed af avl.

Nøgleord:Cistanche; molekylær identifikation; molekylær markørteknik; identifikation og kvalitet; ressourcebevarelse

Klik her for at få flere detaljer om komponenterne i Cistanche

Cistanche er den tørre skælbladede kødfulde stilk af Cistanche deserticola YC Ma ogCistanche tubulosa(Schenk) Wight, en plante af slægtenCistanchei familien Cistanche. Jiangyun, Cunyun, Cistanche og Chagangaoya (mongolsk sprog) er kendt som "ørkenginseng" [2]. I de senere år, da de vilde Cistanches ressourcer er på randen af ​​udtømning, og den indenlandske efterspørgsel stiger dag for dag, er et stort antal forfalskede produkter fra Cistanche strømmet ind på markedet for kinesisk urtemedicin, hvilket har forårsaget enorme udsving i markedspriserne , og kvaliteten af ​​medicinske materialer kan ikke garanteres, hvilket bringer sikkerheden ved klinisk medicin i alvorlig fare. køn [3]. Derfor er bevarelse, forskning og rationel udvikling og udnyttelse af Cistanche-plantekimplasmassourcerne nært forestående, og den nøjagtige identifikation af Cistanche-plantekimplasmassourcerne er særlig vigtig.

lige så vigtigt. 2020-udgaven af ​​"Pharmacopoeia of the People's Republic of China" (i det følgende benævnt "kinesisk farmakopé") registrerer kun, at de tørrede skællende kødfulde stængler af Cistanche deserticola bruges som ægte lægemidler. Set fra situationens perspektiv er der ud over planterne Cistanche og Cistanche tubehua optaget i 2020-udgaven af ​​"Chinese Pharmacopoeia", også Cistanche sinensis G. Beck, C. salsa (CA Mey.) G. Beck, Lanzhou Cistanche C. lanzhouensis ZY Zhang, etc. [4], er der også et stort antal af forfalskede doping fænomen. Med udviklingen og kontinuerlig forbedring af molekylærbiologisk teknologi har molekylær identifikationsteknologi fordelene ved mindre prøveforbrug, høj hastighed og høj nøjagtighed og er blevet meget brugt i artsidentifikation af dyr og planter. Udviklingen af ​​ressourcemineforskning går også relativt hurtigt [5]. På nuværende tidspunkt er der sket nogle fremskridt i identifikation af Cistanche-medicinske materialer ved hjælp af molekylær identifikationsteknologi. I henhold til klassificeringen af ​​molekylær markørteknologi, der kræves til molekylær identifikation [6], gennemgår dette papir kimplasma-identifikationen af ​​Cistanche deserticola og andre aspekter, og diskuterer eksistensen af ​​kimplasma-identifikation af Cistanche deserticola. Analyser problemerne og fremsæt tilsvarende løsninger med det formål at give reference til beskyttelse, rationel udnyttelse og dyrkning af nye sorter af Cistanche-planter.

1 Anvendelse af DNA-stregkodningsteknologi til identifikation af Cistanche-planter

1.1 DNA-stregkodningsteknologi

I 2003 introducerede professor Paul Hebert fra University of Guelph i Canada stregkodeteknologi i den biologiske verden og foreslog først konceptet "DNA-stregkode" [7]. DNA-stregkodeteknologi er en effektiv metode til at identificere traditionel kinesisk medicin og multi-baserede råvarer. For det respektive DNA blev kandidatfragmenterne amplificeret ved den generelle primerpolymerasekædereaktion (PCR), PCR-amplifikationsprodukterne blev oprenset, sekventeret og analyseret, mål-DNA-stregkodesekvensen blev søgt, og et DNA-stregkodegenkendelsessystem blev konstrueret [8 ]. Afslutningsvis er DNA-stregkodeidentifikation en biomolekylær identifikationsmetode, der anvender et eller få relativt korte standard-DNA-fragmenter til artsidentifikation [9].

I de senere år er der gennem kombinationen af ​​high-throughput sekventeringsteknologi og DNA-stregkodeidentifikationsteknologi udviklet en ny teknologi, der kan detektere stregkodesekvenser af flere arter i blandede prøver på samme tid——DNA-metabarcode, hvis grundprincip er at anvende high-throughput sekventering Teknologien opnår den amplificerede sekvens af den blandede stregkode og identificerer artssammensætningen i den blandede prøve ved hjælp af bioinformatik analyse[10].

1.2 Udvælgelse af DNA-stregkodesekvenser

De stregkodesekvenser, der kan bruges i DNA-stregkodningsteknologi, omfatter mitokondrielt coenzym Ⅰ (CO Ⅰ) DNA, 12S rRNA, 16S rRNA sekvenser og ribosomalt 18S rDNA til identifikation af dyrearter[11]; ribosomalt 16S rDNA til bakteriel identifikation[12] ], ribosomale interne transskriberede spacer (ITS) genspecifikke fragmenter og CO I-sekvenser til svampeidentifikation[13]; på grund af den langsomme udviklingshastighed af mitokondrielle genomer i planter selekteres stregkodefragmenter hovedsageligt på kloroplastgenomet. De foreslåede genfragmenter omfatter hovedsageligt rpoB, rpoC1, matK, rbcL og UPA, og de ikke-kodende regionsfragmenter inkluderer atpF-atpH, trnH-psbA, psbK-psbI og

Nukleeret gen ITS[14]. I 2006 testede Chen Shilins forskergruppe ITS2's evne til at skelne på mere end 6.600 planteprøver og fandt ud af, at identifikationseffektiviteten af ​​ITS2 på artsniveau var så høj som 92,7 procent, hvilket indikerer, at ITS2-sekvensen kan identificere standard DNA-stregkoder for lægeplanter og nært beslægtede arter. ITS2 blev brugt som en ny type universel DNA-stregkode for lægeplanter [15] og blev anerkendt af internationale peer-eksperter [16].

I 2013 diskuterede og godkendte National Pharmacopoeia Committee optagelsen af ​​retningslinjerne for molekylær identifikation af DNA-stregkoder for kinesiske medicinske materialer i den supplerende udgave af "Chinese Pharmacopoeia". ITS2 er det centrale DNA-stregkodeidentifikationssystem for plantemedicinske materialer [17].

På nuværende tidspunkt har mange forskere udført molekylær identifikationsforskning på Cistanche-planter. Ifølge forskning af Chen Shilin et al. [18], ITS2 er velegnet som en standard stregkodesekvens til identifikation af lægeplanter. Sun Zhiying et al [19] fandt ud af, at ITS2-sekvensen kan bruges som grundlag for effektivt at identificere den kinesiske urtemedicin Cistanche deserticola og dens forfalskede produkter i DNA-stregkoder. Wang Xiaoyue et al[20] brugte ITS2-stregkoder til at identificere 4 almindelige slørede produkter af Cynomorium, Cistanche, Liedang og Cistanche, og etablerede med succes det "molekylære identitetskort" for Cistanches slørede produkter. Metoden til at identificere lægeplanter gennem ITS2-sekvenser er relativt moden og har fordelene ved hurtighed, nøjagtighed og effektivitet. Derfor er brugen af ​​ITS2-sekvensen til at identificere Cistanche-planter blevet den mest almindeligt anvendte metode.

1.3 Workflow af DNA-stregkodning

Arbejdsgangen for DNA-stregkodning ligner driften af ​​molekylær fylogenetisk forskning, og hovedtrinene er vist i figur 1. Gu Xiuyan [21] opnåede basesekvensen for ITS og analyserede forskellene mellem arter og fandt ud af, at Cistanche er nært beslægtet til Cistanche saltvand, og Cistanche i Lanzhou er nært beslægtet med Cistanche, hvilket også giver grundlag for udviklingen af ​​nye lægemiddelkilder til Cistanche. basis. Li Zhenhua et al[22] udførte DNA-molekylær identifikationsforskning på Cynomorium, Cistanche og Huanghua Liedang og realiserede hurtig og nøjagtig identifikation af Cistanche og forfalskede Cynomorium, Cistanche og Huanghualiedang ved stedspecifik PCR.

Kort sagt er der allerede en forholdsvis komplet proces til at identificere plantearter ved hjælp af DNA-stregkoder. Identifikation af Cistanche-planter ved at analysere DNA-sekvenser og etablering af en relateret database kan give et mere grundlag for identifikation og klassificering af Cistanche-planter i fremtiden.

1.4 Dataanalyse af DNA-stregkodning

Behandling og analyse af de opnåede data er en meget vigtig opgave[18]. Efter at sekventeringen er afsluttet, udføres sekvenssammenligning og manuel korrektion for at fjerne sekvenser og primerregioner af lav kvalitet. Almindeligt brugt software inkluderer Chromas, CExpress[23] osv.; Den genetiske afstandsanalyse af den endelige sekvens udføres generelt af MEGA-software [24] for at analysere den genetiske afstand mellem prøver af forskellige plantearter, og K2P-modellen [25-26] bruges til at beregne den intraspecifikke afstand mellem arter ; konstruer derefter det naboforbundne (NJ) fylogenitræ ved at bruge iTol online-webstedet [27] til at forbedre og forskønne udviklingstræet (https://itol.embl.de/), og kontroller støttehastigheden for hver gren iht. bootstrap (1000 gentagelser).

BLAST-metoden er en søgealgoritme baseret på BLAST. Det er nødvendigt at etablere eller downloade en referencesekvensdatabase til artsidentifikation på GenBank-databasen (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) til efterfølgende analyse af genfragmenter og artsidentifikationsarbejde [28]. Xu Danyun et al[29] brugte 3 par DNA-stregkode universelle primere til at identificere 22 arter af Lauraceae-planter og identificerede med succes 20 plantearter. Adolfo et al[30] identificerede med succes 3 arter af Pueraria-planter ved hjælp af ITS2 og matK stregkoder. Ovenstående undersøgelser viser, at ved at opnå og analysere lægeplanters DNA-sekvenser kan plantearter hurtigt og effektivt identificeres.

2 Anvendelse af andre molekylære markørteknikker til identifikation af Cistanche-planter

For organismer er deres egenskaber over det molekylære niveau i sidste ende bestemt af molekylære egenskaber. Sammenlignet med morfologisk analyse [31] og kromosomanalyse [32], kan molekylære markører afsløre det sande ansigt af biologisk genetisk diversitet. Sarwat et al[33] brugte amplificeret fragmentlængdepolymorfi (AFLP), selektivt amplificeret polymorf mikrosatellit locus-teknologi (SAMPL), simpel intersekvensamplifikation af gentagelser (ISSR), tilfældig amplificeret polymorf DNA (RAPD) og andre molekylære markørteknikker detekterede den genetiske diversitet af Tribulus terrestris-prøver indsamlet fra forskellige steder i Indien, og resultaterne viste, at disse fire molekylære markørteknikker kan opnå forskellige DNA-fingeraftryk, der er unikke for hver geografisk region. Den Internationale Union for Beskyttelse af Plantesortsrettigheder (UPOV) bruger også DNA-molekylær markøridentifikation som et hjælpemiddel til DUS-testning (distinctness uniformity and stability) af afgrødesorter [34]. På nuværende tidspunkt er molekylære markørteknologier såsom AFLP, RAPD og ISSR relativt modne og udbredt til identifikation af Cistanche-planter (tabel 1).

Support:

wallence.suen@wecistanche.com 0015292862950